Summary
一个简单的协议采用尼罗红染色法来确定藻细胞中的中性脂质含量进行说明。这个节省时间的技术提供了一种替代传统的重量为基础的脂质定量协议。它被设计用于监测生物过程性能的具体应用。
Abstract
藻类被认为是优秀的候选人，由于其天然脂质存储功能的可再生燃料来源。强有力的监测藻类发酵过程和筛选新的石油资源丰富的菌株需要一个快速，可靠的协议，用于测定细胞内脂质含量。目前的做法主要依靠重力方法来确定油含量，技术开发几十年前是耗时且需要大量的样本量。在本文中，尼罗红，已经被用来确定脂质体在许多类型的有机体的存在下的荧光染料，掺入一种简单，快速和可靠的协议，用于测量Auxenochlorella protothecoides的中性脂质含量，绿色藻类。该方法使用乙醇，相对温和的溶剂，通透染色前的细胞膜和一个96孔微板中的荧光强度测量，以增加样品的容量。它已经设计编带的监测生物过程性能的具体应用。预先干燥的样品或活的样品从生长培养可在测定中使用。
Introduction
由于其存储在一定应力条件下脂质体的能力，藻类已经收到了极大的关注，近年来作为一种潜在的可再生燃料来源1,2。中性脂肪可以在适当的生长条件3占细胞干重的60％以上。然而，金融业并没有一个简单，干净，快速，可靠的标准化协议，以定量藻细胞的脂含量，以适当监测生物过程的性能，分析文化和屏幕的新品种。
该布莱-代尔重量法开发了一些50年前之间保持4,5今天最常用的技术。虽然这个过程很简单，可靠，方便外出携带，它是耗时的，就必须大样本量，并使得有毒溶剂的使用。这是不实际的，用于分析许多样品从发酵跑步或筛选新的石油资源丰富的菌株。其他方法有BEEN发达，但通常需要先进的设备和不规范6。
这已经获得了极大的兴趣另一种是尼罗红染色。尼罗红，发荧光优先在非极性环境中的染料，已被用于确定或量化脂质体在各种生物体，包括线虫7，酵母8，细菌9和藻类10-19。涉及尼罗红初始技术大多是定性或半定量的，色斑与单反应杯光度法或流式细胞术结合起来。此外，一些类藻类如绿藻有厚胞孔的大多是不可渗透的染料，这限制了该技术10的范围内。
在尼罗红染色法的最新改进，据报道，绕过协议10,11的初始缺点。在卡尔的存在下细胞染色IER溶剂如DMSO中10或乙醇10,11线性化油含量和吸收率之间的关系，从而允许可靠的定量测量。溶剂可帮助通透细胞膜，使尼罗红分子能够通过。此外，结合分光光度计与微孔板读数功能使适合于定量分析的高通量协议。
在这篇文章中我们详细介绍通过染色文化与尼罗红在乙醇，温和溶剂存在测量藻细胞的含油量的简单方法。为了最准确地解释在测量背景噪声，标准曲线相关联的荧光强度，含油量是使用已知的石油成分的藻细胞开发。该方法是改编自先前公布的协议10,11。通过使用96孔分光光度计，1是能够分析在一小时THA样品相同量的T公司将需要数天由重量法来监测。此外，通过使用所需的藻类物种的代表性样品校准该方法中产生相对精确的测量可直接解释的。存在着许多协议概述藻类染色用尼罗红为不同的菌株和应用进行了优化的方法;这里介绍的协议最初是由德拉奥斯西格勒等 11 Auxenochlorella protothecoides，小球藻 ， 栅藻二形 ，和斜生栅藻 ，虽然它很可能适用于许多种类和类。它的设计与监测生物过程性能的具体应用，它同样适用于预先干燥试样和湿样品从不断增长的文化。
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Protocol
1，干海藻生物质的分离，以用作荧光读数标准
- 除去从生长的藻类培养物，将提供至少200毫克干生物量的样品体积，400-600毫克，是优选的。
- 在以10,000 xg 4℃10分钟离心样品。弃去上清液，并用磷酸缓冲液配制成相同的pH作为生长培养基等体积的洗涤沉淀。
- 共3洗涤步骤重复步骤1.2。
- 重新悬浮在去离子水中沉淀并转移到一个预先称重的称重盘。让表面干燥，50℃培养48小时。注意：在真空条件下干燥将减少干燥时间，并在温度高于50℃下干燥的培养可以使悬浮困难。
- 店铺干燥藻培养物在室温下以备将来使用。
中性脂肪由正己烷提取物2。重力定量（来自布莱和代尔4改编）
