Summary
يوصف بروتوكول بسيط لتحديد محتوى الدهن محايدة من خلايا الطحالب باستخدام إجراء تلطيخ النيل الأحمر. هذه التقنية لتوفير الوقت يوفر بديلا للدهون البروتوكولات التقليدية الكمي القائم على الجاذبية. وقد تم تصميمه لتطبيق معين من الأداء رصد العمليات الحيوية.
Abstract
وتعتبر الطحالب المرشحين ممتازة لمصادر الوقود المتجددة بسبب قدرات التخزين الدهون الطبيعية. مراقبة قوية من عمليات التخمير الطحالب والكشف عن سلالات الغنية بالنفط الجديد يتطلب بروتوكول سريعة وموثوق بها لتحديد محتوى الدهون داخل الخلايا. الممارسات الحالية تعتمد إلى حد كبير على أساليب الجاذبية لتحديد نسبة الزيت، وضعت التقنيات منذ عقود التي هي مضيعة للوقت وتتطلب كميات عينة كبيرة. في هذه الورقة، يتم تضمينها النيل الأحمر، صبغة الفلورسنت التي تم استخدامها لتحديد وجود هيئات الدهون في أنواع عديدة من الكائنات الحية، إلى بروتوكول بسيطة وسريعة، وموثوقة لقياس المحتوى الدهني محايدة من protothecoides Auxenochlorella، خضراء الطحالب. يستخدم الأسلوب الإيثانول، مذيب خفيف نسبيا، لpermeabilize غشاء الخلية قبل تلطيخ و96 جيدا لوحة صغيرة لزيادة القدرة عينة خلال قياسات كثافة مضان. فقد كان تصميمإد مع تطبيق معين من الأداء رصد العمليات الحيوية. عينات المجففة سابقا أو عينات حية من ثقافة متنامية يمكن أن تستخدم في الفحص.
Introduction
نظرا لقدرتها على تخزين الدهون تحت بعض الهيئات ظروف الإجهاد، تلقى الطحالب قدرا كبيرا من الاهتمام في السنوات الأخيرة كمصدر للوقود المتجددة المحتملة 1،2. يمكن أن الدهون محايدة تمثل أكثر من 60٪ من الوزن الجاف خلية في ظل ظروف النمو المناسبة 3. بعد صناعة لايوجد بروتوكول موحد بسيطة ونظيفة وسريعة، وموثوق بها ل quantitate المحتوى الدهني للخلايا الطحالب من أجل رصد أداء العمليات الحيوية بشكل صحيح وتحليل الثقافات، وشاشة لسلالات جديدة.
تطوير أسلوب بليغ-داير الجاذبية منذ نحو 50 عاما لا تزال من بين الأساليب الأكثر شيوعا المستخدمة اليوم 4،5. في حين أن هذا الإجراء هو بسيط وموثوق بها، ويسهل حملها خارج، وأنها تستغرق وقتا طويلا، يتطلب حجم العينة كبير، ويجعل من استخدام المذيبات السامة. أنه ليس من العملي لتحليل العديد من العينات من شوط التخمير أو الكشف عن سلالات جديدة الغنية بالنفط. أساليب أخرى قد بالتابعين المتقدمة، ولكن عادة ما تتطلب المعدات المتطورة والتي لم يتم توحيدها 6.
البديل الذي قد حصل قدرا كبيرا من الاهتمام هو وصمة عار النيل الأحمر. وقد النيل الأحمر، وهي الصبغة التي تتفلور تفضيلي في بيئات غير القطبية، وتستخدم لتحديد أو تقدير الهيئات الدهون في الكائنات المختلفة بما في ذلك الديدان الخيطية 7، 8 الخميرة والبكتيريا 9، والطحالب 10-19. كانت التقنيات الأولية التي تنطوي على النيل الأحمر الغالب النوعي أو شبه الكمي، والجمع بين وصمة عار مع واحد أو القياس الطيفي كفيت التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك، بعض الفئات من الطحالب مثل الطحالب الخضراء لديهم آبار الخلية سميكة التي هي غير منفذة في الغالب إلى الصبغة، والتي تقتصر على مجموعة من تقنية 10.
