Summary
Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.
Abstract
Birkaç yıl önce, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) kurulması biyomedikal yeni bir dönem başlatmıştır. Insan iPSCs potansiyel kullanımları, insan genetik hastalıklarının modellenmesi patogenezi, gen düzeltme sonrası otolog hücre tedavisi ve hastaya özgü ve belirti gerekli hücrelerin bir kaynağı sağlayarak kişiselleştirilmiş ilaç tarama içerir. Ancak, bu tür bir insan iPSCs üretim sonrası kalan yeniden programlama faktörü transgen ekspresyonunu ortadan kaldırarak üstesinden gelmek için çok engel vardır. Daha da önemlisi, farklılaşmamış insan iPSCs kalıntı transgen ifadesi doğru farklılaşmaları engel ve hastalıktan ilgili vitro fenotiplerinde yorumunu şaşırtıp-saptırırlar olabilir. Bu neden ile, entegrasyon içermeyen ve / veya transgen içermeyen insan iPSCs adenovirüs, piggyBac sistemi minicircle vektör epizomal vektörler, direkt protein temini gibi çeşitli yöntemler kullanılarak geliştirilmiş ve mRNA sentezlenmiştir. Bununla birlikte, reprogra etkinliğientegrasyon-ücretsiz yöntemlerle features çoğu durumda oldukça düşüktür.
Burada, Sendai-virüsü (RNA virüsü) tabanlı yeniden programlama sistemi kullanarak insan iPSCs izole etmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, yeniden programlama tutarlı sonuçlar ve düşük maliyetli bir şekilde yüksek bir verimlilik göstermektedir.
Introduction
İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) ilaç taraması için, hastalık modelleme için potansiyel olarak yararlı olabilir ve hastalık ve doku yaralanmaları tedavi etmek için hücre tabanlı tedaviler geliştirmek için kendini yenilemek in vitro ve sahip pluripotensin bir kapasiteye sahip. Ancak, HESC çünkü, immünolojik onkolojik ve etik engellerin hücre replasman tedavisi için bir sınırlama var, ve hastalık ile ilgili genlerin çalışma, hastalığa özgü HESC pre-implantasyon genetik tanı (PGD) yaklaşımları ile izole edilebilir, ama yine de teknik açıdan zor ve embriyo bağışlar oldukça nadirdir. Bu sorunlar, uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) gelişmesine yol açmıştır kök hücre biyolojisi, ilerleme ile ilgilidir.
İnsan iPSCs genetik yetişkin insan somatik hücrelerinden yeniden programlanan ve onları böyle d gibi rejeneratif tıp için yararlı bir kaynak yapar HESC benzer pluripotent kök hücre benzeri özellikler, liman vardırhalı keşif, hastalık modelleme ve hastaya özgü şekilde 1,2 hücre tedavisi.
Bugüne kadar, virüs aracılı (retrovirüs ve adenovirüs) dahil olmak üzere insan iPSCs oluşturmak için çeşitli yöntemler, 3, non-virüs aracılı (BAC sistemi ve vektörler transfeksiyon) 4 gen transdüksiyon ve protein dağıtım sistemi 5-7 vardır.
Virüs-aracılı gen iletim verimliliği belirli bir düzeyde olmak, ancak bunlar, kontrolsüz bir şekilde yeniden programlama genleri ifade etmek için bir ev sahibi kromozomları içine entegre, çünkü viral vektörler, genetik iz bırakabilir. Transkripsiyon faktörlerinin viral entegrasyonu etkinleştirmek veya konak genleri 8 inaktive olabilir bile, bu beklenmedik bir genetik sapma ve tümörgenez 5,9 riskini neden olabilir. Öte yandan, somatik hücrelere protein veya RNA doğrudan katılması bildirilmiştir, ancak bu emek-yoğun, tekrarlı transf gibi bazı dezavantajları vardır edildiection ve 7,10 yeniden programlama düşük seviyesi. Hatta epizomal olmayan entegre adenovirüs, adeno-bağlantılı virüs, ve plasmid vektörler yine 11 göreli olarak daha az verimlidir. Bu nedenlerden dolayı, iPSC nesil yüksek etkinlik ve daha az genetik anormallikler olmayan entegrasyon yeniden programlama yöntemlerini seçmek için makul. Bu çalışmada, bir-Sendai virüs esasına dayalı yeniden programlama kullanın. Bu yöntem, konakçı genomuna entegre olmayan ve tutarlı bir şekilde, transgen entegrasyon olmadan insan iPSCs üreten olduğu bilinmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Hücre hazırlanması ve Ortam (Gün 1)
- Kültür ve DMEM ortamı,% 10 FBS ihtiva eden insan fibroblast genişletmek.