- 在称重盘尺寸约为50毫克的干藻生物量。注：大众从40-80毫克可重复性不丧失使用。
- 生物质转移到研钵中预先用己烷洗涤。如果需要的话，用己烷使用巴斯德吸管，以生物质完全转移到研钵少量（1毫升）洗称量皿。注：正己烷是一种极易挥发和有毒物质。它必须在通风橱中有适当的防护衣物进行处理。
- 磨藻类生物质为用杵5分钟。首先用温和的研磨，逐渐增加强度。磨生物质转化为在5分钟内一个细腻的糊状物。如果传送的生物量的砂浆时过量使用己烷，最好是等待己烷研磨之前蒸发。
- 加几毫升己烷的砂浆和混合所得到的浆料用杵直到它被均化。确保所有的细胞碎片附着在铁道部的墙壁焦油被撞倒自由悬浮于液体中。
- 己烷细胞量的混合物转移到离心管中。注：离心管必须是玻璃或合适的聚合物用己烷如特氟隆兼容。
- 直到所有的生物质已被转移到离心管中（3 - 5倍）重复步骤2.4和2.5。
- 离心机的样品在以10,000×g下4℃放置20分钟。
- 小心吸取上清到一个预先称重的金属重量菜。储存在通风橱。
- 加入3毫升己烷以沉淀并大力旋涡1分钟进行2 次己烷萃取。
- 重复步骤2.7和2.8。如果需要的话，第二次提取过程中运行的样品进行30分钟的离心分离机，以确保所有细胞碎片完全平息。确定油重量法大规模提取正己烷后完全蒸发。
3，荧光中性脂肪用尼罗红的定量（如度报告特德由德拉奥斯西格勒等 11）
注：需要荧光读数藻类悬浮在5 g / L的只有10微升。一般来说，从1.5毫升培养液的干燥藻类生物量隔离是绰绰有余。另外，在分光光度计的灯的光强度可以随时间降解。这是推荐的标准包括在每一个实验中，以确保在变化的仪器不增加不必要的错误的测量。
- 准备一个尼罗红溶液在溶解于醇试剂级乙醇10微克/ ml的浓度。在4℃下保存该解决方案在黑暗中
- 制备在去离子水中并存储一个30％（体积/体积）乙醇溶液在4℃下
- 准备所有藻类样品在相同的生物量浓度（5 g / L的建议），并用同样的方法在测量中使用的标准。由任一悬浮于适量的预先干燥的样品做这个的磷酸缓冲液（0.6克/升磷酸氢二钾，1.4 g / L的磷酸二氢钾），或测量浊度后用磷酸盐缓冲液调节生长的藻类培养物的浓度为5克/升。注意：在活的藻培养物上进行的测量通常具有与它们取决于浊度校准曲线的精确度相关的误差较大。重悬干燥的样品，可能需要使用一个均化器充分分散的生物质。
- 对于每个样品，混合80微升30％的乙醇溶液中，加入10μl的尼罗红溶液，和10μl的藻类悬浮液在96孔板的单个孔。为了正确地计算荧光测定的变异，进行5次重复每个样品。
- 执行两点校准曲线与之前以占一天到一天中的变化和仪器准备准备标准。使用s制备的标准进行荧光测定AME过程作为样本。注：一般两点就足够了仪器的校准，三点可以运行来验证线性度。
- 执行在多板读数器分光光度计的荧光测量。以下条件被发现，得到最一致的结果11：
- 摇在1,200 rpm下，轨道3mm时，持续30秒。
- 孵育在40℃下10分钟。
- 摇在1,200 rpm下，轨道3mm时，持续30秒。
- 记录荧光，激发波长为530纳米，在604 nm发射。
- 使用从内部标准将结果转换的荧光测量，以油含量。
4，荧光显微镜技术
注：在第3条所述的染色协议被设计用于定量分析，但它也可以是有用的，以提供染色为基础的技术的视觉表示用于教育和说明性的普rposes。以产生样品荧光的一个的图像，需要使用光学显微镜与传统的传输和额外的落射荧光照明光源。在530纳米（绿）和604纳米（红色）范围的激发和发射光滤波器，分别被需要的尼罗红染色，以及一个安装在显微镜照相机相关联的软件。用明视场显微镜配备了摄像头和单色RGB转换器单元被收购在这项研究中（ 图1）所示的图像。使用这些工具的制造尼罗红的荧光图像的过程概述如下：
- 根据协议第3条准备一个文化样本与尼罗红染色。注：在5 g / L的浓度范围内的样品产生足够的细胞密度无滑动人满为患。
- 完成染色方案的步骤3.6之后，按照标准实验室方法制备经处理的样品的显微镜载玻片上。
- 在传输模式的显微镜开始，装载准备滑入显微镜，并找到细胞所需的放大倍率（本文中显示的图像被收购与100X目标）。
