Summary
Målretning hjerne-resident celler til direkte afstamning-omprogrammering giver nye perspektiver for hjernen reparation. Her beskriver vi en protokol om, hvordan man forbereder kulturer beriget med hjerne-resident pericytes fra voksent menneske hjernebarken og konvertere disse til inducerede neuroner ved retrovirusmedieret udtryk for transskriptionsfaktorerne Sox2 og Ascl1.
Abstract
Direkte afstamning-omprogrammering af ikke-neuronale celler i inducerede neuroner (INS), kan give indsigt i de molekylære mekanismer, der ligger neurogenesis og muliggøre nye strategier for in vitro-modellering eller reparation af syge hjerne. Identifikation hjerne-resident non-neuronale celletyper kan underkastes direkte omdannelse til iNs kunne åbne mulighed for at iværksætte en sådan tilgang in situ, dvs inden for den beskadigede hjernevæv. Her beskriver vi en protokol udviklet i forsøg på at identificere celler fra den voksne humane hjerne, som opfylder denne forudsætning. Denne protokol omfatter: (1) dyrkning af humane celler fra den cerebrale cortex opnået fra voksne humane hjerne biopsier; (2) in vitro ekspansion (ca. kræve 2-4 uger), og karakterisering af kulturen ved immunocytokemi og flowcytometri; (3) tilsætning af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) under anvendelse af anti-PDGF-receptor-β og anti-CD146-antistoffer;(4) retrovirus-medieret transduktion med neurogen transskriptionsfaktorerne Sox2 og ascl1; (5) og endelig karakterisering af de resulterende pericyt-afledte inducerede neuroner (PdiNs) efter immuncytokemi (14 dage til 8 uger efter retroviral transduktion). På dette stadium, kan iNs probes for deres elektriske egenskaber ved patch-clamp optagelse. Denne protokol giver en meget reproducerbar procedure for in vitro afstamning konvertering af hjerne-resident pericytes i funktionelle menneskelige ins.
Introduction
I modsætning til omprogrammering af somatiske celler i induceret pluripotente stamceller (iPSCs), som igen er udstyret med en overflod af differentiering potentialer direkte omprogrammering sigter til lige omdannelse af en specifik celletype til en anden. Med hensyn til deres anvendelse i forbindelse med sygdom modellering og potentielle cellebaserede behandlingsformer af begge omprogrammering tilgange har særlige fordele og ulemper. Omprogrammering ind iPSCs (I) giver en næsten uendelig kilde af celler; (Ii) giver mulighed for genteknologi; (Iii) forlener med en næsten ubegrænset potentiale differentiering. Men de store ulemper ved iPSCs medføre risiko for tumorgenicitet af udifferentierede celler (teratom dannelse in vivo), og behovet for ex vivo dyrkning og efterfølgende transplantation, hvis disse celler skal anvendes til cellebaserede behandlingsformer. Omvendt er direkte afstamning-omprogrammering begrænset af lavere udbytte af de ønskede cellersom korrelerer direkte med antallet af de målrettede celler start befolkning, men har den fordel, at afstamning-omprogrammeret celler synes ikke at udvise nogen tumorigen risiko ved transplantation 1,2; desuden kan direkte omprogrammering selv opnås in situ, dvs inden for orgel, hvor disse celler ville være påkrævet, så man undgår behovet for transplantation.