- Plaka insanlara özgü fibroblastlar; transdüksiyon bir gün önce oyuk başına uygun bir yoğunlukta bir 24-yuvalı plaka üzerine (Şekil 1).
NOT: farklı hücre tipleri farklı bağlanma yeteneği var çünkü şu seri seyreltme (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K ve 6.25K) önerilir. - Hücreler tamamen yapışmış ve genişletmiştir sağlanması, bir 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde bir gün için hücreler inkübe edin.
2.. İletimi yapın (2. Gün)
- Transdüksiyon gününde, hücre yoğunluğunu kontrol etmek ve en etkin yoğunluğu kuyu (Şekil 2) seçtik. Yüksek (80 ~% 90), orta (50 ~% 70) ve düşük (20 ~ 40%): Bu üç farklı yoğunlukları almak daha iyidir.
- En az 1 saat önce transdüksiyon, fibrobl aspireast hücrelerden ortam ve fibroblast ortamın yeni bir 300 ul değiştirin.
- -80 ° C depolama 4 farklı Sendai virüs tüplerin bir set çıkarın. Birkaç saniye için bir 37 ° C su banyosu içinde, aynı zamanda, her tüp çözülme ve sonra su banyosundan tüpleri alır. Daha sonra, oda sıcaklığına kadar bunları çözülme; santrifüj 10 saniye boyunca 6.000 xg'de tüpler ve kullanıma kadar buz koyun. -Donma yeniden ve titreleri korumak değil çünkü virüs cozundurmeden.
- Mikro santrifüj tüpüne dört Sendai virüsü boruların (Ekim-4, Klf-4, c-Myc ve Sox-2) her birinin, belirtilen miktarlar ekleyin. Çözelti hafifçe pipetleme iyice karıştırılır olduğundan emin olun.
Örneğin, transdüksiyon için 24 oyuklu plaka içinde LOOKWELL 50K hücre / bir de:
(Life Technologies Analiz Sertifikalarını dayalı Titer, partiden diğer partiye farklı olabilir)
Tüp hOct-4 = 6.0 x 10 7 UKÜ, 3 İçişleri Bakanlığı 5 ul =
Tüp hSox-2 = 6.5 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4.6 μ; L
Tüp hKlf-4 = 6.3 x 10 7 UKÜ, 3 İB = 4.8 ul
Tüp hc-Myc'nin = 7.8 x 10 7 UKÜ, 3 İB = 3.8 ul
Toplam = 24 oyuklu plakanın dört virüs faktör karışımı / bir de (50K hücreleri) 18.2 ul - Hücre yoğunluklarına göre; 2X, 1X ve kuyunun içine virüs karışımı 0.5x hacim eklemek. Yavaşça, plaka önden arkaya sallayın sol ve sağ (2X: virüs karışımı, 1X 36.4 ul: 18.2 ul ve 0.5x: 9.1 ul).
- 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe hücreleri koyun ve bir gece boyunca inkübe edilir.
3.. Kültür Orta Değiştirme (Gün 3 & Day 5)
- 24 saat transdüksiyon sonra, 500 ul taze fibroblast ortam ile orta yerine.
- 5. günde, taze fibroblast medya ile Orta değiştirin.
4.. Co-kültür için MEF Yemekleri hazırlayın (Gün 8)
- % 10 ile 60 mm kültür tabaklarında MEF hücreleri hazırla FBS DMEM ortamı bir da ihtivaMEF besleyici-hücreleri üzerine transdüse fibroblast pasaj önce y.