- 一旦集中，从传输切换显微镜落射荧光照明模式。光源现在应该直接从物镜来（这可以在视觉上通过观察滑和物镜之间的空间中得到证实）。
- 插入一个绿色激发滤光片进入光源和红色发射滤波器的观察光路中;染色细胞的荧光现在应该直接可见通过目镜。
- 从目镜切换显微镜观察模式下的安装照相机和使用浏览软件来捕获荧光的细胞的图像。根据相机的灵敏度，样品最初可能不会出现在预览窗口（ 即屏幕上会是黑色的）;以解决这个问题，调整曝光时间和照相机增益到一定水平，所述细胞是可见的。具体的设置将与仪器，设备，和细胞类型而有所不同。
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Representative Results
沾上尼罗红染料代表藻细胞如图1所示。部分A和图1显示A的图像乙 protothecoides生长在过量的氮，从而导致非常低的细胞内脂质蓄积。在部分C和D，样品A的在氮气氛下限制生长protothecoides示。根据透射照明，细胞的脂质体，可以可视化通过仔细检查图1C中 ，在那里它们将显示为有光泽的圆形结构和构成的多数细胞体积的。在图1A所示的细胞，其生长在过量的氮，只有5％的油（干重），并且不包含显著脂质体的水平。
当适当的光线条件下显示，这些样品中的差异被放大。油瘦细胞而石油资源丰富的细胞显示出鲜艳的橙红色的光芒，他们已经积累了脂质体（ 图1D）出现荧光戒指暗体（ 图1B）。在图1D中 ，它更难以看到细胞膜和其它细胞结构的微弱的荧光。尼罗红荧光将在非极性蛋白的存在，以及脂质，这就是为什么在细胞膜和其它细胞结构中的分光光度计测量提供荧光的背景水平。
根据该测定的优化条件下，校准曲线与R比大于0.980 2的值是很容易实现的（ 图2A）。细胞油含量和荧光之间的关系变为非线性的，如果细胞染色溶液中的缺乏载体溶剂，如乙醇。在图2B中给出的数据，与R 2的0.395，均 60，通过执行协议在0％乙醇溶液（纯净去离子水）获得。
图1 A的图像protothecoides沾上尼罗红。一种油贫样品（干重4.4％的含油量）被出示一张下）透射光镜和B）和绿色激发滤光片（510 nm）的落射荧光照明。沾上尼罗红脂质体荧光在604 nm处。石油储量丰富的样品（以干重54.7％含油量）显示在c）和d）相同的传输和落射荧光照明条件为A）和B）下，分别。NK“>点击这里查看大图。
图2的校准曲线相关联A的油含量protothecoides到荧光强度。在A），样品根据描述的协议编制。在B）中 ，样品中的0％的乙醇溶液（去离子水）制备。垂直误差棒代表的5个重复中的分光光度计的标准偏差。水平误差棒从报告中性脂肪的重量量化至少三个重复的标准偏差。 点击这里查看大图。
| 化学药品 | 公司 | 浓度 |
| KH 2 PO 4 | 飞世尔科技 | 2.8克·L-1 |
| K 2 HPO 4 | 飞世尔科技 | 为1.2g·L-1 |
| 硫酸镁4·7H 2 O | 飞世尔科技 | 为1.2g·L-1 |
| 硫酸亚铁4·7H 2 O | 飞世尔科技</ TD> | 48毫克·L-1 |
| H 3 BO 3 | 飞世尔科技 | 11.6毫克·L-1 |
| 氯化钙2·2H 2 O | 飞世尔科技 | 10毫克·L-1 |
| 的MnCl 2·4H 2 O | 飞世尔科技 | 7.2克·L-1 |
| 的ZnSO 4·7H 2 O | 飞世尔科技 | 0.88毫克·L-1 |
| 硫酸铜4·5H 2 O | FIS她的科学 | 0.32毫克·L-1 |
| 娜2的MoO 4·4H 2 O | 飞世尔科技 | 0.12微克·L-1 |
| 盐酸硫胺 | 飞世尔科技 | 40微克·L-1 |
| 葡萄糖 | 飞世尔科技 | 30克·L-1 |
| 甘氨酸 | 飞世尔科技 | 0.2-2.0克·L-1 |
表1培养基配方。所有试剂均为分析纯。溶液使用去离子水制备。甘氨酸的浓度来控制培养液中的碳对氮的比例和藻类因此，最终的油含量。细胞范围从8.5％到按质量（干重）55％的中性脂质含量被用来制作标准曲线。
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Discussion