Med dette i tankerne, har vores laboratorium forfulgt muligheden for slægt-omprogrammering hjerne-resident celler i iNs som en ny tilgang til cellebaserede behandlingsformer af neurodegenerative sygdomme. Brain-resident celler, der kan være potentielt betragtes som cellulære mål for linjespecifikt omprogrammering omfatte forskellige typer af macroglia (astrocytter, NG2 celler og oligodendrocytter), mikroglia og mikrokar-associerede celler (endotelceller og pericytter). Vi har grundigt undersøgt in vitro omprogrammering potentiale astroglia af cerebral cortex af tidlig postnatal mus 3-5. På jagt efter tilsvarende egnede cellekilder til direkte afstamning-omprogrammering i den voksne menneskelige hjerne, stødte vi på en celle befolkning, der med held kan omprogrammeres i Ins og udstille kendetegnende for pericytes. Her beskriver vi en protokol, hvordan at høste disse celler fra voksne humane hjerne biopsier, udvide og berige disse celler in vitro, og endelig held omprogrammere en væsentlig del af disse in vitro-ekspanderede celler (i størrelsesordenen 25-30%) i ins. Omprogrammering kan opnås ved samtidig retrovirus-medieret co-ekspression af to transskriptionsfaktorer, Sox2 og ascl1. Disse PdiNs fandtes at erhverve evne til gentagen handling potentiel fyring og tjene som synaptiske mål for andre neuroner, der angiver deres evne til at integrere sig i neurale netværk. Vores protokol giver en enkel procedure til isolering og afstamning konvertering af voksne menneskelige hjerne pericytes i ins.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Isolering og dyrkning af voksne mennesker hjerneceller
Eksperimenter med humant væv bør udføres i overensstemmelse med alle relevante statslige og institutionelle regler om brug af humant materiale til forskningsformål. Den nuværende protokol blev udviklet i overensstemmelse med godkendelsen af den etiske komité i det medicinske fakultet i LMU München og skriftligt informeret samtykke fra alle patienter.
Denne protokol forbereder kulturer i voksent menneske hjernebarken er blevet etableret ved hjælp eksemplar af patienter af begge køn, der lider af FLE eller andre dybtliggende ikke-traumatiske, ikke-maligne læsioner. Vævet opnås fra kirurgiske rum udelukkende sammensat tilgangskanalen til hjernen læsion og derfor betragtes sundt. Aldersgruppen af patienterne var 19-70 år.
- Forbered vækstmedium ved tilsætning af varme-inaktiveret føtalt kalveserum(FCS) til DMEM høj glucose med Glutamax at opnå en endelig koncentration på 20% FCS. Tilsæt 5 ml penicillin / streptomycin i alt 500 ml vækstmedium. Udfør denne og alle efterfølgende trin, der kræver sterile dyrkningsbetingelser i et passende laminar flow hætte.
- Hold den voksne menneskehjerne biopsi opnået fra kirurgisk rum i Hanks balancerede saltopløsning med CaCl2 og MgCl2 (HBSS) medium herunder HEPES (10 mM slutkoncentration) på is indtil forarbejdning. Starte behandlingen så hurtigt som muligt.
- For at starte adskillelse i enkelte celler, overføre vævet ind i en 65 mm petriskål og hakkekød i små stykker ved hjælp af to sterile engangsartikler skalpeller. Enzymatisk fordøjelse bruge 3-6 ml TrypLE i et 15 ml konisk rør og inkuberes i 15-30 minutter ved 37 ° C i et vandbad.
- Tilsæt 1 volumen forvarmet vækstmedium at lette dissociation og forsigtigt udriv opløsning indeholdende vævsstykker op og ned ved først at brugeEn 5 ml engangspipette, efterfulgt af anvendelse af en glas Pasteur-pipette, indtil homogenisering af cellesuspensionen. Typisk nogle resterende væv stykker, for det meste består af hvide substans, vil forblive i suspension.
- Spin ned ved 157 x g i 5 min, og pellet resuspenderes i den passende mængde vækstmedium (10 ml per ubelagte T75 dyrkningskolbe). Brug en T75 kultur kolbe for en biopsi på 5-10 mm i diameter i størrelse og ekstrapolere fra det i tilfælde af større prøver.
- Placer celler i et 37 ° C inkubator med 5% CO 2 og 5% O 2.
- Udskift halvdelen af medium hver 3-4 dage, indtil cellerne har nået konfluens. Dette tager normalt op til to uger (benævnt passage 0 [P0]).
