Summary
פרוטוקול פשוט כדי לקבוע את תוכן שומנים הניטרלי של תאי אצות באמצעות הליך מכתים הנילוס אדום מתואר. טכניקה לחיסכון בזמן זה מציעה אלטרנטיבה לפרוטוקולי כימות מסורתיים מבוסס gravimetric שומנים בדם. זה תוכנן עבור היישום הספציפי של ביצועי Bioprocess הניטור.
Abstract
אצות נחשבות מועמדים מצוינים למקורות דלק מתחדשים בשל יכולות אחסון שומנים הטבעיים שלהם. ניטור חזק של תהליכי תסיסה של אצות והקרנה לזנים עשירים בנפט חדש מחייב פרוטוקול מהיר ואמין לקביעת תוכן שומנים תאיים. שיטות קיימות כיום מסתמכות במידה רבה על שיטות gravimetric כדי לקבוע תכולת שמן, טכניקות שפותחו לפני עשרות שנים, כי הם זמן רב ודורשות כמויות מדגם גדולות. במאמר זה, הנילוס האדום, צבע פלואורסצנטי שכבר נעשה שימוש כדי לזהות את נוכחותם של גופי שומנים בסוגים רבים של אורגניזמים, הוא שולב בפרוטוקול פשוט, מהיר, ואמין למדידת התוכן הניטרלי שומנים של protothecoides Auxenochlorella, ירוק אצה. השיטה משתמשת אתנול, ממס מתון יחסית, לpermeabilize קרום התא לפני הצביעה ו96 גם מיקרו צלחת כדי להגדיל את קיבולת המדגם במהלך מדידות עוצמת הקרינה. זה כבר עיצובאד עם היישום הספציפי של ביצועי Bioprocess הניטור. דגימות מיובשות בעבר או דוגמאות חיות מתרבות הולך וגדל ניתן להשתמש בassay.
Introduction
בשל יכולתם כדי לאחסן גופי שומנים בדם בתנאי לחץ מסוימים, אצות קיבלו תשומת לב רבה בשנים האחרונות כמקור דלק מתחדש פוטנציאל 1,2. שומנים ניטראליים יכולים להסביר מעל 60% מהמשקל היבש של התאים בתנאי גידול מתאימים 3. עם זאת, התעשייה אין פרוטוקול סטנדרטי פשוט, נקי, מהיר, אמין ולכמת תוכן שומנים של תאי אצות על מנת לפקח כראוי ביצועי Bioprocess, לנתח תרבויות, ומסך לזנים חדשים.
שיטת gravimetric בליי-דייר שפותחה לפני כמה שנים 50 נותרת בין הטכניקות הנפוצות ביותר בשימוש כיום 4,5. בעוד הליך זה הוא פשוט, אמין, וקל לביצוע, זה זמן רב, מחייב כרכי מדגם גדולים, ועושה שימוש בחומרים רעילים. זה לא מעשי לניתוח דגימות רבות מריצת תסיסה או הקרנה לזנים עשיר בנפט חדש. בשיטות אחרות יש בeen מפותח, אבל בדרך כלל דורש ציוד מתקדם ולא תוקננו 6.
אלטרנטיבה שצברה עניין רב היא כתם הנילוס האדום. הנילוס האדום, צבע שהמאיר מעדיף בסביבות שאינן קוטביות, בו נעשה שימוש כדי לזהות או לכמת גופי שומנים באורגניזמים שונים, כולל נמטודות 7, 8 שמרים, חיידקים 9, ואצות 10-19. טכניקות ראשוניות מעורבת הנילוס האדום היו בעיקר איכותיות או חצי כמותית, המשלבות את הכתם עם spectrophotometry היחיד קובט או cytometry זרימה. בנוסף, יש כמה סוגים של אצות כגון אצות ירוקות בארות תא עבות המכילות בעיקר בלתי חדירים לצבע, שהגביל את הטווח של הטכניקה 10.