在标准曲线所用的藻类必须是那些被测量相同的实验条件下培养相同的物种。显著改变培养基组成，栽培技术，和染色的协议会影响读数的荧光的强度。己烷萃取（在第1和2中所述）被用于确定在标准曲线用样品的中性脂质含量。为准确的荧光强度测量结果，所有的样品必须在相同的生物量浓度（5 g / L的是在本研究中所用）进行分析。含油量然后可以通过比较，通过标准曲线来容易地确定。对于这个协议，藻类培养在摇瓶异条件下（28℃，100转），以葡萄糖为碳源（30克/升）和甘氨酸作为氮源（0.2-2.0克/升）下。如需详细的媒体配方， 见表1。
在开展的一个重要的考虑因素协议是用于制备标准曲线时干燥湿藻类生物量的条件。建议使用真空烘箱中，在45℃。在45-50℃的常规烘箱也只要额外时间完全干燥样品（24-48小时）就足够了。温度高于50℃，可能导致生物质一起熔化或形成一种难以逾越的痂，不容易在磷酸盐缓冲液中重悬。再悬浮可以辅助通过使用均化。应避免使用化学添加剂如表面活性剂或一种强碱，因为这些通常影响荧光读数。干培养物可存放长达6个月在一个密封的容器，没有经历显著脂质的降解。需要注意的是在活的藻培养物上进行的测量通常具有与它们取决于浊度校准曲线的精确度相关的误差较大。
另一个要考虑的是用于运行SAMP乙醇浓度莱在微板读数器。乙醇作为载体溶剂，促进尼罗红分子运输到细胞中。在低浓度（<30％），油含量和荧光之间的关系变为非线性，由于穿过细胞膜（ 图2B）差扩散。在更高的乙醇浓度，在降低荧光强度（ 图2A）。对于Auxenochlorella protothecoides，小球藻 ， 栅藻二形 ，和斜生栅藻 ，30％的乙醇浓度为给出最优权衡代价得到改善线性度之间改善线性度和降低荧光强度11。可能有必要调节乙醇浓度以优化结果为其他生物体。
选择合适的激发和发射波长，用于读取的荧光藻样品中是至关重要的ensu重仅中性脂质包括在测量。尼罗红的荧光强度将在不同的波长依赖于环境11,13的极性而变化。对于A。 protothecoides，对于中性脂质的发射峰是观察到在590nm处;较详细极性脂质的二次峰可以在645 nm处11被观察到。因此，在此过程中概述的荧光强度的测定使用530nm的激发滤光器被执行的，与半峰宽= 10纳米，和一个604 nm发射滤波器，半带宽= 10纳米。激发和发射波长的选择应为每个藻菌株进行测试来验证。
由于尼罗红将任何非极性环境中荧光，细胞的结构除了脂质体将通过分光光度计来检测（参见图1B）。这个事实，在与细胞生物质的固有异质结合，导致之间的非线性关系细胞生物量和荧光11。这个问题是通过确保所有的样品制备在一个恒定的干重（5 g / L的建议）解决。在稀浓度的信号变得微弱，其趋势是难以分辨。此外，该荧光信号可嘈杂由于细胞 - 细胞间的变化和颗粒悬浮液中的介质。因此，建议在可靠的结果，11 5个重复每个样品。
一些协议使用一个标准的油，如三油酸甘油酯的校准测量10,20,21。虽然这一技术已报道了成功对藻类如硅藻和甲藻的某些物种，这是由于穿过细胞膜扩散限制不太适合于厚壁藻类如小球藻 。此外，加入三油酸甘油酯的可能会扰乱尼罗红分子的标准和脂质体，导致t的分布油含量的O不准确的估计。使用已知的含油量藻样品作为标准，避免了这些潜在的短缺，占所造成的生物量和生长条件的任何背景荧光。
在这项研究中提出的协议提供了藻类样品中量化中性脂肪的一种简单，廉价和快速的方法。通过使用多孔板，高采样吞吐量与显著节约时间比其他染色方法实现。此外，该法的条件进行了优化，得到可重复的线性趋势。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
笔者想感谢加拿大自然科学和工程研究理事会提供该项目的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur glass pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
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