وقد تم الإبلاغ عن التحسينات الأخيرة إلى أسلوب تلطيخ النيل الأحمر أن تجاوز أوجه القصور الأولي للبروتوكول 10،11. تلطيخ الخلايا في وجود كارهيئة الإنصاف والمصالحة المذيبات مثل DMSO 10 أو الإيثانول 10،11 linearizes العلاقة بين محتوى الزيت والامتصاصية، والسماح لقياسات كمية موثوق بها. المذيب يساعد permeabilize غشاء الخلية بحيث تكون جزيئات النيل الأحمر يمكن أن تمر من خلال. بالإضافة إلى ذلك، يشتمل على معمل مع قدرات القراءة لوحة صغيرة تمكن بروتوكولات إنتاجية عالية مناسبة للتحليل الكمي.
في هذه المادة ونحن من التفصيل طريقة بسيطة لقياس نسبة الزيت من الخلايا الطحلبية التي كتبها تلطيخ الثقافات مع النيل الأحمر في حضور الإيثانول، مذيب خفيف. من أجل معظم بدقة تمثل الضوضاء الخلفية في القياسات، تم تطوير منحنى القياسية ربط كثافة مضان لمحتوى الزيت باستخدام خلايا الطحالب من تكوين النفط المعروفة. ويتم تكييف طريقة من البروتوكولات نشرت سابقا 10،11. باستخدام مطياف 96 جيدا، هو واحد قادرا على تحليل نفس الكمية من العينات في ثا ساعةر سيستغرق يوما لمراقبة من قبل وسائل الجاذبية. وعلاوة على ذلك، من خلال معايرة باستخدام عينات تمثيلية من أنواع الطحالب المطلوبة هذه الطريقة تنتج قياسات دقيقة نسبيا التي هي للتفسير مباشرة. توجد العديد من البروتوكولات تحدد أساليب تلطيخ مع الطحالب النيل الأحمر الأمثل لسلالات والتطبيقات المختلفة؛ بروتوكول المعروضة هنا وضعت أصلا من قبل دي لا هوز سيجلر وآخرون 11 لprotothecoides Auxenochlorella، شلوريلا الشائع، Scenedesmus dimorphus، وScenedesmus المائلة، على الرغم من انها مناسبة المرجح لعدد أكبر من الأنواع والطبقات. قد تم تصميمه مع تطبيق معين من رصد الأداء والعمليات الحيوية أنها تعمل بشكل جيد على قدم المساواة للعينات المجففة سابقا وعينات الرطب من ثقافة متنامية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عزل الطحالب الكتلة الحيوية الجافة لاستخدامها معايير الإسفار قراءات
- إزالة وحدة تخزين عينة من ثقافة الطحالب المتزايدة من شأنها أن توفر ما لا يقل عن 200 ملغ من الكتلة الحيوية الجافة، 400-600 ملغ هو الأفضل.
- عينة الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 10،000 ز س. تجاهل طاف ويغسل بيليه مع حجم مساو من العازلة الفوسفات وضعت لنفس درجة الحموضة وسائل الاعلام النمو.
- كرر الخطوة 1.2 ليصبح المجموع 3 خطوات الغسيل.
- إعادة تعليق بيليه في غير المتأينة المياه ونقل إلى طبق وزنه قبل تزن. اسمحوا الجافة عند 50 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ملاحظة: التجفيف تحت فراغ سينخفض وقت التجفيف وتجفيف الثقافة في درجات الحرارة فوق 50 درجة مئوية قد تجعل من الصعب إعادة تعليق.
- متجر المجففة الثقافات الطحالب في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها في المستقبل.
2. الكمي الوزني من الدهون المحايدة التي كتبها الهكسين استخراج (مقتبس من بليغ وداير 4)
- قياس ما يقرب من 50 ملغ من الطحالب الكتلة الحيوية الجافة في وزن الطبق. ملاحظة: الجماهير تتراوح 40-80 ملغ يمكن استخدامها دون فقدان للاستنساخ.
- نقل الكتلة الحيوية إلى هاون غسلها مسبقا مع الهكسان. إذا لزم الأمر، وغسل تزن الطبق مع كمية صغيرة (1 مل) من الهكسان باستخدام ماصة باستور من أجل نقل تماما الكتلة الحيوية إلى الهاون. ملاحظة: الهكسين هو عبارة عن مادة شديدة التقلب والسامة. يجب التعامل معها في غطاء الدخان مع الملابس الواقية المناسبة.