2.. In vitro Udvidelse og karakterisering af voksent menneske hjerneceller
- In vitro-ekspansion:
- Aspirer dyrkningsmedium og vaskes med phosphatpufret saltvand (PBS), som holdes ved stuetemperatur temperatur, før du tilføjer 3 ml TrypLE.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 5-10 minutter, indtil de fleste af cellerne fjernes. Bank forsigtigt på kolberne for at lette løft af cellerne; efter tilsætning af 3 volumener af vækstmedium overføre cellerne til et 15 ml konisk rør og centrifuger ved 157 xg i 5 minutter, og cellerne resuspenderes i en passende mængde vækstmedium.
- Passage af cellerne i et forhold på 1:3 for optimalt udbytte i nye T75 celledyrkningskolber.
Bemærk: Vi har passeret disse celler indtil P5 uden tegn på reduceret omprogrammering effektivitet. Mens P0 kulturen indeholder en betydelig fraktion af endothelceller (som vurderet ved CD34 ekspression) ved efterfølgende passager deres antal bliver ubetydelig.
- Karakterisering af voksne hjerne fra menneske:
- Immuncytokemi:
- Til karakterisering af celler, frø ~ 60.000 celler på poly-D-lysin-coatede glas dækglas i 500 pi frisk vækst medium i 24-brønds vævskulturplader og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O 2.
- For immunocytokemisk analyse af de dyrkede humane hjerneceller fjerne mediet og vask 3x med 1 ml PBS.
- Lave celler ved tilsætning af 500 pi 4% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Overfør dækglas glider ind i en passende befugtet farvning kammeret og blokere med 80 pi PBS indeholdende 3% bovint serumalbumin (BSA) og 0,5% Triton X-100 i 1 time ved stuetemperatur.
- Læg primære antistoffer fortyndet i den samme opløsning (for fortyndingsfaktorer se tabel specifikke reagenser og udstyr) og inkuberes natten over ved 4 ° C eller i 1 time ved stuetemperatur.
Bemærk: En væsentlig, men varierende fraktion af cellerne i denne fase af dyrkningen er immunreaktive for blodpladeafledte vækstfaktor receptor β (PDGFRβ) klynge af differentiering 146 (CD146), NG2 chondroitinsulfat Proteoglycan og glat muskulatur actin (SMA), dvs markører der er karakteristiske for mikrokar-associeret pericytter. Kun et mindretal (<1%) udtrykker den astrogliale markører gliafibrillært surt protein (GFAP) og S100β. Desuden på dette stadium kultur skal være blottet for enhver celler, der udtrykker den neuronale markør βIII-tubulin. Brug flere primære antistof kombinationer til co-mærkning af forskellige markører. Der kan fås yderligere bekræftelse af ekspressionen af gliale, neuronale, endotel og pericyt markører ved revers transkription og kvantitativ real tid polymerase chain reaction (ikke beskrevet i denne protokol). - Efter inkubering med de primære antistoffer vaskes tre gange med 1 ml PBS og tilføje de tilsvarende sekundære antistoffer (i passende fortyndinger) til farvningsopløsningen og inkuber i 1 time ved stuetemperatur i mørke. Vask cellerne 3x med PBS. Hvis det er påkrævet, forud for montering omfatter farvning med DAPI i 5 minutter ved stuetemperaturtemperatur.
- Brug antifading monteringsmedium og analysere dækglas under anvendelse af et epifluorescensmikroskop eller et konfokalt mikroskop.
- Flowcytometri:
- Til analyse af overflade markør ekspression under anvendelse af flowcytometri, vokser celler til konfluens i ubelagte T25 eller T75 celledyrkningskolber.
- Frigør celler ved hjælp af TrypLE som beskrevet før, og resuspender i farveopløsning bestående af PBS + 0,5% BSA. Per farvningsreaktion, resuspender 100.000-200.000 celler i 100 pi af farveopløsning. Forbered enkelt farvningsprocedurer reaktioner per antistof anvendes (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, respektive isotypekontrolantistoffer).
- Tilføj fluorokromkonjugerede antistoffer til hver farveopløsning (for fortyndinger se tabel specifikke reagenser og udstyr) direkte i cellesuspensionen og inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter i mørke.
- Vask cellerne tre gange med 500 pi PBS og spin ned mellem hvervasketrin ved 157 xg i 5 min.
