Summary
Um protocolo simples para determinar o teor de lípidos neutros de células de algas com um procedimento de coloração com Vermelho do Nilo é descrito. Esta técnica de poupança de tempo, oferece uma alternativa aos protocolos de quantificação de lípidos tradicionais à base gravimétrica. Ele foi projetado para a aplicação específica do desempenho do monitoramento de bioprocessos.
Abstract
As algas são consideradas excelentes candidatos para as fontes de combustível renováveis, devido às suas capacidades de armazenamento de lipídios naturais. Monitoramento robusto de processos de fermentação de algas e de triagem para novas linhagens ricas em petróleo requer um protocolo rápido e confiável para a determinação do teor de lipídios intracelulares. As práticas atuais dependem em grande parte de métodos gravimétricos para determinar o teor de óleo, técnicas desenvolvidas décadas atrás, que são demoradas e exigem grandes volumes de amostra. Neste papel, Vermelho do Nilo, um corante fluorescente que foi usado para identificar a presença de corpos de lípidos em vários tipos de organismos, é incorporado um protocolo simples, rápido e fiável para a medição do teor de lípidos neutros de protothecoides Auxenochlorella, um verde alga. O método utiliza o etanol, um solvente relativamente suave, para permeabilizar a membrana da célula, antes da coloração e uma de 96 cavidades de micro-placa para aumentar a capacidade da amostra durante as medições da intensidade de fluorescência. Ele foi projetoed com a aplicação específica do desempenho do monitoramento de bioprocessos. As amostras previamente secas ou amostras vivas de uma cultura de crescimento pode ser utilizado no ensaio.
Introduction
Devido à sua capacidade de armazenar corpos lipídicos sob certas condições de estresse, as algas têm recebido uma grande atenção nos últimos anos como uma potencial fonte de combustível renovável 1,2. Lípidos neutros pode representar mais de 60% do peso seco da célula sob condições de crescimento apropriadas 3. No entanto, a indústria não tem um protocolo padronizado simples, limpo, rápido e confiável para quantificar o conteúdo lipídico de células de algas, a fim de monitorar adequadamente o desempenho de bioprocessos, analisar as culturas, e na tela de novas linhagens.
O método gravimétrico Bligh-Dyer desenvolvido há 50 anos permanece entre as técnicas mais comuns usados hoje 4,5. Enquanto este processo é simples, confiável e fácil de transportar para fora, que é demorada, necessita grandes volumes de amostra, e faz uso de solventes tóxicos. Não é prático para analisar muitas amostras de uma corrida de fermentação ou a triagem para novas linhagens ricas em petróleo. Outros métodos têm been desenvolvido, mas geralmente necessitam de equipamento avançado e não foram normalizados 6.
Uma alternativa que tem atraído uma grande quantidade de interesse é a mancha Nilo Vermelho. Vermelho do Nilo, um corante que fluoresce preferencialmente em ambientes não-polar, foi utilizado para identificar ou quantificar corpos de lípidos em vários organismos incluindo nemátodos 7, 8 leveduras, bactérias e algas 9, 10-19. Técnicas iniciais envolvendo Nilo Red eram na maior parte qualitativa ou semi-quantitativa, combinando a mancha com uma única tina espectrofotometria ou citometria de fluxo. Além disso, algumas classes de algas, tais como algas verdes têm poços com células de espessura, que são principalmente impermeável à do corante, que limitam o alcance da técnica 10.
As recentes melhorias para o método de coloração Vermelho do Nilo foram relatados que ignorar as deficiências iniciais do protocolo 10,11. Coloração das células na presença de um carrier solvente tal como DMSO a 10 ou 10,11 etanol lineariza a relação entre o teor de óleo e de absorção, permitindo medições quantitativos fiáveis. O solvente ajuda a permeabilizar a membrana da célula de modo a que as moléculas de Nile Red pode passar. Além disso, a incorporação de um espectrofotómetro com capacidade de leitura de micro-placa permite protocolos adequados de alto rendimento para a análise quantitativa.
Neste artigo, detalhe um método simples para medir o teor de óleo de células de algas por coloração de culturas com Vermelho do Nilo, na presença de etanol, um solvente leve. A fim de mais precisão representam ruído de fundo nas medições, uma curva padrão relacionando a intensidade de fluorescência para o teor de óleo é desenvolvido utilizando células de algas da composição de óleo conhecidos. O método é adaptado a partir de protocolos publicados anteriormente 10,11. Usando um espectrofotómetro de 96 poços, é capaz de analisar a mesma quantidade de amostras num tha horat levaria dias para monitorar por métodos gravimétricos. Além disso, através da calibração com amostras representativas das espécies de algas desejado este método produz medições relativamente precisas que são directamente interpretável. Existem muitos protocolos descrevendo os métodos de coloração de algas com Nile Red otimizado para diferentes cepas e aplicações; o protocolo aqui apresentado foi desenvolvido originalmente por de la Hoz Siegler et al. 11 para protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus e Scenedesmus oblíquo, embora seja provável adequado para muitas outras espécies e classes. Ele foi projetado com a aplicação específica de desempenho de monitoramento de bioprocessos e funciona igualmente bem para amostras previamente secas e molhadas amostras de uma crescente cultura.
