Summary
나일 레드 염색 절차를 사용하여 조류 세포의 중성 지질 함량을 결정하기위한 간단한 프로토콜을 설명한다. 이 시간을 절약 할 수있는 기술은 기존의 중량 측정 기반 지질 정량 프로토콜에 대한 대안을 제공합니다. 그것은 모니터링 생물 공정 성능의 특정 애플리케이션을 위해 설계되었다.
Abstract
조류는 자연 지질 저장 기능으로 인해 신 재생 연료 원에 대한 우수한 후보로 간주됩니다. 조류 발효 공정과 새로운 석유가 풍부한 균주에 대한 심사의 강력한 모니터링은 세포 내 지질 함량의 측정을위한 빠르고 신뢰할 수있는 프로토콜을 필요로한다. 현재 관행이 기름 내용을 결정하기 위해 크게 중량 측정 방법에 의존, 기술은 시간이 소요되며 많은 양의 샘플을 필요로 수십 년 전에 개발. 본 논문에서는, 나일 레드, 생물의 다양한 종류의 지질 기관의 존재를 식별하는 데 사용 된 형광 염료는 Auxenochlorella의 protothecoides의 중성 지질 함량, 녹색을 측정하기위한, 간단하고, 빠르고, 믿을 수있는 프로토콜에 통합 조류. 방법은 염색 전에 세포막 및 형광 세기 측정 중에 샘플 용량을 증가 96 웰 마이크로 플레이트를 투과하는, 에탄올, 비교적 온화한 용매를 사용한다. 그것은 설계되었습니다모니터링 생물 공정 성능의 특정 응용 프로그램과 ED. 성장 배양 물로부터 샘플을 건조 또는 살아있는 샘플 분석에 사용될 수있다.
Introduction
인해 특정 스트레스 조건하에 지질 체를 저장할 수있는 능력으로, 조류 전위 재생 연료 원 1,2로서 최근 주목을 받아왔다. 중성 지질은 적절한 성장 조건 3에서 세포 건조 중량의 60 %를 차지하고 있습니다. 그러나 업계는 제대로, 생물 공정의 성능을 모니터링 문화를 분석하고, 새로운 변종에 대한 화면을 위해 조류 세포의 지질 함량을 정량하는, 간단한 청소, 신속하고 신뢰할 수있는 표준화 된 프로토콜을 가지고 있지 않습니다.
Bligh 고 - 다이어 중량 측정 방법은 약 50 년 전에 개발 된 오늘날 4,5 가장 일반적으로 사용되는 기술 중 하나 남아있다. 이 절차는, 간단하고 안정적이며 수행하기 쉬운 반면, 시간 소모적 인 큰 양의 샘플을 필요로하고, 독성 용매를 사용한다. 그것은 발효 실행에서 많은 샘플을 분석하거나 새로운 석유가 풍부한 균주 선별을위한 실용적되지 않습니다. 다른 방법은 ㄱ있다EEN 개발 만, 통상 첨단 장비가 필요하고 6 표준화되지 않았다.
관심의 큰 거래를 얻고있다 대체 나일 레드 얼룩입니다. 나일 레드, 비극성 환경에서 우선적으로 형광 염료, 선충 7, 효모 8, 9 박테리아, 조류 10-19 등 다양한 생물 지질 시체의 신원을 확인하거나 정량하는 데 사용되었습니다. 나일 레드를 포함하는 초기 기술은 단일 베트 광도법 또는 유동 세포 계측법 얼룩을 결합, 주로 정성 또는 반 정량적이었다. 또, 녹조류와 같은 조류의 일부 클래스는 기술 (10)의 범위를 한정 염료에 주로 불 투과성이다 두꺼운 셀 웰있다.
나일 레드 염색법에 최근 개선은 프로토콜 10, 11의 초기 단점을 무시하는보고되었습니다. 카의 존재하에 세포를 염색IER은 DMSO (10)로서 용매 또는 에탄올 10,11 안심 정량적 측정을 허용 유분와 흡광도 사이의 관계를 선형화한다. 용매 나일 레드 분자가 통과 할 수 있도록 세포막을 투과 돕는다. 또한, 마이크로 플레이트 판독 기능을 분광 광도계를 통합하는 것은 정량 분석에 적합한 높은 처리량 프로토콜을 가능하게한다.