- Resuspender cellepelleten i 0,5-1 ml farvningsopløsning og overføre celler gennem et cellefilter (70 um) til FACS-rør. Prøven beskyttes mod udsættelse for lys.
- Vortex prøver forud for at placere dem i FACS instrumentet.
- At analysere de levende celler og udelukke debris og celleaggregater, gate for FSC-A og SSC-A. Cell duplets er specifikt gated ud af FSC-A og FSC-W. For at bestemme de rette gating betingelser for celleoverflademarkører sat portene med isotype-matchet antistof kontrol konjugeret til den respektive fluorokrom. Derefter bestemme andelen af antistofbundne celler.
- Immuncytokemi:
3.. Berigning til pericyt-afledte celler ved fluorescensaktiveret cellesortering
- Renses pericyt cellepopulation (resuspenderet i vækstmedium) forud for transduktion via FACS sortering ved hjælp af en 70 um dyse. Brug CD34-APC i kombination med CD140b-PE og CD146-FITC at vælge for pericytes. Sorter efter CD34-negative, CD140b-og CD146-positive celler.
- Indsamle de sorterede celler i vækstmedium og plade på poly-D-lysin-overtrukne dækglas i 24-brønds vævskulturplader og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O 2.
- 48 timer efter sortering erstatte mediet med frisk vækstmedium og udføre transduktion som beskrevet i protokol 4.
4.. Retrovirustransduktion af pericyt-afledte celler og Omprogrammering ind Inducerede Neuroner
Bemærk: Se lokale retningslinjer biosikkerhed ved håndtering retrovirale partikler. I Tyskland brugen af retrovira ansat her kræver biosikkerhed niveau 2. Til produktion af retrovirale partikler henvise til protokol 6. For retrovirale konstruktioner, der anvendes til omprogrammering, se Karow et al. (2012). Retrovirus var pseudotyped med VSV-G (vesikulær stomatitis-virus-glycoprotein) 5. For produktion henvises til Gavrilescu et al 6.
- 24 timer før retroviral transduktion frø ~ 60.000 celler på poly-D-lysin-overtrukne dækglas i 500 pi frisk vækstmedium i 24-brønds vævskulturplader og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 og 5% O 2 .
- Den næste dag, udskifte vækstmediet med 500 pi frisk, forvarmet vækstmedium og tilsæt 1 ml af de respektive koncentrerede supernatanter indeholdende retrovirale partikler (pCAG-IRES-dsRed til styring, især under oprettelse protokollen i laboratoriet), pCAG-ascl1 -IRES-DsRed, pCAG-Sox2-IRES-GFP.
- En dag senere, fjernes mediet, herunder de virale partikler fra cellerne, og der tilsættes 1 ml frisk, forvarmet B27-differentiering medium, der består af 49 ml DMEM høj glucose med Glutamax og 1 ml B27 serum-frit supplement. Vedligehold celler i kultur ved 37 ° C i 5% CO 2 og 5% O 2 i 4-8 uger uden at ændre mediet som gentagne medium ændringer bliver skadelige som iNs modnes.
5.. Karakterisering af induceret neuroner ved Immuncytokemi
- For at bestemme den cellulære identitet transducerede celler, især for at demonstrere erhvervelsen af en neuronal fænotype, udføre immuncytokemi mod neuronale antigener, såsom Bill-tubulin, MAP2 og Neun (for antistoffer og deres respektive fortyndinger, se tabel specifikke reagenser og udstyr følger samme procedure som angivet i 2.2.1).
- For at forbedre modning af PdiNs, co-kultur af disse celler med neuroner, der stammer fra E14 mus hjernebark. Til dette formål dissekere den cerebrale cortex og dissocierer vævet mekanisk med en flammepoleret glas Pasteur-pipette. Tilføj 10.000-50.000 murine neuroner til kulturer af pericyt-afledte celler 2-3 uger efter transduktion med Sox2-og ascl1-kodning retroviruses og fortsætte dyrkningen. Transducerede celler kan skelnes fra murine neuroner ved deres reporter (GFP og dsRed) udtryk, enten ved levende epifluorescens eller efter immunocytokemi for GFP og dsRed.
