Summary
Un semplice protocollo per determinare il contenuto di lipidi neutri di cellule algali utilizzando una procedura di colorazione rosso Nilo è descritto. Questa tecnica consente di risparmiare tempo offre un'alternativa ai protocolli di quantificazione lipidi basato gravimetrici tradizionali. E 'stato progettato per la specifica applicazione di monitoraggio delle prestazioni bioprocess.
Abstract
Le alghe sono considerati ottimi candidati per fonti di energia rinnovabili a causa della loro capacità di stoccaggio dei lipidi naturali. Un efficiente monitoraggio dei processi di fermentazione algali e screening per nuovi ceppi ricchi di petrolio richiede un protocollo veloce e affidabile per la determinazione del contenuto lipidico intracellulare. Pratiche attuali si basano in gran parte su metodi gravimetrici per determinare il contenuto di olio, tecniche sviluppati decenni fa che richiedono molto tempo e richiedono grandi volumi di campione. In questo lavoro, Nilo rosso, un colorante fluorescente che è stato utilizzato per identificare la presenza di corpi lipidici in numerosi tipi di organismi, è incorporato in un protocollo semplice, veloce, affidabile per misurare il contenuto di lipidi neutri di protothecoides Auxenochlorella, una verde alga. Il metodo utilizza etanolo, un solvente relativamente mite, per permeabilize membrana cellulare prima della colorazione e un 96 ben micropiastra per aumentare la capacità campione durante fluorescenza misure di intensità. E 'stato il designed con l'applicazione specifica di monitoraggio delle prestazioni bioprocess. Campioni precedentemente essiccati o campioni dal vivo da una coltura in crescita possono essere utilizzati nel saggio.
Introduction
Grazie alla loro capacità di immagazzinare corpi lipidici in determinate condizioni di stress, alghe hanno ricevuto molta attenzione negli ultimi anni come potenziale fonte di combustibile rinnovabile 1,2. Lipidi neutri possono rappresentare oltre il 60% del peso secco cella sotto opportune condizioni di crescita 3. Ma l'industria non ha un protocollo standardizzato semplice, pulito, veloce e affidabile per quantificare il contenuto lipidico delle cellule algali al fine di monitorare adeguatamente le prestazioni bioprocess, analizzare le culture, e lo schermo per nuovi ceppi.
Il metodo gravimetrico Bligh-Dyer ha sviluppato circa 50 anni fa, rimane tra le tecniche più comuni utilizzate oggi 4,5. Mentre questo procedimento è semplice, affidabile, e facile da realizzare, che richiede tempo, richiede grandi volumi di campione, e fa uso di solventi tossici. Non è pratico per analizzare molti campioni da una corsa di fermentazione o di screening per nuovi ceppi ricchi di petrolio. Altri metodi hanno bEEN sviluppato, ma di solito richiedono attrezzature avanzate e non sono stati standardizzati 6.
Un'alternativa che ha raccolto un grande interesse è la macchia Nile Red. Nilo Red, un colorante che reagisce preferenzialmente in ambienti non polari, è stato usato per identificare o quantificare corpi lipidici in vari organismi tra nematodi 7, lievito 8, 9, batteri e alghe 10-19. Tecniche iniziali coinvolgono Nile Red erano per lo più qualitativa o semi-quantitativa, che unisce la macchia con una sola cuvetta spettrofotometria o citometria a flusso. Inoltre, alcune classi di alghe come alghe verdi hanno pozzi cellulari spesse che sono per lo più impermeabile al colorante, che limita la gamma della tecnica 10.
Recenti miglioramenti al metodo di colorazione rosso Nilo sono stati segnalati che bypassare le carenze iniziali del protocollo 10,11. Colorazione delle cellule in presenza di un carrier solvente come DMSO 10 o etanolo 10,11 linearizza il rapporto tra contenuto di olio e l'assorbanza, consentendo misurazioni quantitative affidabili. Il solvente aiuta permeabilize membrana cellulare in modo che le molecole Nilo rossi possono passare attraverso. Inoltre, incorporando uno spettrofotometro con capacità di lettura micro-piastra consente protocolli di throughput elevate adatte per l'analisi quantitativa.