이 문서에서 우리는 세부 사항에있는 에탄올, 중성 용매의 존재 나일 레드와 문화를 염색하여 조류 세포의 오일 함량을 측정하는 간단한 방법. 가장 정확하게하기 위해 측정에서 배경 노이즈를 차지하고, 유분으로 형광 강도를 상관 표준 곡선은 공지 된 오일 조성물의 조류 세포를 사용하여 개발된다. 이 방법은 이전에 발행 된 프로토콜 10, 11에서 적응됩니다. 96 - 웰 분광 광도계를 사용하여, 하나는 시간 그쪽에서 샘플의 동일한 양을 분석 할 수있다t는 중량 측정 방법으로 모니터링 할 수 일이 걸릴 것입니다. 또한, 원하는 조류 종의 대표 샘플을 사용하여 교정하여이 방법은 직접 해석 비교적 정확한 측정을 생산하고 있습니다. 다른 긴장과 애플리케이션에 최적화 나일 레드와 조류를 염색하는 방법을 요약 많은 프로토콜이 존재한다; 그것은 더 많은 종과 클래스에 대한 가능성이 적합하지만 여기에 제시된 프로토콜은 원래, Auxenochlorella의 protothecoides에 드 라 Hoz라고 Siegler 등. (11)에 의해 클로렐라 심상 성, Scenedesmus의 dimorphus 및 Scenedesmus의 obliquus을 개발했다. 이 모니터링 생물 공정 성능의 특정 응용 프로그램으로 설계되고있어 성장 문화에서 이전에 건조 된 샘플 및 젖은 샘플 동일하게 작동합니다.
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Protocol
1. 건조 해조류 바이오 매스의 분리 형광 판독을위한 기준으로 사용되는
- 건조 바이오 매스의 적어도 200 밀리그램을 제공 할 것입니다 성장하는 조류 배양에서 샘플 볼륨을 제거, 400 ~ 600 밀리그램이 바람직하다.
- 10,000 × g에서 10 분 동안 4 ° C에서 샘플을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 성장 미디어와 같은 pH로 공식화 인산염 완충액 같은 부피와 펠렛을 씻으십시오.
- 3 세척 단계의 총 단계 1.2를 반복한다.
- 탈 이온수의 펠렛을 다시하면 일시 중지하고 무게를 미리 무게를 접시에 전송할 수 있습니다. 48 시간 동안 50 ℃에서 건조시켜주십시오. 참고 : 진공 상태에서 건조하면 건조 시간을 단축하고 50 ° C 이상의 온도에서 문화를 건조하는 것은 재 부상을 어렵게 만들 수 있습니다.
- 나중에 사용하기 위해 상온에서 저장, 건조 해조류 문화.
헥산 추출 중성 지질의 2. 중량 측정 정량화 (Bligh 고와 다이어 4에서 적응)
- 무게 접시에 건조 해조류 바이오 매스의 약 50 밀리그램을 측정합니다. 주 : 40 ~ 80 밀리그램에 이르기까지 대중 재현성의 손실없이 사용할 수 있습니다.
- 박격포 헥산으로 미리 세척에 바이오 매스를 전송합니다. 필요한 경우, 완전 모르타르에 바이오 매스를 옮기기 위하여 파스퇴르 피펫을 사용하여 소량의 헥산 (1 ㎖)로 계량 접시 세척. 참고 : 헥산이 높은 휘발성과 독성 물질이다. 그것은 적절한 보호 복 흄 후드에서 처리해야합니다.
- 유봉을 이용하여 5 분 동안 조류 바이오 매스를 분쇄. 부드러운 연마로 시작하고 점차 강도를 증가시킨다. 5 분 동안의 미세하고 부드러운 붙여 넣기로 바이오 매스를 갈기. 모르타르에 바이오 매스를 전송할 때 과량의 헥산을 사용하는 경우, 헥산 연삭 전에 증발 기다리는 것이 최상이다.
- 박격포에 헥산 수 ml를 추가하고이 균질화 될 때까지 유 봉 생성 된 슬러리를 혼합한다. 모든 세포 파편이 MOR의 벽에 부착되었는지 확인타르는 무료 두드려 액체에 일시 중단됩니다.
- 원심 관에 헥산 - 세포괴 혼합물을 전송. 참고 : 원심 분리 관은 유리 또는 테플론 헥산과 호환되는 적절한 고분자이어야합니다.
- 모든 바이오 매스는 원심 분리 관 (3 배)로 전송 될 때까지 반복하여 2.4 및 2.5 단계를 반복합니다.