Not: Her 60 mm çanak MEF 5 x 10 5 kullanıyorsunuz.
5.. Başlangıç Co-kültür MEF besleyici hücreler (Gün 9) ile Hücreleri kalıt
- Transduced hücreleri kaplama önce, aspirat% 10 FBS MEF besleyici yemekler DMEM ortamı bulunan ve FBS DMEM ortamı ihtiva eden taze% 10 ekleyin.
- 24 oyuklu bir plaka içerisinde olan ve D-PBS ile bir kez yıkama hücreleri transduse fibroblastlardan orta çıkarın. 24-çukurlu plaka inthe fibroblast hücreler içine% 0.25 tripsin / EDTA, 200 ul ekleyin. Hücreler plakadan kopmaya başladığından zaman tripsin / EDTA, birlikte en az 5 dakika inkübasyondan sonra, 15 ml konik bir tüp içinde büyüme ortamı ile hücreleri toplamak. Daha sonra 4 dakika boyunca 6,000 x g de santrifüj.
NOT: 2X, 1X ve 0.5X virüs Havuzlanması transdük fibroblast tavsiye edilir. - Süpernatan Ortamı çıkarın ve yeniden askıya yıkamatripsin ile nötrleştirme için taze ortam fibroblast 4-5 ml hücre topağı. Daha sonra 4 dakika boyunca 135 x g'de santrifüj.
- Örneğin 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 ve 1/128 60 sayısı: seri seyreltme yoğunluğu olarak ve MEF üzerine fibroblast ortam ile birlikte kültür için başlangıç Plaka hücreleri mm çanak. Transdüksiyon ilk haftasında hücre ölüm oranı ile ilgili olarak, bir 1/2 veya 1/128 yoğunluğa seyreltilmesi gerekmeyebilir. Transgen RT-PCR için bir pozitif kontrol olarak, toplam RNA çıkarmak için bir kenara kalan hücrelerin koyun.
- % 5 CO2 inkübatör gece boyunca, 37 ° C'de 60 mm yemekler yerleştirin.
6.. İnsan Embriyonik Kök Hücre Orta Yem ve Hücreleri (Gün 10) Monitör
- Ertesi gün, 10 uM Y-27632, insan ES ortama fibroblast ortamı değiştirmek. Bundan sonra, insan ES ortamı ile günlük orta değiştirin: 800 ml DMEM/F12 + 200 mi Knockout Serum Replacement + 10 ml L-glutamin, 10 mM + 10 minimum MEM esansiyel olmayan amino asitler miTemel Fibroblast Büyüme Faktörü 2-mersaptoetanol + 10 ng / ml + 1 ml.
- Taze insan ES medya ile bir günlük medya değişiklik yapmak. Bir hafta sonra, koloni ES-benzeri hücre kümeleri oluşumu için bir mikroskop altında bir kez toplam 2 ~ 3 gün bulaşıkları kontrol edin. Koloniler bulundu önce hücre tipine bağlı olarak, kültür daha çok veya daha az zaman alacaktır.
7. Uyarılmış pluripotent hücre kolonileri Kök ve Hücreleri genişletin Toplama (Gün 20 ~)
- Üç hafta sonra, transdüksiyon, koloni toplama için uygun yetiştirilen görünmelidir.
- Koloni toplama bir gün önce, 24 oyuklu bir plaka içerisinde MEF besleyici hazırlar.
NOT: Biz bir 24-plaka içinde MEF 12.5 x 10 5 kullanıyorsanız. - Ertesi gün, 10 uM Y-27632, insan ES ortama fibroblast ortamından MEF yemekler orta değiştirin. Elle toplama başlığı içinde mikroskop altında her zaman bir koloni almak ve pipetleme küçük kümeleri yapmak ve bunları aktarmakyeni birçok klon almak için MEF dishes.Try hazırlanan üzerine.
- Geçidi ve başlangıçta bir 6 yuvalı plakaya bir 24-çukurlu plaka her bir genişletme. Daha sonra, 6-çukurlu plaka yayılımıyla önce, 60 mm tabaklar için.