- For at vurdere dannelsen af synapser på PdiNs af murine neuroner, udføre immuncytokemi mod vesikulære neurotransmitterreceptorer såsom vesikulær glutamat transportør 1 (vGluT1).
- Probe transducerede celler for deres elektriske egenskaber (dvs. evne til at generere aktionspotentialer) og etablering af funktionelle synapser ved patch-clamp elektrofysiologi. For nærmere oplysninger om den procedure, se Heinrich et al. (2011).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det første resultat af denne protokol efter med held etablere en kultur fra en prøve af voksent menneske hjernebarken består i identifikationen af den cellulære sammensætning af kulturen. Immuncytokemi for celle typespecifikke proteiner afslører en betydelig grad af heterogenitet mellem kulturer afledt fra prøvemateriale fra forskellige patienter (figur 1A). Kvantificeret ved flowcytometri er der altid en væsentlig fraktion af celler, som udtrykker PDGFRβ (i gennemsnit ~ 75%, der spænder fra 30 til op til 99%); andre markører for pericytter såsom CD146, NG2 og CD13 udtrykkes typisk i et nedre område (figur 1B). Ligeledes SMA udtrykkes i en mindre subpopulation af de dyrkede celler, som bestemt ved immunocytokemi (figur 1A). Ved passage 0 (P0), der som regel <10% af CD34-positive endothelceller, og deres antal falder under detektion med yderligere passage. Ligeledes astrocytes omfatter kun en ubetydelig forurening på tidligere passager. Endvidere er der typisk ingen celler, der farves for neural stamcelle neuronal eller oligodendrocyt markører. Immuncytokemisk og flowcytometri data er fuldt bekræftes af kvantitativ RT-PCR 7. I summen, den største fraktion inden for kulturen udtrykker proteiner og mRNAer karakteristisk for pericytes. En yderligere berigelse for pericyt-afledte celler kan opnås ved FACS på dette stadium. Dette er især relevant, når renheden af kulturen er i den lavere ende af spektret som afspejlet i niveauet for PDGFRβ udtryk. Således har vi brugt et antistof mod PDGFRβ (CD140b) alene eller i kombination med et anti-CD146-antistof, mens eksklusive eventuelle CD34-positive forureninger, til FAC sortere specifikt pericytes (figur 1C).
Transducing disse kulturer med kontrol virus koder for en reporter kun gen, ændrer ikke deres markør udtryk profile (vurderet 3-4 uger efter transduktion), hvilket indikerer, at disse celler forbliver i pericyt afstamning. Ligeledes har retrovirusmedieret udtryk for Sox2 alene ikke resultere i nogen åbenlyse ændringer i morfologi eller inducerer BIII-tubulin udtryk antyder, at Sox2 alene ikke er tilstrækkelig til at fremkalde en skæbne konvertering. I modsætning hertil en lav procentdel (ca. 10%) af cellerne transduceret med en ascl1-koder retrovirus alene udstille βIII-tubulin udtryk, dog uden at erhverve en neuronal morfologi. Det er slående, næsten 50% af alle Sox2-og ascl1-cotransduced celler viser βIII-tubulin udtryk og endnu vigtigere, en tredjedel af disse dobbelt-transduced celler (visualiseret ved deres dobbelte reporter udtryk) også vise neuronale processer (figur 2). Sammen med købet af neuronale funktioner udtryk for PDGFRβ er nedreguleret 7. Med yderligere modning i kultur, også Sox2-og ascl1-co-ekspression cellerne bliver Immunoreactive for de mere modne neuronale markører MAP2 (farvning dendritiske processer) og Neun (farvning overvejende nervecellelegemer). Som omtalt nedenfor disse ændringer i markør udtryk korrelerer også med købet af elektrofysiologiske kendetegnende for neuroner. I sum Disse data giver dokumentation for direkte omdannelse skæbne pericyt-afledte celler i iNs, kaldet PdiNs. Disse PdiNs besidde kompetencen til at etablere funktionelle postsynaptiske rum som åbenbaret i cokultur eksperimenter med neuroner i embryonale mus hjernebarken. Denne kompetence kan påvises elektrofysiologisk i udseendet af synaptiske indgange (se diskussionen nedenfor) samt udsmykning af dendritiske processer PdiNs med præsynaptiske terminaler stammer fra co-dyrkede neuroner (karakteriseret ved klynger af vesikulær neurotransmitter transportere, fx vGluT1 immunoreaktivitet). Disse data viser endvidere evne PdiNs at integrere sig i neuronal circuits.