השיפורים אחרונים בשיטת צביעת הנילוס האדומה כבר דיווחו העוקפים את החסרונות הראשוניים של הפרוטוקול 10,11. מכתים את התאים בנוכחות קארier ממס כגון DMSO 10 או 10,11 אתנול linearizes הקשר בין תכולת שמן וספיג, המאפשר מדידות כמותיות אמינות. הממס עוזר permeabilize קרום התא, כך שמולקולות הנילוס האדומים יכולות לעבור דרכו. בנוסף, שילוב ספקטרופוטומטר עם יכולות קריאת מיקרו צלחת מאפשר פרוטוקולי תפוקה גבוהים המתאימים לניתוח כמוני.
בפירוט שמאמר זה שיטה פשוטה למדידת תכולת שמן של תאי אצות על ידי צביעת תרבויות עם הנילוס האדום בנוכחות של אתנול, ממס מתון. על מנת אופן מדויק ביותר להסביר את רעש רקע במדידות, עקומת סטנדרט מקשרת עוצמת הקרינה לתוכן שמן היא פותח באמצעות תאי אצות של הרכב נפט ידוע. השיטה מותאמת מפרוטוקולים שפורסמו בעבר 10,11. באמצעות ספקטרופוטומטר 96 היטב, אחד הוא מסוגל לנתח את אותה הכמות של דגימות בשעה thaלא היה לוקח ימים כדי לפקח על ידי שיטות gravimetric. יתר על כן, על ידי כיול באמצעות מדגמים מייצגים של מיני אצות הרצויים בשיטה זו מייצרת מדידות מדויקות יחסית אשר מתייחסות ישירות לפירוש. קיימים פרוטוקולים רבים מתאר שיטות של מכתים את האצות עם הנילוס האדום מותאמים לזנים ויישומים שונים; הפרוטוקול המובא כאן פותח במקור על ידי דה לה הוז סיגלר ואח'. 11 לprotothecoides Auxenochlorella, vulgaris כלורלה, dimorphus Scenedesmus, וobliquus Scenedesmus, למרות שסביר להניח מתאים למינים רבים נוספים וכיתות. זה תוכנן עם היישום הספציפי של ביצועי Bioprocess ניטור וזה עובד באותה המידה גם עבור דגימות מיובשות בעבר ודגימות רטובות מתרבות הולך וגדל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידוד של האצות יבשים ביומסה כדי לשמש תקנים לקריאות הקרינה
- הסר את נפח דגימה מהתרבות של אצות גוברת כי תספק לפחות 200 מ"ג של ביומסה היבשה, 400-600 מ"ג הוא עדיף.
- צנטריפוגה מדגם ב C ° 4 10 דקות ב 10,000 X גרם. בטל supernatant ולשטוף את הכדור עם נפח שווה של חיץ פוספט גיבש לאותו pH כתקשורת הצמיחה.
- חזור על שלב 1.2 עבור סכום כולל של 3 שלבי כביסה.
- Re-להשעות גלולה במי דה המיונן ולהעביר לצלחת מראש שקל-לשקול. בואו יבש ב-C ° 50 ל48 שעות. הערה: ייבוש תחת ואקום יקטן זמן ייבוש וייבוש התרבות בטמפרטורות מעל 50 מעלות צלזיוס עלולה לגרום resuspension קשה.
- תרבויות אצות חנות מיובשות בטמפרטורת חדר לשימוש עתידי.
2. כימות Gravimetric של שומנים ניטרלי בהקסאן הפקה (מעובד מתוך בליי ו4 דייר)
- מדוד כ 50 מ"ג ביומסה של אצות יבשות בצלחת לשקול. הערה: המונים הנעים 40-80 מ"ג יכולים לשמש ללא הפסד של שחזור.
- העבר ביומסה למרגמה מראש נשטף עם הקסאן. במידת צורך, לשטוף את הצלחת לשקול עם כמות קטנה (1 מיליליטר) של הקסאן באמצעות פיפטה פסטר כדי להעביר לחלוטין ביומסה למרגמה. הערה: הקסאן הוא חומר נדיף והרעיל ביותר. זה חייב להיות מטופל במנדף עם בגדי מגן מתאימים.