(10 geçiş sonrası) İnsan iPSCs 8. Karakterizasyonu
- İmmünofloresan
- Günde ortam değişikliği ile 4-5 gün boyunca 24 oyuklu plaka ve kültür Plate insan iPSCs.
- Imüno-flüoresan deneyi çalıştırmak için, bir kere D-PBS ile plakayı yıkayın. Daha sonra 30 dakika boyunca% 0.4 paraformaldehid içinde hemen hücreleri gidermek. Daha sonra 5 dakika süre ile D-PBS içinde üç kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 çözeltisi ile işlem görmüş hücrelerin tedavi.
- Permeablization çözeltisi (% 0.1 triton X-100 çözeltisi) aspire, daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.5 BSA bloke çözeltisi ilave edilir.
- Nanog'un, Ekim-4, SSEA (evre özgü embriyonik ANTIG bir algılama gerçekleştirinen) ve TRA-1-81,% 0.5 BSA çözeltisi içinde bir anti-insan antikoru kullanılarak (tümör rejeksiyon antijen) (antikor seyreltme oranı için malzeme tablosunu kontrol edin). Oda sıcaklığında 2 saat için primer antikor inkübe edin. Daha sonra 5 dakika her biri için D-PBS içinde üç kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında% 0.5 BSA çözeltisi içinde 1:2,000 seyreltilmiştir 2. antikor olarak Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG antikorları ile inkübasyondan 1 saat sonra floresan mikroskobu kullanılarak kontrol edin. DAPI ile her bir besleyici hücreleri ve MEF hiPSCs tüm çekirdek Leke.
- Transgen Teyit RT-PCR
- RNA ekstraksiyon reaktifleri kullanılarak hücre pelletinden toplam mRNA ekstrakte edin.
- Ters transkriptaz ile PCR amplifikasyonu için toplam RNA ve elde edilen cDNA alikotları üzerinde bir ters transkripsiyon (1 ug) yapın.
- CDNA şablon 2 ul, 2x PCR Master Mix 10 ul, primerler 2 pmol 2 ul içeren PCR karışımları hazırlamak(Ileri: 1 ul ve ters: 1 ul) ve DW 6 ul. Tablo 1 'de sıralanan primerler ile RT-PCR yapmak, gen ekspresyonunu tespit etmek için.
- Amplifikasyon reaksiyonları verimliliği için bir kontrol olarak, GAPDH geni ile RT-PCR'ler gerçekleştirin. Görselleştirme ve% 1 agaroz jel elektroforezi ile analiz PCR ürünü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genellikle enfekte fibroblastlar Sendai virüs iletiminde sonra birkaç gün içinde herhangi bir morfolojik değişiklik görünmüyor, ancak beş gün sonra, farklı şekiller (Şekil 1) sahip başlar. Şekil 1, bir sağ panelde tarif edildiği gibi, hücreler, daha fazla tipik fibroblast morfolojiye sahip değildir. Bunlar sitoplazmada daha yuvarlak bir şekil ve büyük çekirdeği vardır. Transdüksiyon% 80 hücresel confluency gerçekleştirildiğinde bile onlar yeniden programlamak başladıktan sonra onlar kuyuda az kaynaşmalarına gibi görünüyor. Morfolojik değişiklikler bu tür kuyunun çoğunda görülen başlarsanız, transdüksiyona fibroblastlar MEF besleyici kültür yemekleri kaplama hazırdır.