- 원심 분리기 10,000 × g에서 20 분 동안 4 ° C에서 샘플.
- 조심스럽게 미리 무게 금속 접시의 무게에 뜨는을 피펫. 흄 후드에 저장합니다.
- 펠렛에 헥산 3 ㎖를 추가하고 1 분 동안 격렬하게 소용돌이로 교반하여 2 차 헥산 추출을 수행합니다.
- 반복은 2.7 및 2.8 단계를 반복합니다. 필요한 경우, 모든 세포 파편이 완전히 정착하기 위해 두 번째 추출 동안 원심 분리기에서 30 분 동안 샘플을 실행합니다. 헥산이 증발 한 후 중량 측정 추출 오일의 질량을 결정합니다.
나일 레드를 사용하여 중성 지질 3. 형광 측정 정량화 (REPOR로테드 드 라 Hoz라고 Siegler 등. 11에 의해)
참고 : 5g / L에서 조류 현탁액의 10 μL가 형광 판독 필요합니다. 일반적으로, 배양액의 1.5 ML에서 건조 해조류 바이오 매스의 분리가 충분 이상입니다. 또, 분광 광도계에서 램프의 빛의 세기는 시간이 지남에 따라 저하 될 수있다. 그것은 악기의 변화는 측정에 불필요한 오류를 추가하지 않도록 모든 실험에서 기준을 포함하는 것이 좋습니다.
- 알코올 시약 급 에탄올 10 μg / ml의 농도로 나일 레드 용액을 준비한다. 4 ° C에서 어둠 속에서이 솔루션을 저장
- 4 ℃에서 탈 이온수 및 저장에 30 % (v / v) 에탄올 용액을 제조
- 같은 바이오 매스 농도 (/ L 5g 권장)에서와 측정에 사용되는 기준과 동일한 방식으로 모든 조류의 샘플을 준비합니다. 적절한 양의 하나를 중단 미리 건조 샘플하여이 작업을 수행인산염 완충액 (0.6 g / L 칼륨, 제 2 인산, 1.4 g / L의 칼륨 인산) 또는 탁도를 측정 한 후, 인산 완충액으로 5g / L로 증가 조류 배양의 농도를 조정. 참고 : 라이브 조류 배양에서 수행되는 측정은 종종 탁도 보정 곡선의 정밀도에 따라 그와 관련된 더 큰 과실이있을 것이다. 건조 된 샘플을 완전히 재현 탁하여 바이오 매스를 분산시키는 호모 게 나이저를 사용하는 방법을 필요로 할 수있다.
- 각 샘플의 경우, 96 - 웰 플레이트의 하나의 잘에 30 % 에탄올 용액 80 μL, 나일 레드 용액 10 μL, 그리고 조류 현탁액의 10 μl를 섞는다. 적절 형광 측정의 변동을 고려하기 위해서, 각 샘플을 5 회 반복 수행한다.
- 악기와 준비 일상적인 변동을 고려하기 위해 미리 제조 기준을 두 포인트 보정 곡선을 실행합니다. 발을 이용한 형광 측정 용 표준 준비샘플로 AME 절차. 참고 : 일반적으로 두 점은 악기의 재 교정을 위해, 3 점 선형성을 확인하기 위해 실행할 수있는 충분합니다.
- 멀티 웰 플레이트 리더 분광 광도계의 형광 측정을 수행합니다. 다음 조건은 가장 일관된 결과 (11)를 수득 발견 하였다 :
- 30 초 동안 1,200 rpm으로, 궤도 3mm에서 흔들어.
- 10 분 동안 40 ° C에서 알을 품다.
- 30 초 동안 1,200 rpm으로, 궤도 3mm에서 흔들어.
- 기록 형광, 530 nm에서 여기, 604 nm에서 방출.
- 내부 표준의 결과를 이용하여 유분을 형광 측정을 변환.