- طحن الكتلة الحيوية للطحالب لمدة 5 دقائق باستخدام مدقة. تبدأ طحن لطيف وزيادة كثافة تدريجيا. طحن الكتلة الحيوية إلى عجينة غرامة وسلس في الفترة 5 دقائق. إذا تم استخدام الهكسان الزائدة عند نقل الكتلة الحيوية إلى الهاون، فمن الأفضل أن ننتظر الهكسان لتتبخر قبل طحن.
- إضافة بضع مل من الهكسان إلى الهاون ويخلط الناتج الطين مع مدقة حتى يتم المتجانس ذلك. التأكد من أن جميع الحطام الخلية انضمت إلى جدران موروطرقت القطران حرة وعلقت في السائل.
- نقل الخليط كتلة خلايا الهكسان إلى أنبوب الطرد المركزي. ملاحظة: يجب أن يكون أنبوب الطرد المركزي إما الزجاج أو البوليمر مناسبة متوافقة مع الهكسان مثل التفلون.
- كرر الخطوات من 2.4 و 2.5 حتى يتم نقل جميع الكتلة الحيوية إلى أنبوب الطرد المركزي (3-5X).
- الطرد المركزي العينة عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في 10،000 ز س.
- ماصة بعناية طاف في المعادن وزنه قبل تزن الطبق. تخزين في غطاء الدخان.
- إجراء استخراج 2 الثانية الهكسان بإضافة 3 مل من الهكسان لبيليه وبقوة vortexing لمدة 1 دقيقة.
- كرر الخطوات من 2.7 و 2.8. إذا لزم الأمر، قم بتشغيل العينات لمدة 30 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي أثناء استخراج الثاني لضمان كل الحطام الخلية يستقر بالكامل. تحديد كتلة من النفط المستخرج gravimetrically بعد الهكسان قد تبخرت تماما.
3. فلوروميتريك الكمي من الدهون المحايدة عن طريق النيل الأحمر (كما حرية تقريرتيد من قبل دي لا هوز سيجلر وآخرون 11)
ملاحظة: هناك حاجة فقط 10 ميكرولتر لتعليق الطحالب في 5 ز / L لقراءة مضان. عموما، والعزلة من الكتلة الحيوية الطحالب الجافة من 1.5 مل من مرق الثقافة هي أكثر من كافية. أيضا، لشدة ضوء المصباح في معمل يمكن أن تتحلل بمرور الوقت. فمن المستحسن أن تشمل المعايير في كل تجربة للتأكد من أن الاختلافات في الصك لا تضيف الخطأ غير الضرورية إلى القياسات.
- إعداد الحل النيل الأحمر بتركيز 10 ميكروغرام / مل الذائبة في الكحول كاشف الصف الايثانول. تخزين هذا الحل في الظلام في 4 درجات مئوية.
- إعداد 30٪ (V / V) حل الإيثانول في الماء منزوع الأيونات وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد جميع عينات الطحالب في تركيز الكتلة الحيوية نفسها (ينصح 5 ز / L) وبنفس الطريقة والمعايير المستخدمة في القياس. القيام بذلك عن طريق إما بتعليق عينات ما قبل المجففة في كمية مناسبةمن العازلة الفوسفات (0.6 غرام / لتر ثنائي القاعدة فوسفات البوتاسيوم، و 1.4 غرام / لتر البوتاسيوم أحادى فوسفات)، أو ضبط تركيز ثقافة الطحالب المتزايدة إلى 5 ز / L مع العازلة الفوسفات بعد قياس العكارة. ملاحظة: القياسات التي أجريت على الثقافات الحية الطحالب وغالبا ما يكون خطأ أكبر المرتبطة بها اعتمادا على الدقة من منحنى المعايرة التعكر. إعادة التعليق عينات المجففة قد تتطلب استخدام الخالط لتفريق بالكامل الكتلة الحيوية.
- لكل عينة، مزيج 80 ميكرولتر من الحل الايثانول 30٪، و 10 ميكرولتر من الحل النيل الأحمر، و 10 ميكرولتر من تعليق الطحالب في بئر واحدة من 96 لوحة جيدا. من أجل حساب صحيح لتنوع قياس مضان، نفذ 5 مكررات من كل عينة.
