Summary

En enkel och snabb protokoll för mätning av neutrala lipider i algceller Använda Fluorescens

Published: May 30, 2014
doi:

Summary

Ett enkelt protokoll för att bestämma den neutrala lipiden halt av algceller genom att använda en Nilrött färgningsprocedur beskrivs. Detta tidsbesparande teknik erbjuder ett alternativ till traditionella gravimetriska baserade lipid kvantifiering protokoll. Den har utformats för den specifika tillämpningen av övervakning bioprocess prestanda.

Abstract

Alger anses vara utmärkta kandidater för källor på grund av deras naturliga lipid lagringsmöjligheter förnybara bränslen. Robust övervakning av alg-fermentationsprocesser och screening för nya oljerika stammar kräver ett snabbt och tillförlitligt protokoll för bestämning av intracellulär lipid content. Nuvarande praxis är beroende till stor del på gravimetriska metoder för att bestämma oljehalten, tekniker utvecklade årtionden sedan som är tidskrävande och kräver stora provvolymer. I detta dokument är Nile Red, ett fluorescerande färgämne, som har använts för att identifiera närvaron av lipid kroppar i många typer av organismer, införlivas i en enkel, snabb och pålitlig protokoll för mätning av den neutrala lipiden innehåll Auxenochlorella protothecoides, en grön alg. Metoden använder etanol, en relativt mild lösningsmedel, att permeabilize cellmembranet innan färgning och en 96 väl mikroplatta för att öka provkapacitet under fluorescensintensitetsmätningar. Det har varit konstruktioned med den specifika tillämpningen av övervakning bioprocess prestanda. Tidigare torkade proverna eller levande prover från en växande kultur kan användas vid analysen.

Introduction

På grund av deras förmåga att lagra lipidkroppar under vissa stressförhållanden, har algerna fått stor uppmärksamhet de senaste åren som en potentiell förnybar energikälla 1,2. Neutrala lipider kan svara för över 60% av cellens torrvikt under lämpliga tillväxtbetingelser 3. Men branschen inte har en enkel, ren, snabb och pålitlig standardiserat protokoll för att kvantifiera lipidhalt av algceller för att ordentligt övervaka bioprocess prestanda, analysera kulturer, och skärm för nya stammar.

Den Bligh-Dyer gravimetrisk metod utvecklat några 50 år sedan är fortfarande bland de vanligaste tekniker som används i dag 4,5. Även om detta förfarande är enkelt, pålitligt och lätt att utföra, är det tidskrävande, kräver stora provvolymer, och använder sig av toxiska lösningsmedel. Det är inte praktiskt för att analysera många prover från en fermentationskörning eller screening för nya oljerika stammar. Andra metoder har been utvecklade, men vanligtvis kräver avancerad utrustning och har inte standardiserats 6.

Ett alternativ som har rönt ett stort intresse är den Nile Red-färgning. Nile Red, ett färgämne som fluorescerar preferentiellt i opolära miljöer, har använts för att identifiera eller kvantifiera lipidkroppar i olika organismer, inklusive nematoder 7, jäst 8, bakterier 9 och alger 10-19. Inledande tekniker som innefattar Nile Red var mestadels kvalitativ eller semi-kvantitativ kombinerar fläcken med singel-kyvett spektrofotometri eller flödescytometri. Dessutom är vissa typer av alger, såsom grönalger har tjocka cellbrunnar som är mest ogenomträngliga för färgämnet, vilket begränsade utbudet av tekniken 10.

Nya förbättringar av Nilen Röda färgningsmetoden har rapporterats att kringgå de ursprungliga bristerna i protokollet 10,11. Färgning av cellerna i närvaro av en Carrier lösningsmedel som DMSO 10 eller etanol 10,11 linearizes sambandet mellan oljehalt och absorbans, vilket möjliggör tillförlitliga kvantitativa mätningar. Lösningsmedlet hjälper till att permeabilisera cellmembranet så att Nile Red molekyler kan passera igenom. Dessutom, med en spektrofotometer med mikroplatt läsning kapacitet möjliggör hög genomströmning protokoll som lämpar sig för kvantitativ analys.

I denna artikel kommer vi detalj en enkel metod för att mäta halten av algceller olja genom färgning kulturer med Nile Red i närvaro av etanol, ett milt lösningsmedel. För att på bästa sätt ta hänsyn till bakgrundsbrus i mätningarna, är en standardkurva som korrelerar fluorescensintensiteten för oljeinnehåll utvecklats med användning algceller med känd oljekompositionen. Metoden är anpassad från tidigare publicerade protokoll 10,11. Genom att använda en 96-brunns-spektrofotometer, är en möjlighet att analysera samma mängd prov i en timme that skulle ta dagar att följa med gravimetriska metoder. Dessutom, genom att kalibrera med hjälp av representativa urval av den önskade algarter denna metod ger relativt exakta mätningar som är direkt tolkningsbar. Det finns många protokoll som beskriver metoder för färgning alger med Nile Red optimerade för olika stammar och tillämpningar; protokollet presenteras här utvecklades ursprungligen av de la Hoz Siegler et al. 11 för Auxenochlorella protothecoides, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus och Scenedesmus obliquus, även om det är sannolikt lämplig för många fler arter och klasser. Den har utformats med särskild tillämpning av övervakning bioprocess prestanda och det fungerar lika bra för tidigare torkade proverna och våta prover från en växande kultur.