In questo articolo abbiamo dettaglio un metodo semplice per misurare il contenuto di olio di cellule algali mediante colorazione culture con Nile Red in presenza di etanolo, un solvente delicato. Per più esattamente conto di rumore di fondo nelle misure, una curva standard correlazione intensità di fluorescenza al contenuto di olio è stato sviluppato utilizzando cellule algali di nota composizione di olio. Il metodo è adattato da protocolli precedentemente pubblicati 10,11. Utilizzando uno spettrofotometro a 96 pozzetti, si è in grado di analizzare la stessa quantità di campioni in un tha un'orat avrebbe preso giorni di tempo per monitorare con metodi gravimetrici. Inoltre, calibrando utilizzando campioni rappresentativi della specie algale desiderato questo metodo produce misurazioni relativamente precise che sono direttamente interpretabili. Esistono molti protocolli che descrivono i metodi di colorazione alghe con Nile Red ottimizzato per i ceppi e le diverse applicazioni; il protocollo qui presentato è stato originariamente sviluppato da de la Hoz Siegler et al. 11 per protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, e Scenedesmus obliquo, anche se è probabile adatto a molte più specie e classi. E 'stato progettato con l'applicazione specifica di monitoraggio delle prestazioni bioprocessi e funziona altrettanto bene per i campioni precedentemente essiccati e campioni bagnato da una cultura in crescita.
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Protocol
1. Isolamento di lavaggio a biomassa algale per essere utilizzato come standard per la fluorescenza Letture
- Rimuovere un volume di campione dalla crescente coltura algale che fornirà almeno 200 mg di biomassa secca, 400-600 mg è preferibile.
- Centrifugare campione a 4 ° C per 10 min a 10000 x g. Eliminare il supernatante e lavare il pellet con un volume uguale di tampone fosfato formulato per lo stesso pH come i mezzi di crescita.
- Ripetere passo 1.2 per un totale di 3 fasi di lavaggio.
- Risospendere il pellet in acqua deionizzata e trasferire ad un piatto pre-tarato pesare. Lasciare asciugare a 50 ° C per 48 ore. NOTA: Essiccazione sotto vuoto si riduce il tempo di asciugatura ed essiccazione della cultura a temperature superiori a 50 ° C può rendere difficile la risospensione.
- Conservare secca colture algali a temperatura ambiente per un utilizzo futuro.
2. Quantificazione gravimetrico di lipidi neutri da esano estrazione (Adattato da Bligh e Dyer 4)
- Misura circa 50 mg di alghe secca biomassa in un piatto di pesatura. NOTA: Le masse che vanno 40-80 mg possono essere utilizzati senza perdita di riproducibilità.
- Trasferire la biomassa di una malta pre-lavato con esano. Se necessario, lavare il piatto pesare con una piccola quantità (1 ml) di esano con una pipetta Pasteur per trasferire completamente i biomassa alla malta. NOTA: esano è una sostanza altamente volatile e tossico. Si deve essere gestita in cappa con abbigliamento protettivo adeguato.
- Macinare la biomassa algale per 5 minuti utilizzando un pestello. Inizia con macinazione dolce e aumentare gradualmente l'intensità. Macinare la biomassa in una pasta fine e liscia nel periodo di 5 min. Se eccesso esano viene utilizzato quando si trasferisce la biomassa alla malta, è meglio attendere la esano evapori prima della macinazione.
- Aggiungere alcuni ml di esano al mortaio e mescolare l'impasto risultante con il pestello finché non viene omogeneizzato. Assicurarsi che tutti i detriti cellulari aderito alle pareti della mortar sono bussò libero e sospeso nel liquido.
- Trasferire la miscela esano-massa cellulare in una provetta da centrifuga. NOTA: Il tubo da centrifuga deve essere di vetro o un polimero adatto compatibile con esano come il Teflon.
- Ripetere le fasi 2.4 e 2.5 finché tutta la biomassa è stata trasferita al tubo da centrifuga (3-5x).
- Centrifugare il campione a 4 ° C per 20 min a 10.000 x g.