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Protocol
1. Isolamento de seco de algas biomassa a ser utilizadas como padrões de fluorescência Leituras
- Retirar um volume de amostra a partir da cultura de crescimento de algas que vai proporcionar, pelo menos, 200 mg de biomassa seca, 400-600 mg é preferível.
- Amostra Centrifugar a 4 ° C durante 10 min a 10.000 x g. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com um volume igual de tampão fosfato formulado para o mesmo pH que o meio de crescimento.
- Repita o passo 1.2 para um total de 3 etapas de lavagem.
- Re-suspender a pelete em água desionizada e transferir para um prato pré-pesado pesar. Deixar secar a 50 ° C durante 48 hr. NOTA: A secagem sob vácuo irá diminuir o tempo de secagem e a secagem da cultura, a temperaturas acima de 50 ° C, pode tornar difícil a ressuspensão.
- Armazenar seco de algas culturas à temperatura ambiente para uso futuro.
2. Quantificação gravimétrica de lipídios neutros por hexano Extraction (Adaptado de Bligh e Dyer 4)
- Medir aproximadamente 50 mg de biomassa algal seco em um prato de pesar. NOTA: Massas variando 40-80 mg pode ser utilizado sem perda de reprodutibilidade.
- Transferir a biomassa para um almofariz pré-lavado com hexano. Se necessário, lavar a louça pesar com uma pequena quantidade (1 ml) de hexano, utilizando uma pipeta de Pasteur, a fim de transferir totalmente a biomassa para a argamassa. NOTA: Hexano é uma substância altamente volátil e tóxico. Ele deve ser tratado da coifa com roupa de proteção adequada.
- Moer a biomassa de algas por 5 minutos usando um pilão. Comece com moagem suave e aumentar gradualmente a intensidade. Moer a biomassa em uma pasta fina e lisa no período de 5 min. Se o excesso de hexano é usado na transferência da biomassa para a argamassa, é melhor esperar para o hexano se evaporar antes de moagem.
- Adicionar algumas ml de hexano para a argamassa e misturar a pasta resultante com o pilão até que é homogeneizada. Certifique-se que todos os restos de células aderidas às paredes da mortar são batidos livre e suspenso no líquido.
- Transferir a mistura de massa de células-hexano para um tubo de centrífuga. NOTA: O tubo de centrifugação deve ser de vidro ou de um polímero adequado compatível com hexano, tais como Teflon.
- Repita os passos 2.4 e 2.5, até que toda a biomassa ter sido transferida para o tubo de centrifugação (3-5x).
- Centrifugar a amostra a 4 ° C durante 20 min a 10.000 x g.
- Pipetar cuidadosamente o sobrenadante para um metal pré-pesado pesar prato. Guarde na coifa.
- Realizar a extracção de um 2 nd hexano por adição de 3 ml de hexano para a pelota e vórtex vigorosamente durante 1 min.
- Repita os passos 2.7 e 2.8. Se necessário, executar as amostras durante 30 minutos na centrífuga durante a segunda extracção para garantir todos os detritos célula resolve inteiramente. Determine a massa de óleo extraído por gravimetria após hexano tenha evaporado completamente.
3. Fluorometric Quantificação de lipídios neutros Usando Nilo Red (como Reported por de la Hoz Siegler et al. 11)
NOTA: Apenas a 10 ul de uma suspensão de algas a 5 g / L é necessário para a leitura de fluorescência. Geralmente, o isolamento de biomassa de algas secas a partir de 1,5 ml de caldo de cultura é mais do que suficiente. Além disso, a intensidade da luz da lâmpada no espectrofotómetro podem degradar ao longo do tempo. Recomenda-se para incluir padrões em cada ensaio para garantir que as variações no instrumento não adicionar erro desnecessário para as medições.
- Prepara-se uma solução de Vermelho do Nilo, a uma concentração de 10 mg / ml dissolvidos em etanol de grau reagente álcool. Conservar a solução no escuro a 4 ° C.
- Prepara-se uma solução de etanol a 30% (v / v) em água desionizada e armazenar a 4 ° C.