Fig. 1. Heterogen ekspression af pericyt markører i kulturer afledt af voksne mennesker hjernebarken. A) Fluorescerende mikrografier illustrerer den heterogene udtryk for pericyt markører (PDGFRb, SMA, CD146) som det fremgår af immuncytokemi. Skala bar = 50 mM. B) Histogrammet opsummerer de relative antal celler positive for pericyt markører PDGFRβ (CD140b), CD13 og CD146 som bestemt ved flowcytometri forskellige patient-afledte kulturer. CD34 er en markør for endothelceller. C) FACS dot plots skildrer isotypekontrol-og CD146 / CD140b-farvede humane celler til sortering af dobbelt-positive pericytes (fremhævet af den røde boks) til efterfølgende omprogrammering. Bemærk den høje PDGFRβ udtryk ogheterogenitet med hensyn til CD146 udtryk i dette særlige kultur.
. Figur 2. Omprogrammering af voksne humane pericyt-afledte celler i iNs Top:. Forsøgsopstilling. Herunder: Fluorescerende mikrografier skildrer celler transduceret med retrovirus kodning Sox2-IRES-GFP og ascl1-IRES-DsRed. Bemærk, at kun dobbelt transducerede celler (pilespidser) udtrykker BIII-tubulin (højre panel) og udviser neuronal morfologi.
| celledeling [%] | celledød [%] | BIII-tubulin + [%] | |
| 36 | 3 | 0 | |
| Sox2 | 46 | 7 | 0 |
| Ascl1 | 26 | 33 | 7 |
| Sox2-Ascl1 | 3 | 36 | 25 |
Tabel 1.. Behavior af pericyt-afledte celler undergår omdannelse til PdiNs som vurderet ved kontinuerlig levende billeddannelse. Bemærk at Sox2-og Ascl1 co-udtrykkende celler exit cellecyklus. Desuden hæftede den høje celledød efter Ascl1 eller Sox2 og Ascl1-coexpression. Under hensyntagen til disse forskellige cellulære begivenheder, cirka 25% af alle co-transducerede celler bliver ins.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende protokol beskriver in vitro ekspansion og berigelse af pericyt-afledte celler efter isolering fra voksent menneske hjernebarken og den efterfølgende omdannelse til iNs ved retrovirusmedieret udtryk for neurogene transskriptionsfaktorerne Sox2 og Ascl1. En sådan protokol giver et eksperimentelt in vitro-system til at studere slægt-konvertering af hjerne-resident celler til neuroner og potentielt også glia, med det mål for øje at i sidste ende omsætte denne direkte tilgang omregning til in vivo indstilling af den voksne hjerne.
Tekniske overvejelser
I vores undersøgelse udnyttede vi menneskeligt hjernevæv fra patienter i alderen mellem 19 og 70 år, fra begge køn. Vi lagde ikke mærke en åbenlys forskel i omprogrammering effektivitet afhængig af køn eller alder 7. Det anbefales dog at dokumentere denne information som mere subtile forskelle alligevel kan væreobserveret, at undgået vor opmærksomhed.
Det anbefales endvidere, at påbegynde behandlingen så tidligt som muligt efter overførsel af vævsprøve til laboratoriet. Der vil være nødvendigvis nogle ubekendte hvor længe vævet er forblevet i den kirurgiske plads forud at overføre til experimentalist. Vi anslår, at i vores undersøgelse 7 tiden mellem fjernelse fra patientens hjerne til starten af dyrkningen procedure varierede mellem 2-6 timer, med prøverne holdes hele tiden på is. Ingen åbenlys forskel i den lethed efterfølgende behandling eller nogen negative resultat blev bemærket inden for dette tidsvindue.
