En enkel och snabb protokoll för mätning av neutrala lipider i algceller Använda Fluorescens

Summary

Ett enkelt protokoll för att bestämma den neutrala lipiden halt av algceller genom att använda en Nilrött färgningsprocedur beskrivs. Detta tidsbesparande teknik erbjuder ett alternativ till traditionella gravimetriska baserade lipid kvantifiering protokoll. Den har utformats för den specifika tillämpningen av övervakning bioprocess prestanda.

Abstract

Alger anses vara utmärkta kandidater för källor på grund av deras naturliga lipid lagringsmöjligheter förnybara bränslen. Robust övervakning av alg-fermentationsprocesser och screening för nya oljerika stammar kräver ett snabbt och tillförlitligt protokoll för bestämning av intracellulär lipid content. Nuvarande praxis är beroende till stor del på gravimetriska metoder för att bestämma oljehalten, tekniker utvecklade årtionden sedan som är tidskrävande och kräver stora provvolymer. I detta dokument är Nile Red, ett fluorescerande färgämne, som har använts för att identifiera närvaron av lipid kroppar i många typer av organismer, införlivas i en enkel, snabb och pålitlig protokoll för mätning av den neutrala lipiden innehåll Auxenochlorella protothecoides, en grön alg. Metoden använder etanol, en relativt mild lösningsmedel, att permeabilize cellmembranet innan färgning och en 96 väl mikroplatta för att öka provkapacitet under fluorescensintensitetsmätningar. Det har varit konstruktioned med den specifika tillämpningen av övervakning bioprocess prestanda. Tidigare torkade proverna eller levande prover från en växande kultur kan användas vid analysen.

Introduction

På grund av deras förmåga att lagra lipidkroppar under vissa stressförhållanden, har algerna fått stor uppmärksamhet de senaste åren som en potentiell förnybar energikälla ^1,2. Neutrala lipider kan svara för över 60% av cellens torrvikt under lämpliga tillväxtbetingelser ^3. Men branschen inte har en enkel, ren, snabb och pålitlig standardiserat protokoll för att kvantifiera lipidhalt av algceller för att ordentligt övervaka bioprocess prestanda, analysera kulturer, och skärm för nya stammar.

Den Bligh-Dyer gravimetrisk metod utvecklat några 50 år sedan är fortfarande bland de vanligaste tekniker som används i dag ^4,5. Även om detta förfarande är enkelt, pålitligt och lätt att utföra, är det tidskrävande, kräver stora provvolymer, och använder sig av toxiska lösningsmedel. Det är inte praktiskt för att analysera många prover från en fermentationskörning eller screening för nya oljerika stammar. Andra metoder har been utvecklade, men vanligtvis kräver avancerad utrustning och har inte standardiserats ^6.

Ett alternativ som har rönt ett stort intresse är den Nile Red-färgning. Nile Red, ett färgämne som fluorescerar preferentiellt i opolära miljöer, har använts för att identifiera eller kvantifiera lipidkroppar i olika organismer, inklusive nematoder ^7, jäst ^8, bakterier ⁹ och alger ^10-19. Inledande tekniker som innefattar Nile Red var mestadels kvalitativ eller semi-kvantitativ kombinerar fläcken med singel-kyvett spektrofotometri eller flödescytometri. Dessutom är vissa typer av alger, såsom grönalger har tjocka cellbrunnar som är mest ogenomträngliga för färgämnet, vilket begränsade utbudet av tekniken ^10.

Nya förbättringar av Nilen Röda färgningsmetoden har rapporterats att kringgå de ursprungliga bristerna i protokollet ^10,11. Färgning av cellerna i närvaro av en Carrier lösningsmedel som DMSO ¹⁰ eller etanol ^10,11 linearizes sambandet mellan oljehalt och absorbans, vilket möjliggör tillförlitliga kvantitativa mätningar. Lösningsmedlet hjälper till att permeabilisera cellmembranet så att Nile Red molekyler kan passera igenom. Dessutom, med en spektrofotometer med mikroplatt läsning kapacitet möjliggör hög genomströmning protokoll som lämpar sig för kvantitativ analys.