- לטחון ביומסה של אצות למשך 5 דקות באמצעות העלי. בגין עם טחינה עדינה ולהגביר את העצימות בהדרגה. לטחון ביומסה למשחה עדינה וחלקה בתקופה 5 דקות. אם הקסאן העודף משמש בעת העברה ביומסה למרגמה, עדיף לחכות להקסאן להתאדות לפני הטחינה.
- הוסף כמה מיליליטר של הקסאן למרגמה ומערבבים את התערובת וכתוצאה מכך עם העלי עד שהוא הומוגני. ודא שכל פסולת התא דבקה בקירות של מורזפת הם דפקו חופשיים ותלויים בנוזל.
- מעביר את התערובת ההמונית הקסאן התאים לצינור צנטריפוגות. הערה: צינור צנטריפוגות חייב להיות או זכוכית או פולימר מתאים בקנה אחד עם הקסאן כמו טפלון.
- חזור על שלבים 2.4 ו2.5 עד שכל ביומסה הועברה לצינור צנטריפוגות (3-5x).
- צנטריפוגה המדגם ב C ° 4 ל20 דקות ב 10,000 X גרם.
- זהירות פיפטה את supernatant לתוך מתכת שקלה מראש לשקול מנה. אחסן במנדף.
- מבצע חילוץ 2 nd הקסאן על ידי הוספת 3 מיליליטר של הקסאן לגלולה וvortexing במרץ דקות 1.
- חזור על שלבים 2.7 ו2.8. במידת צורך, להפעיל את הדגימות למשך 30 דקות בצנטריפוגות במהלך החילוץ השני כדי להבטיח את כל פסולת התא מתיישבת באופן מלא. קביעת מסה של שמן מופק gravimetrically לאחר הקסאן התאדה לחלוטין.
3. Fluorometric כימות של שומנים ניטרלי באמצעות הנילוס האדום (כreporטד על ידי דה לה הוז סיגלר ואח'. 11)
הערה: רק 10 μl של השעיה אצות ב5 גר '/ ליטר נחוץ לקריאת הקרינה. באופן כללי, בידוד של יומסה של אצות יבשות מ1.5 מיליליטר של מרק התרבות הוא יותר מהדרוש. כמו כן, עוצמת האור של המנורה בספקטרופוטומטר יכולה לפגוע לאורך זמן. מומלץ לכלול בתקנים בכל ניסוי, כדי להבטיח ששינויים במכשיר לא מוסיפים שגיאה מיותרת למדידות.
- הכן פתרון הנילוס אדום בריכוז של 10 / מיקרוגרם מיליליטר מומס באתנול כיתה מגיב אלכוהול. אחסן את הפתרון הזה בחושך ב 4 ° C.
- הכן פתרון אתנול 30% (v / v) במים וחנות deionized ב 4 ° C.
- הכן את כל הדגימות של אצות באותו הריכוז ביומסה (5 גר '/ ליטר מומלץ) ובדיוק באותה צורה כמו בסטנדרטים המשמשים במדידה. עושה זאת על ידי שני דוגמאות מיובשות מראש המתלים בכמות המתאימהשל חיץ פוספט (dibasic אשלגן זרחה 0.6 גר '/ ל', monobasic 1.4 גר '/ L אשלגן פוספט), או התאמת הריכוז של תרבות של אצות גדלה עד 5 גר' / ליטר עם חיץ פוספט לאחר מדידת העכירות. הערה: לעתים קרובות יש מדידות שבוצעו בתרביות של אצות חיות שגיאה גדולה יותר הקשורים בהם בהתאם לדיוק של עקומת כיול עכירות. Resuspending דגימות יבשות עשוי לדרוש השימוש בhomogenizer לפזר ביומסה באופן מלא.
- עבור כל דגימה, לערבב 80 μl של פתרון אתנול 30%, 10 μl של פתרון הנילוס האדום, ו10 μl של השעיה אצות בבאר אחד של צלחת 96 היטב. כדי להסביר כראוי לשונות של מדידת הקרינה, לבצע 5 חזרות של כל דגימה.