4. 형광 현미경 기술
NOTE : 섹션 3에 기재된 염색 프로토콜은 정량 분석을 위해 설계되지만, 또한 교육 및 예시를 위해 PU 스며 기반 기술의 시각적 표현을 제공하는 것이 유용 할 수있다rposes. 샘플 형광 하나의 이미지를 생성하려면 기존의 전송 및 추가 표면 형광 조명 소스와 광학 현미경이 필요합니다. 530 nm의 (녹색) 및 604 nm의 (적색) 범위의 여기 및 발광 광 필터는 각각 나일 레드 얼룩뿐만 아니라 관련 소프트웨어와 현미경 장착 된 카메라가 필요합니다. 이 연구 결과 (도 1)에 도시하는 이미지는 RGB 변환 부에 카메라와 흑백 구비 명 시야 현미경을 사용하여 획득 하였다. 이러한 도구를 사용하여 나일 레드 형광 이미지를 생성하는 절차는 아래에 설명되어 있습니다 :
- 프로토콜의 제 3 항에 따라 나일 레드 얼룩과 문화의 샘플을 준비합니다. NOTE : 5g / L의 농도 범위에있는 샘플에서는 혼잡없이 적절한 세포 밀도의 슬라이드를 생성한다.
- 염색 프로토콜의 단계 3.6를 완료 한 후, 표준 실험실 절차에 따라 처리 된 시료의 현미경 슬라이드를 준비합니다.
- 전송 모드에서 현미경을 시작으로, 현미경에 준비된 슬라이드를로드하고 원하는 배율 (이 문서에 표시된 이미지가 100X의 목적으로 취득한)에서 세포를 찾습니다.
- 집중되면, 표면 형광 조명 모드로 송신으로부터 현미경을 전환. 광원은 이제 (이것은 슬라이드와 대물 렌즈 사이의 공간을 육안으로 관찰함으로써 확인 될 수있다), 대물 렌즈로부터 직접 올 것이다.
- 관찰의 빛 경로에 광원과 적색 발광 필터에 녹색 여기 필터를 삽입; 염색 된 세포의 형광 지금 접안 렌즈를 통해 직접 볼 수 있어야합니다.
- 마운트 카메라에 접안에서 현미경 관찰 모드를 전환 한 세포의 형광 이미지를 캡처 시청 소프트웨어를 이용한다. 카메라의 감도에 따라 샘플은 처음에 (미리보기 창에 표시되지 않을 수도 화면, 즉 것) 검은 색으로; 이 문제를 해결하기 위해, 세포를 볼 수 있습니다 수준으로 노출 시간과 카메라의 게인을 조정합니다. 특정 설정은 악기, 장비, 세포 유형에 따라 다르다.
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Representative Results
나일 붉은 염료로 염색 대표 조류 세포를 그림 1에 나타내었다. 파트 A와 파트 A의 그림 1 디스플레이 이미지의 B protothecoides 매우 낮은 세포 내 지질 축적에 이르는, 과잉 질소에서 성장. A. 일부 C와 D, 샘플 질소를 제한 한 성장에 따라 protothecoides이 표시됩니다. 투과 조명 하에서, 세포의 지질 체들은 반짝이 원형 구조로 표시하고 세포 부피의 대부분을 구성하는도 1C, 조심 검사로 시각화 할 수있다. 과잉 질소 중에서 성장시켰다도 1a에 도시 된 셀은, 건조 중량으로 5 % 오일이며 지질 체의 유의 수준을 포함하지 않는다.
적절한 조명 조건 아래에 표시하면,이 샘플의 차이가 확대됩니다. 오일 린 세포석유가 풍부한 세포가 지질 기관 (그림 1D)를 축적 밝은 오렌지 - 붉은 노을을 표시하면서 어두운 몸 (그림 1B)와 형광 링으로 나타납니다. 도 1D에서, 세포막 및 다른 셀 구조의 희미한 형광을 볼 수 어렵다. 나일 레드 비극성 단백질의 존재뿐만 아니라 세포막과 기타 세포 구조는 분광 광도계 측정 중에 형광 배경 레벨을 제공하는 이유이다 지질에 형광 것이다.
분석의 최적화 된 조건에서, 0.980 2보다 큰 값 R과 교정 곡선은 (그림 2A) 쉽게 달성 할 수있다. 세포 담체 에탄올과 같은 용매 결여 용액에 묻 으면 셀 오일 함유 형광 간의 관계는 비선형이된다. R 0.395의 2와도 2b에 제시된 데이터는,되었습니다 60; 0 % 에탄올 용액 (순수, 탈 이온수)에 프로토콜을 수행함으로써 얻어.