Protocol

1. Isolering av Dry algbiomassan som ska användas som standarder för fluorescens avläsningar Ta en provvolym från den växande algkulturen som kommer att ge minst 200 mg av torr biomassa, är 400-600 mg att föredra. Centrifugera provet vid 4 ° C under 10 min vid 10000 x g.. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten med en lika stor volym av fosfatbuffert formuleras till samma pH som den tillväxtmediet. Upprepa steg 1,2 för totalt 3 tvättsteg. Återsuspendera pelleten …

Representative Results

Representativa algceller färgats med Nile Red dye är avbildade i Figur 1. Delarna A och B i Figur 1 visar bilder av A. protothecoides vuxit utöver kväve, vilket leder till mycket låga intracellulära lipidackumulering. I delar C och D, prover av A. protothecoides odlas under kvävebegränsning visas. Enligt sändnings belysning, kan lipid organ cellen visualiseras med noggrann inspektion av <stron…

Discussion

Algerna används i standardkurvan måste vara samma art som odlas under samma försöksbetingelser som de som mäts. Betydande förändringar i mediesammansättning, odlingsteknik, och färgningsprotokollet kan påverka intensiteten i fluorescens läsning. Hexan extraktion (som beskrivs i avsnitt 1 och 2) användes för att bestämma den neutrala lipiden innehåll för prov använda i standardkurvan. För noggranna mätningar fluorescensintensiteten måste alla proverna analyseras vid samma koncentration av biomassa (5 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill tacka de naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada för att ge ekonomiskt stöd för detta projekt.

Materials

Dry Weight
25 ml disposable pipettes Fisher 13-676-10K
Pipette Bulb Fisher 13-681-51
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes Fisher 05-562-16A Teflon needed for hexane
Weigh Dishes (polypropylene) Fisher 2-202B
1.5 ml micro-centrifuge tubes Fisher 05-408-129
Centrifuge Sorvall RC6plus
Drying Oven (Fisher 625D) Fisher 13-254-2
Storage vials Fisher 0337-4
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) Fisher 05-40-100
Gravimetric Quantification
Porcelain Mortar (Coorstek) Fisher 12-961A
Porcelain Pestle (Coorstek) Fisher 12-961-5A
40 ml Centrifugation tubes (FEP) Fisher 05-562-16A Could also use glass tubes
Pasteur Glass Pipettes Fisher 13-678-20C
Aluminum weigh dishes Fisher 08-732-101
Hexanes Fisher H292-4
Fluorometric quantification of oil content
Fluorescence multi-well plate reader Thermo Lab Systems Fluoroskan Ascent
Fluorescence reader software Thermo Lab Systems Ascent Software 2.6
COSTAR 96 well plate with round bottom Fisher 06-443-2
Nile Red  Sigma N3013-100MG
Ethanol (Alcohol reagent grade) Fisher AC65109-0020
Imaging Fluorescent cells
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope Leica DMRXA2
Microscope slides Fisher 12-550-15
Microscope cover slips Fisher 12-541B
Camera Qimaging Retiga Ex
Imaging software Qimaging QCapture v.1.1.8

References

  1. Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).
  2. . National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , (2010).
  3. de la Hoz Siegler, H., et al. Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy. Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).
  4. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
  5. Hara, A., Radin, N. S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).
  6. Han, Y., et al. Review of methods used for microalgal lipid-content analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
  7. Pino, E. C., et al. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (73), (2013).
  8. Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).
  9. Izard, J., Limberger, R. J. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells. J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).
  10. Chen, W., et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).
  11. de la Hoz Siegler, H., et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures. Algal Res. 1, 176-184 (2012).
  12. de la Jara, A., et al. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii. J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).
  13. Elsey, D., et al. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).
  14. Feng, G. -. D., et al. Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination. Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).
  15. Guzmán, H., et al. Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions. Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).
  16. Huang, G. -. H., et al. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence. Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).
  17. Lee, S., et al. Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii. Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).
  18. Montero, M., et al. Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting. J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).
  19. Vigeolas, H., et al. Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus. J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).
  20. Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).
  21. Kou, Z., et al. Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii. J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).

Play Video

Cite This Article
Storms, Z. J., Cameron, E., de la Hoz Siegler, H., McCaffrey, W. C. A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence. J. Vis. Exp. (87), e51441, doi:10.3791/51441 (2014).

View Video