- Preparar todas as amostras de algas com a mesma concentração da biomassa (é recomendado 5 g / L) e do mesmo modo que os padrões utilizados na medição. Faça isso por qualquer suspensão amostras pré-secas na quantidade adequadade tampão de fosfato (0,6 g / l de fosfato dibásico de potássio, 1,4 g / L fosfato de potássio monobásico), ou o ajustamento da concentração de uma cultura de crescimento de algas que 5 g / L com tampão de fosfato após a medição da turbidez. NOTA: medições realizadas em culturas de algas vivas, muitas vezes, têm maior erro que lhes estão associados, dependendo da precisão da curva de calibração de turbidez. Ressuspender as amostras secas podem requerer o uso de um homogeneizador para dispersar completamente a biomassa.
- Para cada amostra, misturar 80 mL de solução de etanol a 30%, 10 ul da solução de Vermelho do Nilo, e 10 ul de suspensão de algas em um único poço de uma placa de 96 poços. A fim de justificar adequadamente a variabilidade da medição de fluorescência, realizar 5 repetições de cada amostra.
- Executar uma curva de calibração de dois pontos com os padrões previamente preparados para dar conta para o dia-a-dia variações no instrumento e preparação. Prepare os padrões de medição de fluorescência usando o sprocedimento ame como as amostras. NOTA: Geralmente dois pontos é suficiente para a recalibração do instrumento, três pontos podem ser executados para verificar a linearidade.
- Execute as medições de fluorescência em um multi-bem espectrofotômetro leitor de placas. As condições seguintes foram encontradas para se obter os resultados mais consistentes 11:
- Agitar a 1.200 rpm, a órbita de 3 mm durante 30 segundos.
- Incubar a 40 ° C durante 10 min.
- Agitar a 1.200 rpm, a órbita de 3 mm durante 30 segundos.
- Fluorescência Record, excitação a 530 nm, emissão em 604 nm.
- Convertem-se as medições de fluorescência para o conteúdo de óleo, utilizando os resultados dos padrões internos.
4. Técnica microscopia de fluorescência
NOTA: O protocolo de coloração descrito na seção 3 é projetado para a análise quantitativa, mas também pode ser útil para fornecer representações visuais de técnicas baseadas em mancha de educativo e ilustrativo purposes. Para produzir imagens de fluorescência da amostra requer um microscópio óptico com fontes de transmissão e iluminação epifluorescência adicional tradicionais. Filtros de excitação e de emissão de luz na 530 nm (verde) e 604 nm (vermelho) gama, respectivamente, são necessários para a mancha vermelha do Nilo, bem como uma câmara montada microscópio com software associado. As imagens apresentadas neste estudo (Figura 1) foram obtidas utilizando um microscópio de campo claro equipado com uma câmera e Monochrome a unidade conversor de RGB. O procedimento para a produção de imagens de fluorescência Nilo Red uso dessas ferramentas é descrito abaixo:
- Prepare uma amostra de cultura com a mancha Nilo Red acordo com a secção 3 do protocolo. NOTA: uma amostra na faixa de concentração de 5 g / L produz lâminas de densidade celular adequada, sem superlotação.
- Após concluir o passo 3.6 do protocolo de coloração, preparar uma lâmina de microscópio da amostra processada de acordo com os procedimentos padrão de laboratório.
- Começando com o microscópio no modo de transmissão, coloque o slide preparado para o microscópio, e localizar as células com a ampliação desejada (imagens mostradas neste artigo foram adquiridos com o objetivo 100X).
- Uma vez que o foco, mudar o microscópio de transmissão para o modo de iluminação de epifluorescência. A fonte de luz deve agora ser directamente provenientes da lente objetiva (isso pode ser confirmado visualmente através da observação do espaço entre a lâmina ea lente objetiva).
- Insira um filtro de excitação verde para a fonte de luz e um filtro de emissão vermelha no caminho da luz de observação; a fluorescência das células coradas deverão agora ser directamente visível através da ocular.
- Mude o modo de observação do microscópio ocular para a câmera montada e usar software de visualização para capturar uma imagem das células fluorescentes. Dependendo da sensibilidade da câmera, a amostra pode não parecer inicialmente na janela de visualização (ou seja, a tela seráser preto); para remediar esta situação, ajustar o tempo de exposição e ganho da câmera para um nível em que as células são visíveis. Configurações específicas irá variar de acordo com os instrumentos, aparelhos, e tipos de células.
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Representative Results
Células de algas representativos coradas com o corante Vermelho do Nilo estão representados na Figura 1. Partes A e B da Figura imagens de A. um visor protothecoides crescido em excesso de nitrogênio, o que leva ao acúmulo de lipídios intracelulares muito baixo. Em partes C e D, as amostras de A. protothecoides cultivadas sob limitação de nitrogênio são mostradas. Sob iluminação de transmissão, os corpos lipídicos da célula pode ser visualizado com inspecção cuidadosa da figura 1C, onde aparecem como estruturas circulares brilhantes e constituem a maior parte do volume da célula. As células mostrados na Figura 1A, as quais foram cultivadas em excesso de azoto, são óleo de apenas 5% em peso seco e não contêm níveis significativos de corpos lipídicos.