- تشغيل منحنى المعايرة نقطتين مع معايير معدة مسبقا وذلك لحساب ليوم ليوم الاختلافات في الصك والتحضير. إعداد معايير لقياس مضان باستخدام قالإجراء AME كما العينات. ملاحظة: عموما نقطتين كافية لإعادة تقويم الصك، يمكن تشغيل ثلاث نقاط للتحقق الخطي.
- إجراء قياسات مضان في متعددة جيدا قارئ لوحة طيفي. عثر على الشروط التالية لتسفر عن نتائج أكثر اتساقا 11:
- يهز في 1،200 دورة في الدقيقة، مدار 3 مم، لمدة 30 ثانية.
- احتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- يهز في 1،200 دورة في الدقيقة، مدار 3 مم، لمدة 30 ثانية.
- سجل مضان، الإثارة في 530 نانومتر، والانبعاثات في 604 نانومتر.
- تحويل القياسات مضان لمحتوى الزيت باستخدام النتائج من المعايير الداخلية.
4. مضان المجهري تقنيات
ملاحظة: تم تصميم بروتوكول تلطيخ الموضحة في قسم 3 للتحليل الكمي، ولكن يمكن أيضا أن تكون مفيدة لتوفير تمثيل مرئي من التقنيات المعتمدة وصمة عار للمؤسسات التعليمية والتوضيحية بوrposes. لإنتاج صور من عينة واحدة يتطلب مضان المجهر الضوئي مع انتقال وإضاءة إضافية epifluorescence المصادر التقليدية. الإثارة وانبعاث ضوء المرشحات في 530 نانومتر (الأخضر) و 604 نانومتر (الأحمر) مجموعة، على التوالي، وهناك حاجة لنهر النيل وصمة عار الأحمر فضلا عن كاميرا محمولة المجهر مع البرامج المرتبطة بها. تم الحصول على الصور المبينة في هذه الدراسة (الشكل 1) باستخدام مجهر حقل مشرق مجهزة الكاميرا وأحادية اللون لتحويل RGB حدة. ويرد الإجراء لإنتاج النيل الأحمر الصور مضان باستخدام هذه الأدوات أدناه:
- إعداد عينة الثقافة مع وصمة عار النيل الأحمر وفقا للمادة 3 من البروتوكول. ملاحظة: عينة في نطاق تركيز 5 جم / لتر تنتج الشرائح من كثافة الخلية كافية دون اكتظاظ.
- بعد الانتهاء من الخطوة 3.6 من البروتوكول تلطيخ، وإعداد شريحة المجهر من العينة المجهزة وفقا لإجراءات المختبر القياسية.
- بدءا من المجهر في وضع الإرسال، تحميل أعدت الشريحة في المجهر، وتحديد موقع الخلايا على التكبير المطلوب (تم الحصول عليها الصور المبينة في هذه المادة بهدف 100X).
- مرة واحدة مركزة، تبديل المجهر من انتقال لوضع الإضاءة epifluorescence. مصدر الضوء ينبغي الآن تأتي مباشرة من العدسة الشيئية (هذا يمكن التأكد بصريا من خلال مراقبة الفضاء بين الشرائح وعدسة الهدف).
- إدراج مرشح الإثارة الخضراء في مصدر الضوء ومرشح الانبعاثات الحمراء في مسار الضوء المراقبة؛ يجب أن يكون مضان من الخلايا الملون الآن مرئية مباشرة من خلال العدسة.
- تبديل وضع المراقبة المجهر من العدسة إلى كاميرا محمولة واستخدام برامج عرض لالتقاط صورة للخلايا الاستشعاع. تبعا لحساسية الكاميرا، قد لا تظهر العينة في البداية في إطار المعاينة (أي الشاشة سوفتكون سوداء)؛ لتصحيح هذا، وضبط وقت التعرض وكسب الكاميرا إلى المستوى الذي كانت الخلايا مرئية. سوف تختلف إعدادات محددة مع الأدوات والمعدات، وأنواع الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وصفت الخلايا الطحلبية ممثل ملطخة النيل الأحمر صبغ في الشكل 1. الجزأين ألف وباء من الشكل 1 عرض الصور A. protothecoides نمت في النيتروجين الزائد، مما يؤدي إلى تراكم الدهون منخفضة جدا داخل الخلايا. في أجزاء C و D، وعينات من A. وتظهر protothecoides نمت في ظل قيود النيتروجين. تحت إضاءة انتقال، يمكن تصور الهيئات الدهون من الخلايا مع تفتيش دقيق من الشكل 1C، حيث تبدو وكأنها هياكل دائرية لامعة ويشكل الغالبية العظمى من حجم الخلية. الخلايا هو موضح في الشكل 1A، والتي كانت تزرع في النيتروجين الزائد، هي النفط 5٪ فقط من وزنها الجاف و لا تحتوي على مستويات كبيرة من الهيئات الدهون.