- Pipetta con attenzione il surnatante in un metallo pre-tarato pesare piatto. Conservare nella cappa.
- Eseguire un'estrazione 2 nd esano aggiungendo 3 ml di esano al pellet e vortex vigorosamente per 1 min.
- Ripetere i punti 2.7 e 2.8. Se necessario, eseguire gli esempi per 30 minuti nella centrifuga durante la seconda estrazione per garantire che tutti i detriti cellulari deposita completamente. Determinare la massa di petrolio estratto gravimetrica dopo esano è completamente evaporata.
3. Fluorimetrica Quantificazione dei lipidi neutri Utilizzo Nile Red (come Reported da de la Hoz Siegler et al. 11)
NOTA: Soltanto 10 ml di una sospensione algale a 5 g / L è necessario per la lettura della fluorescenza. Generalmente, l'isolamento di biomassa algale secco da 1,5 ml di brodo di coltura è più che sufficiente. Inoltre, l'intensità luminosa della lampada allo spettrofotometro può degradare nel tempo. Si raccomanda di includere standard in ogni esperimento per garantire che le variazioni dello strumento non aggiungono errore inutili alle misurazioni.
- Preparare una soluzione Nilo rosso ad una concentrazione di 10 ug / ml disciolti in etanolo di grado reagente alcol. Conservare questa soluzione al buio a 4 ° C.
- Preparare un 30% (v / v) di etanolo in acqua deionizzata e conservare a 4 ° C.
- Preparare tutti i campioni algali alla stessa concentrazione di biomassa (si consiglia 5 g / L) e nello stesso modo dei campioni utilizzati nella misurazione. Per fare ciò, sia la sospensione dei campioni pre-essiccati in quantità appropriatadi tampone fosfato (0,6 g / l di potassio fosfato dibasico, 1,4 g / L di potassio fosfato monobasico), o regolando la concentrazione di una coltura algale crescente a 5 g / L di tampone fosfato dopo la misurazione della torbidità. NOTA: misure effettuate su colture algali vivi spesso hanno grande errore associato con loro a seconda della precisione della curva di calibrazione torbidità. Risospendere campioni essiccati può richiedere l'uso di un omogeneizzatore per disperdere completamente la biomassa.
- Per ciascun campione, mescolare 80 ml di soluzione di etanolo al 30%, 10 ml di soluzione di rosso Nilo, e 10 ml di sospensione algale in un singolo pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. Per rendere adeguatamente conto della variabilità della misurazione di fluorescenza, eseguire 5 repliche di ciascun campione.
- Eseguire una curva di calibrazione a due punti con le norme preparate in precedenza, al fine di tener conto giorno per giorno le variazioni dello strumento e preparazione. Preparare gli standard per la misurazione della fluorescenza con il sProcedura ame come i campioni. NOTA: Generalmente due punti è sufficiente per la ricalibrazione dello strumento, tre punti possono essere eseguiti per verificare la linearità.
- Eseguire le misure di fluorescenza in un multi-lettore di piastra ben spettrofotometro. Sono stati trovati i seguenti condizioni per produrre i risultati più coerenti 11:
- Agitare a 1.200 rpm, orbita 3 mm per 30 sec.
- Incubare a 40 ° C per 10 min.
- Agitare a 1.200 rpm, orbita 3 mm per 30 sec.
- Record fluorescenza, eccitazione a 530 nm, emissione a 604 nm.
- Convertire le misure di fluorescenza al contenuto di olio utilizzando i risultati degli standard interni.
4. Tecnica di microscopia a fluorescenza
NOTA: Il protocollo di colorazione descritto nella sezione 3 è progettato per l'analisi quantitativa, ma può anche essere utile per fornire rappresentazioni visive di tecniche basate macchie scopo didattico e illustrativo purposes. Per produrre immagini di fluorescenza del campione si richiede un microscopio ottico con fonti di trasmissione e aggiuntivi di illuminazione epifluorescenza tradizionali. Eccitazione e di emissione luce filtra nell'intervallo 530 nm (verde) e 604 nm (rosso), rispettivamente, sono necessari per la macchia rossa Nilo così come una telecamera montata microscopio con software associato. Le immagini mostrate in questo studio (Figura 1) sono state acquisite utilizzando un microscopio a campo chiaro dotato di una fotocamera e monocromatica di RGB convertitore di unità. La procedura per la produzione di immagini di fluorescenza Nile Red utilizzo di questi strumenti è descritto di seguito:
- Preparare un campione di cultura con la macchia Nile Red secondo la sezione 3 del protocollo. NOTA: un campione nella gamma di concentrazione di 5 g / L produce diapositive di un'adeguata densità cellulare, senza sovraffollamento.