I denna artikel kommer vi detalj en enkel metod för att mäta halten av algceller olja genom färgning kulturer med Nile Red i närvaro av etanol, ett milt lösningsmedel. För att på bästa sätt ta hänsyn till bakgrundsbrus i mätningarna, är en standardkurva som korrelerar fluorescensintensiteten för oljeinnehåll utvecklats med användning algceller med känd oljekompositionen. Metoden är anpassad från tidigare publicerade protokoll ^10,11. Genom att använda en 96-brunns-spektrofotometer, är en möjlighet att analysera samma mängd prov i en timme that skulle ta dagar att följa med gravimetriska metoder. Dessutom, genom att kalibrera med hjälp av representativa urval av den önskade algarter denna metod ger relativt exakta mätningar som är direkt tolkningsbar. Det finns många protokoll som beskriver metoder för färgning alger med Nile Red optimerade för olika stammar och tillämpningar; protokollet presenteras här utvecklades ursprungligen av de la Hoz Siegler et al. ¹¹ för Auxenochlorella protothecoides, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus och Scenedesmus obliquus, även om det är sannolikt lämplig för många fler arter och klasser. Den har utformats med särskild tillämpning av övervakning bioprocess prestanda och det fungerar lika bra för tidigare torkade proverna och våta prover från en växande kultur.

Protocol

1. Isolering av Dry algbiomassan som ska användas som standarder för fluorescens avläsningar Ta en provvolym från den växande algkulturen som kommer att ge minst 200 mg av torr biomassa, är 400-600 mg att föredra. Centrifugera provet vid 4 ° C under 10 min vid 10000 x g.. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten med en lika stor volym av fosfatbuffert formuleras till samma pH som den tillväxtmediet. Upprepa steg 1,2 för totalt 3 tvättsteg. Återsuspendera pelleten …

Representative Results

Representativa algceller färgats med Nile Red dye är avbildade i Figur 1. Delarna A och B i Figur 1 visar bilder av A. protothecoides vuxit utöver kväve, vilket leder till mycket låga intracellulära lipidackumulering. I delar C och D, prover av A. protothecoides odlas under kvävebegränsning visas. Enligt sändnings belysning, kan lipid organ cellen visualiseras med noggrann inspektion av <stron…

Discussion

Algerna används i standardkurvan måste vara samma art som odlas under samma försöksbetingelser som de som mäts. Betydande förändringar i mediesammansättning, odlingsteknik, och färgningsprotokollet kan påverka intensiteten i fluorescens läsning. Hexan extraktion (som beskrivs i avsnitt 1 och 2) användes för att bestämma den neutrala lipiden innehåll för prov använda i standardkurvan. För noggranna mätningar fluorescensintensiteten måste alla proverna analyseras vid samma koncentration av biomassa (5 …

Materials

Dry Weight
25 ml disposable pipettes	Fisher	13-676-10K
Pipette Bulb	Fisher	13-681-51
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes	Fisher	05-562-16A	Teflon needed for hexane
Weigh Dishes (polypropylene)	Fisher	2-202B
1.5 ml micro-centrifuge tubes	Fisher	05-408-129
Centrifuge	Sorvall	RC6plus
Drying Oven (Fisher 625D)	Fisher	13-254-2
Storage vials	Fisher	0337-4
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)	Fisher	05-40-100
Gravimetric Quantification
Porcelain Mortar (Coorstek)	Fisher	12-961A
Porcelain Pestle (Coorstek)	Fisher	12-961-5A
40 ml Centrifugation tubes (FEP)	Fisher	05-562-16A	Could also use glass tubes
Pasteur Glass Pipettes	Fisher	13-678-20C
Aluminum weigh dishes	Fisher	08-732-101
Hexanes	Fisher	H292-4
Fluorometric quantification of oil content
Fluorescence multi-well plate reader	Thermo Lab Systems	Fluoroskan Ascent
Fluorescence reader software	Thermo Lab Systems	Ascent Software 2.6
COSTAR 96 well plate with round bottom	Fisher	06-443-2
Nile Red	Sigma	N3013-100MG
Ethanol (Alcohol reagent grade)	Fisher	AC65109-0020
Imaging Fluorescent cells
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope	Leica	DMRXA2
Microscope slides	Fisher	12-550-15
Microscope cover slips	Fisher	12-541B
Camera	Qimaging	Retiga Ex
Imaging software	Qimaging	QCapture v.1.1.8