- הפעל עקום כיול של שתי נקודות עם סטנדרטים שהוכנו קודם לכן על מנת לתת דין וחשבון לוריאציות היום יום במכשיר וההכנה. הכן את הסטנדרטים למדידת הקרינה באמצעות sהליך ame כדוגמאות. הערה: באופן כללי שתי נקודות מספיקות לכיול של המכשיר, ניתן להפעיל שלוש נקודות כדי לאמת את הליניאריות.
- לבצע מדידות הקרינה בספקטרופוטומטר צלחת קורא רב גם. התנאים הבאים נמצאו להניב תוצאות עקביות ביותר 11:
- לנער ב1,200 סל"ד, מסלול 3 מ"מ, ל30 שניות.
- לדגור על 40 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- לנער ב1,200 סל"ד, מסלול 3 מ"מ, ל30 שניות.
- שיא הקרינה, עירור ב 530 ננומטר, פליטה ב 604 ננומטר.
- להמיר את מדידות הקרינה לתוכן שמן באמצעות התוצאות מהסטנדרטים הפנימיים.
4. טכניקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי
הערה: הפרוטוקול מכתים המתואר בסעיף 3 מיועד לניתוח כמוני, אבל זה גם יכול להיות שימושי כדי לספק ייצוגים חזותיים של טכניקות המבוסס על כתם במשך pu החינוכי וההמחשהrposes. כדי להפיק תמונות של הקרינה מדגם אחד דורש מיקרוסקופ אופטי עם מקורות שידור ותאורת epifluorescence נוסף מסורתיים. מסנני אור עירור והפליטה בטווח 530 ננומטר (ירוק) ו604 ננומטר (אדום), בהתאמה, יש צורך בכתם האדום הנילוס, כמו גם מצלמה מותקנת מיקרוסקופ עם התוכנה נלווית. התמונות מוצגות במחקר זה (איור 1) נרכשו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר מצויד במצלמה ומונוכרום ליחידת ממיר RGB. ההליך להפקת תמונות הקרינה הנילוס אדום שימוש בכלים אלה הוא המפורטים להלן:
- הכן מדגם תרבות עם הכתם האדום הנילוס על פי סעיף 3 לפרוטוקול. הערה: מדגם בטווח ריכוז 5 גר '/ ליטר מייצר שקופיות של צפיפות תאים נאותה ללא צפיפות.
- לאחר השלים שלב 3.6 של הפרוטוקול מכתים, להכין שקופיות מיקרוסקופ של מדגם מעובד על פי נהלי מעבדה סטנדרטיים.
- החל עם מיקרוסקופ במצב שידור, טען את השקופיות שהוכנו למיקרוסקופ, ולאתר את התאים בהגדלה הרצויה (תמונות מוצגות במאמר זה נרכשו במטרה 100X).
- ברגע שהתמקד, לעבור למיקרוסקופ מהעברה למצב תאורת epifluorescence. מקור האור צריך להיות עכשיו מגיע ישירות מהעדשה האובייקטיבית (זה יכול להיות אישר באופן חזותי על ידי התבוננות במרחב שבין השקופיות והעדשה האובייקטיבית).
- הכנס מסנן עירור ירוק למקור האור ומסנן פליטת אדום לתוך נתיב תצפית האור; הקרינה של התאים המוכתמים צריכה עכשיו להיות גלויה ישירות דרך העינית.
- לעבור את מצב תצפית מיקרוסקופ מהעינית למצלמה המותקן ומשתמש בתוכנת צפייה ללכוד תמונה של תאי fluorescing. בהתאם לרגישות של המצלמה, המדגם לא ייתכן בתחילה מופיע בחלון התצוגה המקדימה (כלומר המסךלהיות שחור); כדי לתקן את זה, להתאים את זמן החשיפה ורווח של המצלמה לרמה שבה התאים גלויים. הגדרות ספציפיות תשתנה עם מכשירים, ציוד וסוגי תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאי אצות נציג מוכתמים בצבע אדום הנילוס מתוארים באיור 1. החלקים A ו-B של תמונות תצוגת איור 1 א protothecoides גדל בחנקן עודף, מה שמוביל להצטברות שומנים תאית נמוכה מאוד. בחלקי C ו-D, דגימות של א ' protothecoides גדל תחת מגבלת חנקן מוצג. תחת תאורת שידור, גופי השומנים של התא יכולים להיות דמיינו עם בדיקה מדוקדקת של איור 1 ג, שבו הם מופיעים כמבנים עגולים מבריקים ומהווים את רוב נפח התא. התאים שמוצגים באיור 1 א ', אשר גדלו בחנקן עודף, הם שמן רק 5% ממשקל יבש ואינו מכילים רמות משמעותיות של גופי שומנים בדם.