En kritisk vurdering for enhver protokol vedrører sin enkelhed, reproducerbarhed og effektivitet. Den nuværende protokol er ligetil i, at der i første fase celler ekspanderes i en billig medium, som let kan opnås, efterfulgt af en anden fase af celle omprogrammering ved hjælp af kun to transskription factors og dyrkning i et defineret medium.
Med hensyn til reproducerbarhed, observerede vi, at kvaliteten af præparatet retrovirus er af allerstørste betydning, med lav titer viruspræparater bruges i fortyndinger til at matche antallet af infektiøse partikler af høj titer virus ofte resulterer i svigt af omprogrammering. Faktisk bemærkede vi, at den samme pericyt kultur, hvor omprogrammering havde tidligere med held kunne konverteres til iNs ved brug af høj titer virus.
Med hensyn til effektiviteten af konvertering, har vi vurderet, at antallet af βIII-tubulin-positive celler fra Sox2-og ascl1-cotransduced celler ved hjælp af kontinuerlige direkte billedvisning. Live-billedbehandling giver mulighed for vurdering af antallet af celler, der undergår celledeling eller celledød under konverteringen, mens sådanne oplysninger mangler, når antallet af genererede iNs kun bestemmes ved slutpunktet af forsøget. I virkeligheden ved hjælp af time-lapse video mikroerkopi (for den procedure refererer til Ortega e t al. 8) blev det observeret, at untransduced og enkelt faktor-transduced celler fortsætter prolifererende, mens Sox2-og ascl1-cotransduced celler hurtigt forlade cellecyklus. Desuden er en betydelig brøkdel af den sidstnævnte population undergår celledød. Mens retrovirus toksicitet ikke formelt kan udelukkes fra de opnåede data i vores undersøgelse 7, blev det faktum, at øget celledød kun observeret når ascl1 blev udtrykt (alene eller i kombination med Sox2), vi tolker det som bevis for en katastrofal konflikt celleskæbner . Under disse to begivenheder i betragtning, vurderer vi, at 25% af alle Sox2-og ascl1-cotransduced celler konverterer til BIII-tubulin positive INS (tabel 1).
Som er absolut påkrævet co-transduktion for vellykket omprogrammering, kan man overveje at ansætte en viral vektor, der koder for begge gener for at optimere mængden af celler, der udtrykker begge faktorer på sammetid.
For nylig Ladewig et al. Udviklet en protokol til effektiv omdannelse af fibroblaster i iNs opnå et udbytte på 200% ved hjælp af små molekyle-baserede hæmning af glycogensynthasekinase-3β og SMAD signalering 9.. Det vil være interessant at afgøre, om disse add-ons til vores protokol forbedre udbyttet af PdiN produktion.
Et andet interessant resultat af den levende billeddannelse af omprogrammering processen vedrører den omstændighed, at omdannelsen af voksne humane pericytes i iNs sker i et noget langsommere tempo i forhold til lignende omprogrammering protokoller kulturer af forskellige somatiske celler museoprindelse 4. Dette stemmer overens med den karakteristiske langsomme modning af humane neuroner 10.
Selvom vi ikke har systematisk analyseret virkningen af den ilt spænding på udbyttet af PdiN produktion, vi bemærkede, at inkubation i lave iltforhold (5%) genereltgav overlegne resultater i forhold til dyrkning af cellerne i normoxiske betingelser (21%). For nylig Davila et al. Beskrev en tilsvarende forstærkende virkning ved reduceret oxygenspænding til induktion af iNs fra humane fibroblaster 11.