- Dopo aver completato il punto 3.6 del protocollo di colorazione, preparare un vetrino da microscopio del campione processato secondo le procedure standard di laboratorio.
- Partendo con il microscopio in modalità di trasmissione, caricare la slitta preparata nel microscopio, e individuare le cellule a l'ingrandimento desiderato (immagini mostrate in questo articolo sono state acquisite con l'obiettivo 100X).
- Una volta messo a fuoco, spegnere il microscopio dalla trasmissione alla modalità di illuminazione epifluorescenza. La sorgente di luce deve ora essere provenienti direttamente dalla lente obiettivo (questo può essere confermata visivamente osservando lo spazio tra la slitta e la lente obiettivo).
- Inserire un filtro di eccitazione verde la fonte di luce e un filtro per le emissioni rosso nel percorso ottico di osservazione; La fluorescenza delle cellule colorate dovrebbe essere direttamente visibile attraverso l'oculare.
- Cambiare la modalità di osservazione al microscopio dall'oculare alla telecamera montata e utilizzare software di visualizzazione per catturare un'immagine delle cellule fluorescenti. A seconda della sensibilità della telecamera, il campione non si può visualizzare inizialmente nella finestra di anteprima (cioè lo schermo siessere nero); per ovviare a questo, regolare il tempo di esposizione e il guadagno della telecamera ad un livello in cui le cellule sono visibili. Impostazioni specifiche varieranno con strumenti, attrezzature e tipi di cellule.
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Representative Results
Cellule algali Rappresentante colorate con Nile Red colorante sono rappresentati in Figura 1. Parti A e B della figura 1 mostra immagini di A. protothecoides coltivate in eccesso di azoto, portando a molto basso accumulo di lipidi intracellulari. In parti C e D, i campioni di A. protothecoides coltivate sotto limitazione di azoto vengono visualizzati. Sotto illuminazione trasmissione, i corpi lipidici della cellula possono essere visualizzati con un'attenta ispezione della figura 1C, dove appaiono come strutture circolari lucide e costituiscono la maggior parte del volume cellulare. Le cellule illustrati nella Figura 1A, che sono state coltivate in eccesso di azoto, sono l'olio solo il 5% in peso secco e non contengono livelli significativi di corpi lipidici.
Quando mostrato in condizioni di luce adeguate, le differenze di questi campioni sono ingrandite. Le cellule petrolio magraappaiono come anelli fluorescenti con corpi scuri (Figura 1B), mentre le cellule ricche di petrolio mostrano un luminoso rosso-arancione bagliore dove hanno accumulato corpi lipidici (Figura 1D). In Figura 1D, è più difficile vedere la debole fluorescenza della membrana cellulare e altre strutture cellulari. Nilo Red sarà fluorescenza in presenza di proteine non-polari come lipidi, motivo per cui la membrana cellulare e altre strutture cellulari forniscono un livello di fluorescenza di fondo durante la misurazione dello spettrofotometro.
Nelle condizioni ottimali del saggio, curve di taratura con R 2 valori superiori a 0.980 sono facilmente raggiungibili (Figura 2A). Il rapporto tra contenuto di olio cella e fluorescenza diventa non lineare se le cellule sono colorate in una soluzione priva di un vettore solvente come etanolo. I dati presentati in Figura 2B, con un R2 di 0,395, erano 60; ottenuto eseguendo il protocollo in una soluzione di etanolo 0% (acqua pura deionizzata).