Bizim protokol, hücre kültürü ölçeği küçültülmüş ve aynı zamanda hiPSCs üretim verimliliğini artıracak gibi farklı fibroblast hücre yoğunluğu ve virüs titresi istihdam gibi çeşitli yeniden programlama olanakları, ve sonraki birkaç re-kaplama oranı MEF, (verdi MEF besleyiciler üzerinde yeniden programlamanın başında, dönüştürülmüş hücre tiplerini ayırt etmek zordur, ancak ko-kültür üzerinden bir hafta sonra, kısmen yeniden programlanması fibroblastlar görünür ve gevşeyen ES-şekil gibi (Şekil 3) benziyor. Çünkü insan iPSC koloniler yeni MEF besleyici yemeğin içine geçiş için hazır Bu nedenle, elle toplama enzim ile transferi yerine ayrışma için daha etkili bir yoldur. Şekil 3 ve Şekil 4'te, mikroskop altında tek insan iPSCs ('tamamen yeniden programlanan hücreler' olarak da kabul edilir) insan iPSCs ve morfolojisi tarafından 'eksik yeniden programlanması hücreler' arasında net bir ayrım yapmak net kenarları var. Tamamen yeniden programlanan hücreler loTamam, kompakt ve sıkı paketlenmiş gibi. Kısmen yeniden programlanan hücreler koloni yapmak için bir araya toplama gibi görünüyorsun ama çok kaybetmek ve yıkmak için kırılgan ise özellikle koloniler, net bir sınır var. Biz yavaşça bir pipetlenmesini yapmak bile kolayca ayrılır. Hatta (onları ve pasajlanmasını genişleyen sırasında), kısmen Yeniden programlanan insan iPSCs kolonileri hariç sonra, tamamen yeniden programlanan insan iPSCs elle toplama tarafından muhafaza edilmesi gerekir. Koloni toplama ve birkaç hafta içinde hiPSC klonları genişleyen sonra stemness markerlerinin ifadesi tespit edilmesi gerekmektedir. HiPSC klon genişlemesinden sonra, biz bir kalite kontrol gibi (veriler gösterilmemiştir) antikor boyama (SSEA4, Ekim-4, TRA-81 ve Nanog'un) ve pluripotent marker RT-PCR dahil testlerin farklı setleri, onları doğrulamak. H9 ile karşılaştırıldığında, iki farklı hiPSCs SSEA4, Ekim-4, TRA-81 ve Nanog için olumludur. Bu sonuç, izole edilmiş insan iPSCs pluripotent kalitesini (kazanılmış olduğunu gösterir Son olarak, Şekil 6, RT-PCR ile hiPSC klon herhangi bir transgen ekspresyonunu tespit edilemez olduğunu göstermektedir. Için en az 10 üzerinde pasaj hiPSCs, özel primerler (Tablo 1) dış Ekim-4, Sox-2, Klf-4 ve c-Myc: Güçlü transgen ekspresyon düzeyi ile pozitif kontrol örnekleri ile birlikte kullanılabilir. Transgen onay için Tablo 1 '. RT-PCR primerleri. Bunlar tra için kullanılan astar dizileri,nsgene onay. T m, tüm primer setleri 50,6 ° C'dir. 
Şekil 1.. Morfolojik değişim Sendai virüs transdüksiyon sonra. Transdüksiyon önce, fibroblastlar tipik iğ gibi şekil (solda) göstermektedir. Yaklaşık sekiz gün transdüksiyon sonra, çok daha yuvarlak bir şekil (sağ) gibi Transdüksiyona hücre değişim morfolojisi. h tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için ere. 
Maksimum verim sağlamak için indüksiyon planı 2.. Diyagramı Şekil. Dört üzerinde farklı hücre tipleri (1-4), 24 oyuklu bir plaka içerisinde kaplama olabilir. Bunların bağlanma yeteneği ve hücre hayatta kalma, hücre tipine bağlı olarak farklı olabilir için, (her 200K 6.25K için hücrelerinden) farklı hücre yoğunluğu plaka için önerilmektedir. Buna ek olarak, virüs konsantrasyonu (0.5X, 1X ve 2X) ayarlanabilir. 
Transdüksiyonlu f insan uyarılmış pluripotent kök hücre koloni Şekil 3. Formasyonuibroblast. MEF'ler bunları yeniden kaplama sonra yaklaşık iki hafta içinde, yuvarlak koloniler görünmelidir ve insan embriyonik kök hücre kolonileri gibi görünüyorsun. Normalde tamamen yeniden programlanması insan iPSC koloniler çok net sınırları var. (Ok: tamamen insan iPSC koloniler, ok ucu yeniden programlanması: kısmen yeniden programlanması insan iPSCs). resmi büyütmek için buraya tıklayın . 