כאשר הראו בתנאי האור המתאימים, ההבדלים בדגימות אלה הם מוגדלים. תאי השמן רזהמופיע כטבעות ניאון עם גופים כהים (איור 1), ואילו התאים עשירים בנפט להציג זוהר כתום אדום בהיר שבו הם צברו גופי שומנים (1D איור). באיור 1D, קשה יותר לראות את הקרינה הקלושה של קרום התא ומבנים ניידים אחרים. הנילוס האדום יהיה לזרוח בנוכחותם של חלבונים לא קוטביים כמו גם שומנים, ולכן קרום התא ומבנים תאיים אחרים לספק רמת רקע של הקרינה במהלך מדידות ספקטרופוטומטר.
בתנאים מותאמים של assay, עקומות כיול עם R 2 ערכים גבוהים מ0.980 הן בקלות השגה (איור 2 א). הקשר בין תכולת שמן תא וקרינה הופך להיות לא ליניארי אם התאים הם מוכתמים בפתרון חסר מוביל ממס כגון אתנול. הנתונים המוצגים באיור 2, עם R 2 של 0.395, היו 60; מתקבל על ידי ביצוע הפרוטוקול בתמיסת 0% אתנול (מים deionized טהורים).
איור 1. תמונות של א ' protothecoides מוכתם עם הנילוס אדום. מדגם שמן רזה (4.4% תוכן שמן לפי משקל יבש) מוצג תחת) מועבר במיקרוסקופ אור ו-B) תאורת epifluorescence עם מסנן ירוק עירור (510 ננומטר). גופי השומנים מוכתמים בהנילוס האדום לזרוח ב604 ננומטר. מדגם עשיר בנפט (54.7% תוכן שמן לפי משקל יבש) מוצג ב-C) ו-D) באותם תנאים המשודרים וepifluorescence אור כ) ו-B), בהתאמה. nk "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
עקומות כיול איור 2. מקשרות את תכולת השמן של א protothecoides פלואורסצנטי עוצמה. ב), דגימות הוכנו על פי הפרוטוקול המתואר. בארוחת בוקר), דגימות הוכנו בתמיסת 0% אתנול (מים deionized). ברים שגיאה אנכיים מייצגים את סטיית התקן של חמש חזרות בספקטרופוטומטר. ברים שגיאה אופקי לדווח על סטיית התקן של לפחות שלושה משכפל מכימות gravimetric של שומנים ניטראליים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
| כימי | חברה | התרכזות |
| KH 2 PO 4 | פישר סיינטיפיק | 2.8 גרם · L -1 |
| K 2 HPO 4 | פישר סיינטיפיק | 1.2 גרם · L -1 |
| MgSO 4 · 7H 2 O | פישר סיינטיפיק | 1.2 גרם · L -1 |
| FeSO 4 · 7H 2 O | פישר סיינטיפיק </ Td> | 48 מ"ג · L -1 |
| H BO 3 3 | פישר סיינטיפיק | 11.6 מ"ג · L -1 |
| CaCl 2 · 2H 2 O | פישר סיינטיפיק | 10 מ"ג · L -1 |
| MnCl 2 · 4H 2 O | פישר סיינטיפיק | 7.2 גרם · L -1 |
| ZnSO 4 · 7H 2 O | פישר סיינטיפיק | 0.88 מ"ג · L -1 |
| CuSO 4 · 5H 2 O | FISשלה מדעי | 0.32 מ"ג · L -1 |
| Na 2 Moo 4 · 4H 2 O | פישר סיינטיפיק | 0.12 מיקרוגרם · L -1 |
| hydrochloride תיאמין | פישר סיינטיפיק | 40 מיקרוגרם · L -1 |
| גלוקוז | פישר סיינטיפיק | 30 גרם · L -1 |
| גליצין | פישר סיינטיפיק | 0.2-2.0 גרם · L -1 |