عندما يظهر تحت ظروف الإضاءة المناسبة، وتضخيم الاختلافات في هذه العينات. الخلايا النفط العجافتظهر حلقات الفلورسنت مع الهيئات الظلام (الشكل 1B)، في حين عرض الخلايا الغنية بالنفط توهج البرتقالي والاحمر مشرق حيث تراكمت الجثث الدهون (الشكل 1D). في الشكل 1D، فإنه من الصعب أن نرى مضان خافت من غشاء الخلية وهياكل الخلية الأخرى. سوف النيل الأحمر يتألق في وجود بروتينات غير القطبية وكذلك الدهون، وهذا هو السبب غشاء الخلية والهياكل الخلوية الأخرى توفير مستوى خلفية مضان خلال قياسات معمل.
في ظل الظروف الأمثل من الفحص، منحنيات المعايرة مع R 2 قيم أكبر من 0.980 قابلة للتحقيق بسهولة (الشكل 2A). العلاقة بين محتوى الزيت الخلية ومضان يصبح غير الخطية إذا هي ملطخة الخلايا في حل تفتقر إلى الناقل المذيبات مثل الايثانول. البيانات المقدمة في الشكل 2B، مع R 2 من 0.395، و 60؛ تم الحصول عليها من خلال تنفيذ البروتوكول في محلول الإيثانول 0٪ (منزوع الأيونات الماء النقي).
الرقم 1. صور A. protothecoides ملطخة النيل الأحمر. عينة النفط العجاف (نسبة الزيت 4.4٪ من الوزن الجاف) يظهر تحت A) التي تنتقل عن طريق المجهر الضوئي وباء) إضاءة epifluorescence مع مرشح الإثارة الأخضر (510 نانومتر). الهيئات الدهون ملطخة النيل الأحمر يتألق في 604 نانومتر. وأظهرت عينة الغنية بالنفط (محتوى الزيت 54.7٪ من حيث الوزن الجاف) في C) وD) تحت نفس الظروف وتنتقل ضوء epifluorescence كما A) و B)، على التوالي. NK "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. منحنيات المعايرة ربط محتوى النفط من A. ، تم إعداد عينات protothecoides لكثافة مضان. في A) وفقا للبروتوكول وصفها. في B)، تم إعداد العينات في محلول الإيثانول 0٪ (الماء منزوع الأيونات). أشرطة الخطأ الرأسي تمثل الانحراف المعياري من خمسة مكررات في معمل. تقرير أشرطة الخطأ الأفقية الانحراف المعياري لا تقل عن ثلاثة مكررات من الجاذبية الكمي من الدهون محايدة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
| مادة كيميائية | شركة | تركيز |
| KH 2 PO 4 | فيشر العلمية | 2.8 ز L -1 · |
| K 2 هبو 4 | فيشر العلمية | 1.2 غرام · L -1 |
| MgSO 4 · 7H 2 O | فيشر العلمية | 1.2 غرام · L -1 |
| FESO 4 · 7H 2 O | فيشر العلمية </ الدفتيريا> | 48 ملغ · L -1 |
| H 3 BO 3 | فيشر العلمية | 11.6 ملغ · L -1 |
| و CaCl 2 · 2H 2 O | فيشر العلمية | 10 ملغ · L -1 |
| MnCl 2 · 4H 2 O | فيشر العلمية | 7.2 ز L -1 · |
| ZnSO 4 · 7H 2 O | فيشر العلمية | 0.88 ملغ · L -1 |
| كبريتات النحاس 4 · 5H 2 O | الجبهة الاسلامية للانقاذلها العلمية | 0.32 ملغ · L -1 |
| نا 2 زارة النفط 4 · 4H 2 O | فيشر العلمية | 0.12 ميكروغرام · L -1 |
| الثيامين هيدروكلوريد | فيشر العلمية | 40 ميكروغرام · L -1 |
| جلوكوز | فيشر العلمية | 30 ز · L -1 |
| الجلايسين | فيشر العلمية | 0،2-2،0 ز L -1 · |