Şekil 4. Insan uyarılmış pluripotent kök hücre kolonileri toplarken. İnsan iPSC koloniler genellikle kısmen yeniden programlanan hücreler (solda) ile çevrilidir. Mikroskop altında, ES-benzeri koloni toplama sadece, küçük öbekler halinde yıkmak ve daha sonra transfer (sağ). 2-3 geçiş sonrası, farklılaşmamış hiPSC koloniler (alt ve sol) vardır. (Ok: Tamamen yeniden programlanması insan iPSC koloniler, ok ucu: kısmen yeniden programlanması insan iPSCs) büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın . 
Pluripotent kök hücre belirteçleri ile Şekil 5. Immünofloresan boyaması. İmmünofloresan analiz insan iPSCs stemness features.SSEA-4, TRA-81, Nanog, Ekim-4as pluripotent belirteçler ve DAPI nukleus boyama için bir kontrol olduğunu olduğunu gösterir. (A) H9 lekeleme temsil Bir kontrol numunesi. (B) ve (C) insan iPSC klonlar olarak göstermektedir.et = "_blank"> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. 
Transgen ekspresyon seviyesinin Şekil 6.. Onay. En azından insan iPSCs ekzojen Sox2 of susturma, Klf-4, c-Myc ve Oct-4 gen ekspresyon düzeylerinin 10 geçiş kültürden sonra, ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonları ile teyit edilir. hGAPDH bir iç denetimdir. Bir pozitif kontrol, RNA kalan kalıt fibroblastlar (Sendai virüs enfeksiyonundan sonra gün 7) elde edilir. (Şerit 1: Marker, kuşak 2-6: GAPDH, Klf4, c-Myc, Ekim-4 ve pozitif kontrol olarak Sox-2, kulvarlar 7-11: GAPDH, Klf4, c-Myc, Ekim-4 ve Sox -2 hiPSCs in). Primer adı <td> Dizi hOCT4 (F) CCC GAA AGA GAA GAA AGC CCA G hOCT4 (R) AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA hMYC (F) TAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G hMYC (R) TCC ACA TAC AGT SKK GGA TGA TGA TG hSOX2 (F) ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G hSOX2 (R) ATG CGC TGG TTC ACG CCC JGK CCC AGG hKLF4 (F) ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G hKLF4 (R) CGC GCT GGC AGG GCC GCT GCT CGA C hGAPDH (F) AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG hGAPDH (R) GTG ATG GKRY TGG ACT GTG GT
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HiPSCs insan somatik hücreleri yeniden programlama temel biyoloji, kişisel tıp ve transplantasyon 12 görülmemiş sözleri tutar. Daha önce, insan iPSC nesiller gibi ilaç geliştirme ve nakli tedavileri 13 gibi diğer klinik uygulamaları sınırlandıran istenmeyen genetik mutasyonlar oluşturabilir konakçı genomu içine entegrasyon riski DNA virüsü gereklidir. Bu nedenle birlikte, birçok çalışmada çeşitli alternatif yöntemlerle vektör ve transgen-free sistemi, insan iPSCs oluşturmak için rapor edilmiştir, ama aynı zamanda, 'ücretsiz ayak-izi' izole verimliliği insan iPSCs düşünülmelidir. Henüz sendai virüs aracılı iPSC nesil 'genomik güvenlik' göstermek için tüm genom sekanslama için hiçbir yayın yoktur rağmen Örneğin, RNA virüs, diğer yöntemlerle 14 karşılaştırmak genetik sapması asgari bir düzeyde olmalıdır. Burada, hiPSCs ile üretmek için bir yöntem mevcutMaliyet-etkin bir şekilde yüksek bir yeniden programlama verimliliğe sahip Sendai-virüs. Elde edilen insan iPSCs çoğalma ve gelişim potansiyeline HESC için hücresel ve moleküler benzerlikler bakım ile transgenin serbesttir.