그림 1. A.의 이미지 나일 레드로 염색 protothecoides. 오일 린 샘플 (건조 중량으로 4.4 %의 기름 내용은))에 표시된 광학 현미경을 전송 및 녹색 여기 필터 (510 NM)와 B) 표면 형광 조명입니다. 나일 레드로 염색 지질 몸은 604 nm에서 형광. 석유가 풍부한 샘플 (건조 중량 54.7 % 오일 함유)가 각각 동일한 전송 및 표면 형광 빛과 같은 조건) 및 B)에서 C)와 D)에 표시됩니다.NK "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
A.의 유분을 상관도 2. 검량선 protothecoides 강도를 형광성.에서), 샘플은 설명 프로토콜에 따라 제조 하였다. B)에서, 시료를 0 % 에탄올 용액 (탈 이온수)을 제조 하였다. 세로 오차 막대는 분광 광도계에서 다섯 개의 반복의 표준 편차를 나타낸다. 수평 오차 막대는 중성 지질의 중량 측정 정량화에서 적어도 세 개의 반복의 표준 편차를보고합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 화학 | 회사 | 집중 |
| KH 2 PO 4 | 피셔 과학 | 2.8 g · L -1 |
| K 2 HPO 4 | 피셔 과학 | 1.2 g · L -1 |
| 망초 · 7H 2 O | 피셔 과학 | 1.2 g · L -1 |
| FeSO 4 · 7H 2 O | 피셔 과학 </ TD> | 543 ㎎ · L -1 |
| H 3 BO 3 | 피셔 과학 | 11.6 MG · L -1 |
| 염화칼슘 2 · 2H 2 O | 피셔 과학 | 10 ㎎ · L -1 |
| MnCl 2 · 4H 2 O | 피셔 과학 | 7.2 g · L -1 |
| ZnSO 4 · 7H 2 O | 피셔 과학 | 0.88 MG · L -1 |
| CuSO 4 · 5H 2 O | FIS그녀의 과학 | 0.32 MG · L -1 |
| 나 2 무 4 · 4H 2 O | 피셔 과학 | 0.12 μg · L -1 |
| 티아민 염산염 | 피셔 과학 | 40 μg · L -1 |
| 포도당 | 피셔 과학 | 30g · L -1 |
| 글리신 | 피셔 과학 | 0.2 내지 2.0 g · L -1 |
표 1. 문화 미디어 레시피. 모든 시약은 분석 등급의했다.용액은 탈 이온수를 사용하여 제조 하였다. 글리신 농도는 배양 질소 비율 탄소를 제어 및 조류의 결과, 최종 유분 하였다. 8.5 %의 질량 (건조 기준)를 기준으로 55 % 중성 지질 함량까지 세포를 표준 곡선을 만들기 위해 사용되었다.
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Discussion
표준 곡선에 사용 된 조류는 그 측정되는 것과 같은 실험 조건에서 재배 같은 종해야합니다. 미디어 구성, 재배 기술 및 염색 프로토콜의 중요한 변화는 형광 독서의 강도에 영향을 줄 수 있습니다. (섹션 1 및 2에 기재되어 있음)의 헥산 추출에 사용되는 표준 곡선 샘플의 중성 지질 함량을 결정하는 데 사용되었다. 정확한 형광 강도 측정의 경우, 모든 샘플은 같은 미생물 농도 (5g / L이 연구에 사용 된)에서 분석해야합니다. 유분은 쉽게 표준 곡선과 비교함으로써 결정될 수있다. 이 프로토콜에 대한 조류가 질소원 (0.2 내지 2.0 g / L)와 같은 탄소 소스 (30g / L) 및 글리신과 같은 포도당과 종속 영양 상태 (28 ° C, 100 RPM)에서 쉐이크 플라스크에서 배양 하였다. 자세한 미디어 조리법을 위해, 표 1을 참조하십시오.
수행에 중요한 고려 사항프로토콜은 표준 곡선을 준비 할 때 젖은 조류 바이오 매스를 건조하기위한 조건입니다. 45 ° C의 진공 오븐 권장합니다. 45 ~ 50 ° C에서 기존의 오븐은 너무 오래 추가 시간이 완전히 샘플 (48 시간)을 건조하는 데으로 충분합니다. 50 ° C 이상의 온도는 바이오 매스가 서로 융합 또는 쉽게 인산염 완충액에 재현 탁하지 않는 꿰 뚫을 수없는 지각을 형성하는 원인이 될 수 있습니다. 재 부유는 균질의 사용에 도움을받을 수있다. 이들은 일반적으로 형광 판독 영향 등의 계면 활성제 또는 강염기로서 화학 첨가제는 피해야한다. 말린 문화는 중요한 지질 저하를 경험하지 않고 밀폐 된 용기에 최대 6 개월 동안 저장 될 수있다. 살아있는 조류의 문화에서 수행되는 측정은 종종 탁도 보정 곡선의 정밀도에 따라 그와 관련된 더 큰 과실이있을 것이다합니다.