الجدول 1. الثقافة وسائل الإعلام وصفة. وكانت جميع الكواشف الصف التحليلية.تم إعداد الحلول باستخدام الماء منزوع الأيونات. تم استخدام تركيز الجلايسين للسيطرة على الكربون إلى نسبة النيتروجين في الثقافة وبالتالي، فإن نسبة الزيت من الطحالب النهائي. واستخدمت الخلايا تتراوح من 8.5٪ إلى 55٪ محتوى الدهون محايدة من الكتلة (على أساس جاف) لجعل منحنى القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يجب أن تكون الطحالب المستخدمة في منحنى القياسية نفس الأنواع المزروعة تحت نفس الظروف التجريبية مثل تلك التي يجري قياسها. تغييرات كبيرة في تكوين وسائل الإعلام، وتقنية زراعة، وبروتوكول تلطيخ يمكن أن تؤثر على شدة القراءة مضان. وقد استخدم استخراج الهكسان (الموصوفة في المادتين 1 و 2) لتحديد محتوى الدهن محايدة من العينات المستخدمة في منحنى القياسية. لقياسات دقيقة كثافة مضان، يجب تحليل جميع العينات في تركيز الكتلة الحيوية نفسها (استخدمت 5 ز / L في هذه الدراسة). ويمكن بعد ذلك محتوى الزيت تحدد بسهولة من خلال المقارنة إلى منحنى القياسية. لهذا البروتوكول، تم الانتهاء من زراعة الطحالب في قوارير هزة في ظل ظروف متغايرة (28 درجة مئوية، 100 دورة في الدقيقة) مع الجلوكوز كمصدر للكربون (30 جرام / لتر) والجلايسين كمصدر النيتروجين (0،2-2،0 غرام / لتر). عن وصفة وسائل الإعلام مفصلة، انظر الجدول رقم 1.
أحد الاعتبارات الهامة في تنفيذالبروتوكول هو الظروف لتجفيف الكتلة الحيوية الطحالب الرطب عند إعداد منحنى القياسية. ينصح فرن الفراغ عند 45 درجة مئوية. وسوف الفرن التقليدي في 45-50 درجة مئوية تكفي أيضا طالما يتم السماح وقتا إضافيا حتى يجف تماما العينات (24-48 ساعة). درجات الحرارة فوق 50 درجة مئوية قد يسبب الكتلة الحيوية لتلتحم مع بعضها أو تشكل القشرة التي لا يمكن اختراقها بسهولة في resuspend العازلة الفوسفات. يمكن بمساعدة إعادة تعليق مع استخدام الخالط. إضافات كيميائية مثل السطحي أو قاعدة قوية يجب تجنبها وهذه عادة ما تؤثر على القراءة مضان. ويمكن تخزين الثقافات المجففة لمدة تصل إلى 6 أشهر في حاوية مغلقة دون ان تشهد تدهور كبير الدهون. لاحظ أن القياسات التي أجريت على الثقافات الحية الطحالب وغالبا ما يكون خطأ أكبر المرتبطة بها اعتمادا على الدقة من منحنى المعايرة التعكر.
وهناك اعتبار آخر هو تركيز الإيثانول المستخدم لتشغيل عصيدةليه في قارئ لوحة صغيرة. يعمل الايثانول كمذيب الناقل، وتسهيل نقل الجزيئات النيل الأحمر في الخلية. في تركيزات منخفضة (<30٪) العلاقة بين محتوى الزيت ومضان يصبح غير الخطية بسبب سوء الانتشار عبر غشاء الخلية (الشكل 2B). في تركيزات أعلى من الإيثانول، ويتم الحصول تحسين الخطي على حساب انخفاض كثافة مضان (الشكل 2A). للprotothecoides Auxenochlorella، وجد شلوريلا الشائع، Scenedesmus dimorphus، وScenedesmus المائلة، تركيز الإيثانول بنسبة 30٪ لإعطاء الأمثل مفاضلة بين تحسين الخطي وانخفضت كثافة مضان 11. قد يكون من الضروري لضبط تركيز الإيثانول لتحسين النتائج بالنسبة للكائنات الأخرى.