Figura 1. Immagini di A. protothecoides colorate con Nile Red. un campione d'olio magro (4,4% contenuto di olio in peso secco) è rappresentata in A) trasmesse microscopia ottica e B) illuminazione epifluorescenza con filtro di eccitazione verde (510 nm). I corpi lipidici colorati con Nile Red fluorescenza a 604 nm. Un campione ricco di petrolio (54,7% contenuto di olio in peso secco) è mostrato in C) e D) nelle medesime condizioni di luce trasmessi e epifluorescenza come A) e B), rispettivamente.nk "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Curve di calibrazione correlando il contenuto di idrocarburi A. protothecoides a fluorescenza intensità. In A), i campioni sono stati preparati secondo il protocollo descritto. In B), i campioni sono stati preparati in una soluzione di etanolo 0% (acqua deionizzata). Barre di errore verticali rappresentano la deviazione standard di cinque repliche dello spettrofotometro. Barre di errore orizzontali segnalano la deviazione standard di almeno tre repliche della quantificazione gravimetrico di lipidi neutri. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
| Chimico | Azienda | Concentrazione |
| KH 2 PO 4 | Fisher Scientific | 2,8 g · L -1 |
| K 2 HPO 4 | Fisher Scientific | 1,2 g · L -1 |
| MgSO 4 · 7H 2 O | Fisher Scientific | 1,2 g · L -1 |
| FeSO 4 · 7H 2 O | Fisher Scientific </ Td> | 48 mg · L -1 |
| H 3 BO 3 | Fisher Scientific | 11.6 mg · L -1 |
| CaCl 2 · 2H 2 O | Fisher Scientific | 10 mg · L -1 |
| MnCl 2 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 7.2 g · L -1 |
| ZnSO 4 · 7H 2 O | Fisher Scientific | 0.88 mg · L -1 |
| CuSO 4 · 5H 2 O | Fislei scientifico | 0.32 mg · L -1 |
| Na 2 MoO 4 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 0.12 mg · L -1 |
| cloridrato di tiamina | Fisher Scientific | 40 mg · L -1 |
| glucosio | Fisher Scientific | 30 g · L -1 |
| glicina | Fisher Scientific | 0,2-2,0 g · L -1 |
Tabella 1. Cultura dei media ricetta. Tutti i reagenti erano di grado analitico.Le soluzioni sono state preparate con acqua deionizzata. La concentrazione di glicina è stato usato per controllare il rapporto carbonio azoto nella coltura e di conseguenza, il contenuto di olio finale delle alghe. Cellule che vanno dal 8,5% al 55% di contenuto di lipidi neutri in massa (base secca) sono stati usati per fare la curva standard.
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Discussion
Le alghe utilizzate nella curva standard deve essere la stessa specie coltivate nelle stesse condizioni sperimentali come quelle oggetto di valutazione. Cambiamenti significativi nella composizione media, tecnica di coltivazione, e il protocollo di colorazione possono influenzare l'intensità della lettura della fluorescenza. Estrazione con esano (descritte ai punti 1 e 2) è stata utilizzata per determinare il contenuto di lipidi neutri di campioni utilizzati nella curva standard. Per misure di intensità di fluorescenza accurate, tutti i campioni devono essere analizzati alla stessa concentrazione di biomassa (5 g / L è stato utilizzato in questo studio). Contenuto di olio può essere facilmente determinata per confronto con la curva standard. Per questo protocollo, alghe erano coltivate in fiaschi di scuotimento in condizioni eterotrofi (28 ° C, 100 rpm) con glucosio come fonte di carbonio (30 g / L) e glicina come sorgente di azoto (0,2-2,0 g / L). Per una ricetta più dettagliata dei media, vedi Tabella 1.
Una considerazione importante nello svolgimento delprotocollo sono le condizioni per l'essiccamento della biomassa algale umido durante la preparazione della curva standard. Si raccomanda un forno a vuoto a 45 ° C. Un forno convenzionale a 45-50 ° C anche bastare fino a quando il tempo supplementare è permesso di asciugare completamente i campioni (24-48 h). Temperature superiori ai 50 ° C può causare la biomassa di fondere insieme o formare una crosta impenetrabile che non è facilmente risospendere in tampone fosfato. Risospensione può essere aiutata con l'uso di un omogeneizzatore. Additivi chimici come tensioattivi o una base forte dovrebbe essere evitato come questi di solito influenzano la lettura della fluorescenza. Culture secchi possono essere conservati fino a 6 mesi in un contenitore sigillato senza provare degradazione significativa dei lipidi. Si noti che le misurazioni effettuate su colture algali vivi spesso hanno grande errore associato con loro a seconda della precisione della curva di calibrazione torbidità.