טבלה 1 מתכון תקשורת ותרבות.. כל ריאגנטים היו של כיתה אנליטית.פתרונות הוכנו באמצעות מים deionized. ריכוז גליצין שימש כדי לשלוט פחמן יחס חנקן בתרבות ובכתוצאה מכך, תכולת שמן הסופית של האצות. תאים הנעים בין 8.5% ל55% תוכן שומנים ניטראליים על ידי מסה (על בסיס יבש) שימשו כדי להפוך את העקומה סטנדרטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האצות המשמשות בעקומה סטנדרטית חייבים להיות אותו המין טיפח באותם תנאים ניסיוניים כמו אלה שנמדדו. שינויים משמעותיים בהרכב תקשורת, טכניקת טיפוח, ופרוטוקול מכתים יכולים להשפיע על עוצמת קריאת הקרינה. חילוץ הקסאן (המתואר בסעיפי 1 ו -2) שימש כדי לקבוע את תוכן שומנים הניטרלי של דגימות בשימוש בעקומה סטנדרטית. עבור מדידות עוצמת הקרינה מדויקות, כל הדגימות חייבת להיות מנותחות באותו הריכוז ביומסה (5 גר '/ ליטר היה בשימוש במחקר זה). תכולת שמן ולאחר מכן ניתן לקבוע בקלות על ידי השוואה לעקומה סטנדרטית. עבור פרוטוקול זה, אצות עובדו בצלוחיות לרעוד בתנאי heterotrophic (28 ° C, 100 סל"ד) עם גלוקוז כמקור פחמן (30 גרם / ל ') וגליצין כמקור החנקן (.2-2.0 גר' / ל '). למתכון תקשורת מפורט, ראה טבלת מס '1.
שיקול חשוב בביצועפרוטוקול הוא התנאים לייבוש ביומסה של אצות הרטובות בעת הכנת העקומה סטנדרטית. תנור ואקום ב 45 ° C מומלץ. תנור רגיל ב45-50 מעלות צלזיוס גם יספיק כל עוד זמן נוסף להתייבש הדגימות (24-48 hr) לחלוטין. טמפרטורות מעל 50 מעלות צלזיוס עלולות לגרום לביומסה לפתיל יחד או יוצרת קרום בלתי חדיר, שאינו resuspend בקלות בחיץ פוספט. Resuspension רשאי להסתייע בשימוש בhomogenizer. יש להימנע מתוספות כימיות כגון חומרים פעילי שטח או בסיס חזק כמו אלה בדרך כלל להשפיע על קריאת הקרינה. תרבויות מיובשות ניתן לאחסן לתקופה של עד 6 חודשים במכל אטום מבלי לחוות השפלה שומנים בדם משמעותית. שים לב שלעתים קרובות יש מדידות שבוצעו בתרביות של אצות חיות שגיאה גדולה יותר הקשורים בהם בהתאם לדיוק של עקומת כיול עכירות.
שיקול נוסף הוא ריכוז אתנול המשמש להפעלת samples בקורא מיקרו הצלחת. אתנול משמש כממס ספק, להקל על ההובלה של מולקולות הנילוס האדומים לתוך התא. בריכוזים נמוכים (<30%) את הקשר בין תכולת שמן וקרינה הופך להיות לא ליניארי עקב דיפוזיה עניות על פני קרום התא (איור 2). בריכוזים אתנול גבוהים יותר, ליניאריות השתפרה מתקבלת על חשבון הירידה בעוצמת הקרינה (איור 2 א). לprotothecoides Auxenochlorella, vulgaris כלורלה, dimorphus Scenedesmus, וScenedesmus obliquus, ריכוז אתנול של 30% נמצאו לתת התחלופה האופטימלית בין שיפור ליניאריות וירידה בעוצמת הקרינה 11. ייתכן שיהיה צורך להתאים את ריכוז אתנול כדי לייעל את התוצאות עבור אורגניזמים אחרים.