Biz, Sendai-virüs sadece bir set ile aynı anda fibroblast farklı kaynakları (> 4) yeniden programlamak olabilir. Ve bizim yöntem, çeşitli hücre Confluences ve virüs dozaj farklılıkları geçerlidir. Bu 'mix ve maç' kombinasyon tekniği yeniden programlamanın etkinliğini en üst düzeye çıkarabilirsiniz. Her çukurdaki (tek bir hastadan) fibroblastlar farklı bir virüs enfeksiyonu düzeyine sahip, ancak birlikte havuzda toplayarak, hiPSCs koloniler yapma olasılığı bizim deneyime dayalı artırabilir. HiPSC hatları arasında klonal varyasyonun diğer konular çoğalması hızı, hücre eki / hayatta kalma, X kromozomu inaktivasyonu 15 durum vardır, farklılaşma vb, 16 potansiyelleri Nitekim, biz her klon bir farklılık olduğu görülmektedirbir mir-371 küme ekspresyon seviyesini ölçerek tahmin edilebilir sinir eğilimi, ent. Ayrıca biz Sendai virüs yeniden programlama işlemi birçok farklı hücre tipleri için kullanılabileceğini göstermektedir, bu yöntemde, insan iskelet hücreleri insan iPSCs üreten başardı. Ayrıca, yöntemini kullanarak, daha 10 farklı hastalık ile ilgili fibroblastlannda hiPSCs yarattı. Ortalama olarak, 5-10 hiPSC klon, bir fibroblast elde edilebilir.
Sendai-virüs ile transgen-özgür insan iPS hücrelerinin türetme en pratik yolları olabilir en etkili yeniden programlama bir yöntem olmasına rağmen, bu protokolde dikkat edilmesi gereken birkaç sınırlamaları vardır;
- (2.4 'te tarif edildiği gibi) her bir sendai-virüs toplu bağlı olarak, virüs titresi tutarlı MOI için hesaplanan edilmesi gerekmektedir.
- Biz de ROBU için ek titrasyondan ihtiyacı farklı somatik hücreler arasındaki bulaşıcılığı değişimini, gözlenenst viral enfeksiyon.
- Sendai virüs aracılığı ile yeniden programlama araştırma amaçları için en iyi seçimlerden biri olarak kabul edilebilir. Başlangıçta Sendai virüs sistemi geliştirdi şirket ile bir lisans sorunu olduğundan ancak klinik deneme için, bu ilk seçenek olmayabilir.
- Yeniden programlanması somatik hücreler transgenlerden özgür olana kadar biz en az 10 pasajdan sonra transgen ifadeyi kontrol etmeniz gerekir neden olan, yaklaşık iki ay sürer.
- Biz doğrudan bir karşılaştırma yoktur rağmen, birincil kültürlü fibroblast geçiş sayısı Sendai-virüs ile yeniden programlamanın verimliliğini etkileyebilecek gibi görünüyor. Çoğalma oranı da tespit edilmesi gerekmektedir. Daha ileri çalışmalar fibroblastlar geçit sayısı ve yeniden programlama verimliliği üzerindeki çoğalma etkisini belirlemek için gereklidir.
- Bu çalışmada, biz hiPSC üretimi ve bakımı için bir fare besleyici katman kullanmak, ancak ücretsiz bir sistem besleyici bir alternativ olabilirgelecekteki bir çalışmada e yoludur.
Mevcut protokol hastalık modelleme, rejeneratif tıp ve diğer uygulamalar için hastaya özgü hiPSCs eğitim yönünde önemli bir adım olmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz el yazması değerli tartışmalar için Lee laboratuar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Lee laboratuarda çalışma Hücre Araştırma Fonu (Tedco) Kök New York Kök Hücre Vakfı Robertson Araştırmacı Ödülü ve Maryland hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | Invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5 x 105/6 cm or 12.5 x 105/24-well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | Invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 μM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1,000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | Cell Signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1,000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1,000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | Invitrogen | 948492 | 1/2,000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | Cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nature Methods. 6, 363-369 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Yoshioka, N., et al. Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA. Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).
- Fluri, D. A., et al. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nature Methods. 9, 509-516 (2012).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.
- Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells. P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