Un'altra considerazione è la concentrazione di etanolo utilizzato per eseguire la samples nel lettore micro-placca. Etanolo agisce come un solvente veicolante, facilitando il trasporto di molecole Nilo rossi nella cellula. A basse concentrazioni (<30%) il rapporto tra contenuto di olio e fluorescenza diventa non lineare a causa della scarsa diffusione attraverso la membrana cellulare (Figura 2B). A concentrazioni più elevate di etanolo, miglioramento della linearità si ottiene a scapito della diminuzione di intensità di fluorescenza (Figura 2A). Per protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, e Scenedesmus obliquo, una concentrazione di etanolo del 30% è stato trovato per dare l'ottimale trade-off tra migliorato linearità e ridotta intensità di fluorescenza 11. Può essere necessario regolare la concentrazione di etanolo per ottimizzare i risultati di altri organismi.
La scelta del corretto eccitazione e di emissione per la lettura della fluorescenza nei campioni algali è fondamentale per assicure solo lipidi neutri sono inclusi nella misurazione. Nilo Red intensità di fluorescenza varierà a diverse lunghezze d'onda dipendenti dalla polarità dell'ambiente 11,13. Per A. protothecoides, il picco di emissione di lipidi neutri si osserva a 590 nm; un picco secondario che rappresenta più lipidi polari può essere osservata a 645 nm 11. Di conseguenza, le misurazioni dell'intensità di fluorescenza descritte in questa procedura sono state eseguite utilizzando un filtro di eccitazione 530 nm, con metà larghezza di banda = 10 nm, ed un filtro di emissione 604 nm, con metà larghezza di banda = 10 nm. Scelta di eccitazione e di lunghezza d'onda di emissione devono essere verificate per ogni ceppo di alghe testato.
Dal Nilo Red sarà fluorescenza in qualsiasi ambiente non polare, strutture cellulari oltre a corpi lipidici verranno rilevate dallo spettrofotometro (vedere Figura 1B). Questo fatto, in combinazione con l'eterogeneità della biomassa cellulare, porta ad una relazione non lineare trabiomassa cellulare e fluorescenza 11. Questo problema è risolto garantendo tutti i campioni sono preparati ad un peso costante secco (5 g / L ®). A concentrazioni diluite il segnale diventa debole e le sue tendenze sono difficili da distinguere. Inoltre, il segnale di fluorescenza può essere rumoroso a causa cellula-cellula variazioni e sospensioni particolato nei media. Di conseguenza, 5 repliche di ogni campione sono consigliati per risultati affidabili 11.
Alcuni protocolli utilizzano uno standard olio come trioleina per calibrare la misura 10,20,21. Mentre questa tecnica è stato segnalato con successo per alcune specie di alghe come Bacillariophyceae e Dinophyceae, è meno adatto per le alghe pareti spesse quali Chlorella causa di limitazioni di diffusione attraverso la membrana cellulare. Inoltre, l'aggiunta di trioleina può disturbare la distribuzione delle molecole Nilo rossi tra lo standard ed il corpi lipidici, portando tO stime imprecise di contenuto di olio. Utilizzando campioni algali di nota contenuto di olio come standard evita questi potenziali carenze e rappresenta alcuna fluorescenza di fondo causato dalle condizioni biomasse e di crescita.
Il protocollo presentato in questo studio fornisce un metodo semplice, economico e rapido di quantificare lipidi neutri in campioni algali. Utilizzando un piatto multi-bene, throughput di campionamento elevate si ottengono con notevole risparmio di tempo rispetto ad altri protocolli di colorazione. Inoltre, le condizioni del saggio sono stati ottimizzati per produrre andamenti lineari riproducibili.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare le scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada per la fornitura di un sostegno finanziario per questo progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur glass pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
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