또 다른 고려 사항은 SAMP를 실행하는 데 사용되는 에탄올의 농도마이크로 플레이트 리더의 레. 에탄올은 셀에 나일 레드 분자의 수송을 용이 캐리어 용매로서 작용한다. 낮은 농도 (<30 %) 오일 함량 및 형광의 관계로 인해 세포막 (도 2B)에 걸쳐별로 확산 비선형이된다. 높은 에탄올 농도에서, 향상된 선형성은 형광 강도 (그림 2A)를 감소. Auxenochlorella의 protothecoides를 들어, 클로렐라 심상 성, Scenedesmus의 dimorphus 및 Scenedesmus obliquus, 30 %의 에탄올 농도를 최적의 트레이드 - 오프에게 제공하기 위해 발견 된의 비용으로 얻을 수있다 선형성을 개선하고 형광 강도 (11) 사이의 감소. 이는 다른 유기체에 대한 결과를 최적화하기 위해 에탄올 농도를 조절할 필요가있다.
조류 샘플에서 형광을 읽기위한 적절한 여기 및 방출 파장을 선택하면 ensu에 매우 중요전용 중성 지질은 측정에 포함되어 다시. 나일 레드의 형광 강도는 환경 11,13의 극성에 따라 다른 파장에서 달라질 수 있습니다. A.에 대한 protothecoides, 중성 지질의 발광 피크는 590 nm에서 관찰된다; 극성 지질을 나타내는 차 피크가 645 nm의 11에서 관찰 될 수있다. 따라서,이 절차에서 설명 된 형광 강도 측정은 절반 대역폭 = 10 ㎚로, 하프 밴드 너비 = 10 ㎚, 및 604 nm의 방출 필터와 함께, 530 nm의 여기 필터를 사용하여 수행 하였다. 여기 및 발광 파장의 선택은 시험의 모든 조류 균주가 확인해야합니다.
나일 레드 비 - 극성 환경에서 형광되므로, 지방질 체 이외에 셀 구조 (도 1b 참조) 분광 광도계에 의해 검출 될 것이다. 이 사실은, 세포의 바이오 매스의 고유 이질성과 조합 간의 비선형 관계에 이르게세포 바이오 매스 및 형광 11. 이 문제는 모든 시료가 일정한 건조 중량 (5g / L 권장)에 준비함으로써 해결된다. 희석 농도에서 신호가 희미한되어, 그 경향은 구별하기 어렵다. 또한, 형광 신호로 인해 미디어의 세포에 세포 변형 및 입자 현탁액에 잡음이 될 수 있습니다. 따라서, 각 샘플의 5 회 반복는 신뢰할 수있는 결과 11을 권장합니다.
일부 프로토콜은 측정 10,20,21을 교정 트리 올레 오일로서 표준을 사용한다. 이 기술은 그러한 Bacillariophyceae 및 Dinophyceae 같은 조류의 특정 종의 성공으로보고되었지만, 인해 세포막 확산 제한 등 클로렐라 같은 두꺼운 벽의 조류 덜 적합하다. 또한, 트리 올레 인의 첨가는 표준 및 지질 체 선도 t 사이 나일 레드 분자의 분포를 방해 할 수기름 내용의 O 부정확 한 추정. 표준으로 알려진 기름 내용의 조류 샘플을 사용하면 이러한 잠재적 인 부족을 방지하고 바이오 매스 및 성장 조건에 의해 발생하는 배경 형광를 차지한다.
본 연구에서 제시하는 프로토콜은 조류의 샘플에서 중성 지질을 정량화, 간단한 저렴하고 빠른 방법을 제공한다. 멀티 웰 플레이트를 사용하여, 높은 샘플 처리량은 다른 염색 프로토콜을 통해 시간을 크게 절감 달성된다. 또, 분석의 조건을 재현 선형 추세를 수득하기 위해 최적화되었다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는이 프로젝트에 대한 재정 지원을 제공하기 위해 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur glass pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
- Chisti, Y.
- National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , Available from: http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf (2010).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy. Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Hara, A., Radin, N. S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).
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