اختيار الإثارة وانبعاث موجات المناسب لقراءة مضان في عينات الطحالب أمر حاسم ل ensuإعادة فقط الدهون محايدة يتم تضمينها في القياس. سوف النيل الأحمر كثافة مضان تختلف في أطوال موجية مختلفة تعتمد على قطبية البيئة 11،13. لA. protothecoides، ويلاحظ ذروة الانبعاثات عن الدهون محايدة في 590 نانومتر؛ ذروة الثانوية يمثلون نسبة الدهون أكثر القطبية يمكن ملاحظتها في 645 نانومتر 11. وبالتالي، تم إجراء قياسات كثافة مضان المبينة في هذا الإجراء باستخدام فلتر الإثارة 530 نانومتر، مع نصف الفرقة العرض = 10 نانومتر، وتصفية الانبعاثات 604 نانومتر، مع نصف عرض النطاق الترددي = 10 نانومتر. وينبغي التحقق من اختيار الإثارة والطول الموجي الانبعاثات لكل سلالة الطحالب اختبارها.
منذ النيل الأحمر سوف يتألق في أي بيئة غير القطبية، وسوف يتم الكشف عن هياكل الخلية بالإضافة إلى الهيئات الدهون من قبل معمل (انظر الشكل 1B). هذه الحقيقة، جنبا إلى جنب مع عدم التجانس المتأصل في الكتلة الحيوية الخلية، ويؤدي إلى وجود علاقة غير خطية بينالكتلة الحيوية الخلية ومضان 11. يتم حل هذه المشكلة عن طريق ضمان يتم إعداد جميع العينات في الوزن الجاف المستمر (5 ز / L مستحسن). بتركيزات تمييع يصبح إشارة خافت واتجاهاته يصعب تمييز. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الإشارة مضان تكون صاخبة بسبب خلية الى خلية الاختلافات وتعليق الجسيمات في وسائل الإعلام. بالتالي، ينصح 5 مكررات من كل عينة للحصول على نتائج موثوقة 11.
بعض البروتوكولات استخدام معيار النفط مثل ثلاثي الأولين لمعايرة قياس 10،20،21. في حين تم الإبلاغ عن هذه التقنية بنجاح لأنواع معينة من الطحالب مثل العصوية وDinophyceae، فمن أقل ملاءمة للطحالب سميكة الجدران مثل شلوريلا بسبب القيود نشرها عبر غشاء الخلية. وعلاوة على ذلك، فإن إضافة ثلاثي الأولين قد تعكر صفو توزيع جزيئات النيل الأحمر بين المعيار والهيئات الدهون، مما يؤدي رس تقديرات غير دقيقة لمحتوى الزيت. باستخدام عينات الطحالب من محتوى الزيت المعروفة باسم معايير يتجنب هذا النقص المحتملة وحسابات لأي مضان الخلفية التي سببتها الكتلة الحيوية والنمو الظروف.
بروتوكول المعروضة في هذه الدراسة توفر طريقة بسيطة ورخيصة وسريعة لقياس نسبة الدهون محايدة في عينات الطحالب. باستخدام لوحة متعددة جيدا، وتتحقق الانتاجية عينة عالية مع تحقيق وفورات وقتا كبيرا عبر بروتوكولات تلطيخ الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، فقد تم تحسين شروط الفحص لتسفر عن الاتجاهات الخطية استنساخه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا لتوفير الدعم المالي لهذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur glass pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
- Chisti, Y.
- National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , Available from: http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf (2010).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy. Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Hara, A., Radin, N. S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).
- Han, Y., et al. Review of methods used for microalgal lipid-content analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Pino, E. C., et al. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).
- Izard, J., Limberger, R. J. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells. J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).
- Chen, W., et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures. Algal Res. 1, 176-184 (2012).
- de la Jara, A., et al. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii. J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).
- Elsey, D., et al. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).
- Feng, G. -D., et al. Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination. Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).
- Guzmán, H., et al. Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions. Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).
- Huang, G. -H., et al. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence. Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).
- Lee, S., et al. Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii. Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).
- Montero, M., et al. Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting. J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).
- Vigeolas, H., et al. Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus. J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).
- Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).
- Kou, Z., et al. Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii. J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).