בחירת אורכי גל עירור ופליטה הראוי לקריאת הקרינה בדגימות של אצות היא חיונית כדי ensuמחדש רק שומנים ניטראליים כלולים במדידה. עוצמת הקרינה הנילוס האדומה תשתנה באורכי גל שונים תלויים בקוטביות של הסביבה 11,13. עבור א ' protothecoides, שיא הפליטה לשומנים ניטראליים הוא ציין ב590 ננומטר; שיא המשני מייצג שומנים קוטביים יותר ניתן להבחין ב645 11 ננומטר. כתוצאה מכך, מדידות עוצמת הקרינה המפורטים בנוהל זה בוצעו באמצעות מסנן עירור 530 ננומטר, עם רוחב פס חצי = 10 ננומטר, ומסנן פליטה 604 ננומטר, עם חצי רוחב פס = 10 ננומטר. בחירה של עירור ופליטת גל צריכה להיות מאומתת על כל זן של אצות שנבדק.
מאז הנילוס אדום יהיה לזרוח בכל סביבה שאינה קוטבית, מבנים ניידים, בנוסף לגופי שומנים יהיו זוהו על ידי ספקטרופוטומטר (ראו איור 1). עובדה זו, בשילוב עם ההטרוגניות הטבועה של ביומסה תא, מובילה ליחסים שאינם ליניארי ביןביומסה הסלולרי וקרינה 11. בעיה זו נפתרה על ידי הבטחה כל הדגימות מוכנות במשקל יבש קבוע (5 גר '/ ליטר מומלץ). בריכוזים לדלל את האות הופכת להיות קלושה והמגמות שלה הן קשות להבחין. בנוסף, אות הקרינה יכולה להיות רועשת עקב שינויי תא אל התא והשעיות חלקיקים בתקשורת. כתוצאה מכך, 5 חזרות של כל דגימה מומלצות לתוצאות אמינות 11.
פרוטוקולים מסוימים משתמשים סטנדרטי שמן כגון triolein לכייל את המדידה 10,20,21. אמנם שיטה זו כבר דווחה בהצלחה למינים מסוימים של אצות כגון Bacillariophyceae וDinophyceae, הוא פחות מתאים לאצות עבות חומה כגון כלורלה בשל מגבלות דיפוזיה על פני קרום התא. יתר על כן, התוספת של triolein עלולה להפריע להפצה של מולקולות הנילוס האדומים בין סטנדרטי גופי שומנים בדם, לא מוביל וo הערכות לא מדויקות של תכולת שמן. באמצעות דגימות של אצות של תוכן נפט ידוע כסטנדרטים ימנע גירעונות פוטנציאליים אלה והחשבונות לכל הקרינה רקע שנגרמה על ידי התנאים ביומסה וצמיחה.
הפרוטוקול המובא במחקר זה מספק שיטה פשוטה, זולה ומהירה של כימות שומנים ניטראליים בדגימות של אצות. על ידי שימוש בצלחת רב היטב, תפוקה מדגם גבוהה מושגות עם חיסכון משמעותי בזמן על פרוטוקולים מכתים אחרים. בנוסף, התנאים של assay המוטב להניב מגמות ליניארית לשחזור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות למדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה למתן תמיכה כספית לפרויקט זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur glass pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
- Chisti, Y.
- National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , Available from: http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf (2010).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy. Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Hara, A., Radin, N. S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).
- Han, Y., et al. Review of methods used for microalgal lipid-content analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Pino, E. C., et al. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).
- Izard, J., Limberger, R. J. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells. J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).
- Chen, W., et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures. Algal Res. 1, 176-184 (2012).
- de la Jara, A., et al. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii. J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).
- Elsey, D., et al. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).
- Feng, G. -D., et al. Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination. Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).
- Guzmán, H., et al. Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions. Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).
- Huang, G. -H., et al. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence. Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).
- Lee, S., et al. Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii. Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).
- Montero, M., et al. Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting. J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).
- Vigeolas, H., et al. Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus. J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).
- Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).
- Kou, Z., et al. Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii. J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).