Vores Protokollen er baseret på den retrovirale levering af Sox2 og ascl1 mens andre direkte protokoller konvertering har ansat inducerbare lentivirusvektorer 1, 12, 13. For nylig har vi også succes anvendt doxycyclin-inducerbare lentivirale konstruktioner, der koder Sox2 og ascl1, hvilket indikerer, at en relativt kort puls (10 dage) af Sox2 og Ascl1 udtryk er tilstrækkelig til at forårsage pericyt-til-neuron konvertering. De retrovirus, der anvendes i vores undersøgelse 7 var designet til reduceret silencing 5.. Derfor ser vi ikke udseendet af neuroner blottet for reporter genekspression. Men muligheden for, at de samlede ekspressionsniveauer af både transgens og reporter forandring over tid kan ikke udelukkes. Integration fri tilgange (udnytte Sendai-vira) er blevet sidst anvendes i tilfælde af produktion af inducerede neurale progenitorer 14, men det er i øjeblikket ikke kendt, om dette eller endda virusfri omprogrammering strategier kan med held anvendes til at konvertere humane pericytter. Endelig, uanset pericytter fra andre væv kan undergå omdannelse inducerede neurale celletyper fortsat skal testes.
Begrebsmæssige overvejelser
En kritisk udfald af omprogrammering af somatiske celler i iNs vedrører deres funktionalitet 15. Vi har vurderet de elektrofysiologiske egenskaber af PdiNs på forskellige tidspunkter efter påbegyndelsen af omprogrammering processen. Ved meget tidlige stadier, svarende til 2 uger efter retrovirustransduktion, PdiNs udviser knap tegn på elektrisk uro, trods βIII-tubulin udtryk på dette tidspunkt. Således er de fleste afelektrofysiologiske analyser blev udført 4-8 uger efter transduktion med Sox2 og ascl1. Som beskrevet i Karow et al. Er PdiNs præget af betydelig umodenhed, som afspejles af høje input modstand og en lav frekvens af handling potentiale fyring. Yderligere modning kan fremmes ved co-dyrkning PdiNs med neuroner afledt fra muse E14 hjernebarken. Under disse betingelser, PdiNs udviser højere aktionspotentialets frekvenser og øget natrium strømme 7. Desuden coculturing afslører kompetence PdiNs at modtage funktionel synaptisk input fra mus neuroner. I sum, PdiNs erhverve funktionelle neuronale egenskaber, som kan forbedres yderligere ved coculturing med andre neuroner. Det er dog fortsat til at blive vist, om PdiNs også kan etablere funktionelle præsynaptiske rum. Yderligere undersøgelser transplantere PdiNs i hjernen er nødvendige for at afsløre deres potentiale til at nå fuld modenhed og funktionalitet.
Usynge Sox2 og ascl1 som omprogrammering faktorer, vi bemærkede, at de resulterende PdiNs erhverve funktioner i GABAerge neuroner 7. Interessant nok har andre grupper udviklet protokoller til at omdanne fibroblaster til iNs ved hjælp af forskellige transkriptionsfaktor og / eller microRNA kombinationer med det resultat, at udvikle iNs erhvervet særskilt neurotransmitter specifikation såsom en glutamaterge, dopaminerge og kolinerg fænotype 1, 16-18. Det er endnu ikke afprøvet, om de faktorkombinationer anvendes i fibroblaster fremkalde samme sender identitet i PdiNs. Desuden har nyere arbejde udvidet omdannelse spektrum over neurogenese at generere neurale stamceller 19, 20 eller glia, navnlig oligodendrocytter 21, 22. Hvis disse omprogrammering protokoller fremkalde et lignende resultat i voksne menneskelige hjerne pericyt-afledte celler, ville dette i høj grad udvide panorama af anvendelser af denne important hjerne-resident celletype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Dr. Magdalena Götz for hendes input under udviklingen af denne protokol. Vi takker Dr. Marius Wernig (Stanford University) for generøst at give os med Sox2 kodende sekvens. Vi er også meget taknemmelige til Dr. Alexandra Lepier for virus produktion. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) og BMBF (01GN1009A) til BB, og det bayerske stat, Ministeriet for Videnskab, forskning og kunst til MK og BBCS modtaget støtte fra binationalt SYSTHER- INREMOS Virtual Institute (tysk og slovensk forbundsministerierne for Uddannelse og Forskning) og DFG (SFB 824).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1,000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1,000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15 ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
