Un semplice protocollo per determinare il contenuto di lipidi neutri di cellule algali utilizzando una procedura di colorazione rosso Nilo è descritto. Questa tecnica consente di risparmiare tempo offre un'alternativa ai protocolli di quantificazione lipidi basato gravimetrici tradizionali. E 'stato progettato per la specifica applicazione di monitoraggio delle prestazioni bioprocess.
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Articolo metodologico
Una semplice e rapida il protocollo per la misurazione lipidi neutri in cellule algali Uso fluorescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le alghe sono considerati ottimi candidati per fonti di energia rinnovabili a causa della loro capacità di stoccaggio dei lipidi naturali. Un efficiente monitoraggio dei processi di fermentazione algali e screening per nuovi ceppi ricchi di petrolio richiede un protocollo veloce e affidabile per la determinazione del contenuto lipidico intracellulare. Pratiche attuali si basano in gran parte su metodi gravimetrici per determinare il contenuto di olio, tecniche sviluppati decenni fa che richiedono molto tempo e richiedono grandi volumi di campione. In questo lavoro, Nilo rosso, un colorante fluorescente che è stato utilizzato per identificare la presenza di corpi lipidici in numerosi tipi di organismi, è incorporato in un protocollo semplice, veloce, affidabile per misurare il contenuto di lipidi neutri di protothecoides Auxenochlorella, una verde alga. Il metodo utilizza etanolo, un solvente relativamente mite, per permeabilize membrana cellulare prima della colorazione e un 96 ben micropiastra per aumentare la capacità campione durante fluorescenza misure di intensità. E 'stato il designed con l'applicazione specifica di monitoraggio delle prestazioni bioprocess. Campioni precedentemente essiccati o campioni dal vivo da una coltura in crescita possono essere utilizzati nel saggio.
Introduzione
Grazie alla loro capacità di immagazzinare corpi lipidici in determinate condizioni di stress, alghe hanno ricevuto molta attenzione negli ultimi anni come potenziale fonte di combustibile rinnovabile 1,2. Lipidi neutri possono rappresentare oltre il 60% del peso secco cella sotto opportune condizioni di crescita 3. Ma l'industria non ha un protocollo standardizzato semplice, pulito, veloce e affidabile per quantificare il contenuto lipidico delle cellule algali al fine di monitorare adeguatamente le prestazioni bioprocess, analizzare le culture, e lo schermo per nuovi ceppi.
Il metodo gravimetrico Bligh-Dyer ha ....
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Protocollo
1. Isolamento di lavaggio a biomassa algale per essere utilizzato come standard per la fluorescenza Letture
- Rimuovere un volume di campione dalla crescente coltura algale che fornirà almeno 200 mg di biomassa secca, 400-600 mg è preferibile.
- Centrifugare campione a 4 ° C per 10 min a 10000 x g. Eliminare il supernatante e lavare il pellet con un volume uguale di tampone fosfato formulato per lo stesso pH come i mezzi di crescita.
- Ripetere passo 1.2 per un totale di 3 fasi di lavaggio.
- Risospendere il pellet in acqua deionizzata e trasferire ad un piatto pre-tarato pesare. Lasciare asciugare a 50 ° C per 48 ore. NOTA: Essiccazi....
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Risultati
Cellule algali Rappresentante colorate con Nile Red colorante sono rappresentati in Figura 1. Parti A e B della figura 1 mostra immagini di A. protothecoides coltivate in eccesso di azoto, portando a molto basso accumulo di lipidi intracellulari. In parti C e D, i campioni di A. protothecoides coltivate sotto limitazione di azoto vengono visualizzati. Sotto illuminazione trasmissione, i corpi lipidici .......
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Discussione
Le alghe utilizzate nella curva standard deve essere la stessa specie coltivate nelle stesse condizioni sperimentali come quelle oggetto di valutazione. Cambiamenti significativi nella composizione media, tecnica di coltivazione, e il protocollo di colorazione possono influenzare l'intensità della lettura della fluorescenza. Estrazione con esano (descritte ai punti 1 e 2) è stata utilizzata per determinare il contenuto di lipidi neutri di campioni utilizzati nella curva standard. Per misure di intensità di fluoresce.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare le scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada per la fornitura di un sostegno finanziario per questo progetto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Peso | |||
| Pipette monouso da 25 ml | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipetta a bulbo | Fisher | 13-681-51 | |
| Provette da centrifuga in teflon Nalgene da 40 ml | Fisher | 05-562-16A | Teflon necessario per piatti di pesatura in esano |
| (polipropilene) | Microcentrifuga Fisher | 2-202B | |
| da 1,5 ml provette | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuga | Sorvall | RC6plus | |
| Forno di essiccazione (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Fiale di conservazione | Fisher | 0337-4 | |
| Microcentrifuga da banco (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Quantificazione gravimetrica | |||
| Mortaio in porcellana (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Pestello in porcellana (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| Provette da centrifugazione da 40 ml (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Potrebbe anche usare tubi di vetro |
| Pipette in vetro Pasteur | Fisher | 13-678-20C | |
| Piatti di pesatura in alluminio | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Quantificazione fluorimetrica del contenuto | |||
| Lettore di piastre multipozzetto a fluorescenza | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Software per lettore di fluorescenza | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR Piastra a 96 pozzetti con fondo tondo | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Etanolo (grado di reagente alcolico) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Cellule | |||
| Microscopio Leica DMRXA2 (o equivalente) | DMRXA2 | ||
| Vetrini per microscopio | Fisher | 12-550-15 | |
| Vetrini copri monitor | Fisher | 12-541B | |
| Fotocamera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Software di imaging | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
Riferimenti
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).
- National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and....
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Ristampe e permessi