Quando mostrado sob as condições de iluminação adequadas, as diferenças nestas amostras são ampliados. As células-óleo magraaparecem como anéis fluorescentes com corpos escuros (Figura 1B), enquanto que as células ricas em petróleo exibir um brilhante brilho vermelho-alaranjado, onde eles acumularam corpos lipídicos (Figura 1D). Na Figura 1D, que é mais difícil de ver a fluorescência fraco da membrana celular e de outras estruturas celulares. Vermelho do Nilo vai fluorescência na presença de proteínas de não-polares, bem como os lípidos, que é por isso que a membrana celular e outras estruturas celulares proporcionam um nível de fluorescência de fundo durante as medições espectrofotométricas.
Sob as condições optimizadas do ensaio, as curvas de calibração com valores de R 2 maior do que 0.980 são prontamente realizáveis (Figura 2A). A relação entre o teor de óleo e de fluorescência de células torna-se não linear se as células são coradas numa solução sem um transportador solvente, tal como etanol. Os dados apresentados na Figura 2B, com um R 2 de 0,395, foram 60; obtida levando a cabo o protocolo em uma solução de etanol de 0% (água desionizada pura).
Figura 1. Imagens de A. protothecoides corados com Vermelho do Nilo. uma amostra de óleo-magra (4,4% de teor de óleo por peso seco) é mostrado em A) transmitida microscopia de luz e B) iluminação de epifluorescência, com filtro de excitação verde (510 nm). Os corpos lipídicos corados com Nile Red fluorescência em 604 nm. Uma amostra rica em petróleo (54,7% de teor de óleo por peso seco) é mostrado em C) e D) nas mesmas condições de luz transmitidos e epifluorescência como A) e B), respectivamente.nk "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Curvas de calibração correlacionando o teor de óleo de A. protothecoides a intensidade de fluorescência. em a), as amostras foram preparadas de acordo com o protocolo descrito. Em B), as amostras foram preparadas numa solução de etanol a 0% (água desionizada). Barras de erro verticais representam o desvio padrão de cinco repetições no espectrofotômetro. Barras de erro horizontais denunciar o desvio padrão de pelo menos três repetições de quantificação gravimétrica de lipídios neutros. Clique aqui para ver imagem ampliada.
| Químico | Companhia | Concentração |
| KH 2 PO 4 | Fisher Scientific | 2,8 g · L -1 |
| K 2 HPO 4 | Fisher Scientific | 1,2 g · L -1 |
| MgSO 4 7H 2 O · | Fisher Scientific | 1,2 g · L -1 |
| FeSO4 · 7H 2 O | Fisher Scientific </ Td> | 48 mg · L -1 |
| H 3 BO 3 | Fisher Scientific | 11,6 mg · L -1 |
| CaCl 2 2H 2 O · | Fisher Scientific | 10 mg · L -1 |
| MnCl2 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 7,2 g · L -1 |
| ZnSO 4 7H 2 O · | Fisher Scientific | 0,88 mg · L -1 |
| CuSO4 · 5H 2 O | Fisela Científica | 0,32 mg · L -1 |
| Na 2 Moo 4 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 0,12 mg · L -1 |
| cloridrato de tiamina | Fisher Scientific | 40 ug · L -1 |
| glicose | Fisher Scientific | 30 g · L -1 |
| glicina | Fisher Scientific | 0,2-2,0 g · L -1 |
Tabela 1. Cultura receita media. Todos os reagentes eram de grau analítico.As soluções foram preparadas com água desionizada. A concentração de glicina foi usado para controlar a proporção de carbono para azoto na cultura e consequentemente, o teor de óleo final da algas. As células que vão de 8,5% a 55% de teor de lípido neutro, em massa (base seca), foram usadas para fazer a curva padrão.
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Discussion
As algas utilizadas na curva padrão devem ser as mesmas espécies cultivadas sob as mesmas condições experimentais, como os que estão sendo medidos. As mudanças significativas na composição do meio, a técnica de cultivo, e protocolo de coloração pode afectar a intensidade da leitura de fluorescência. Extracção com hexano (descrito nas secções 1 e 2) foi utilizado para determinar o teor de lípidos neutros de amostras usadas na curva padrão. Para as medições da intensidade de fluorescência precisos, todas as amostras devem ser analisadas com a mesma concentração da biomassa (5 g / L foi utilizado neste estudo). O teor de óleo pode então ser facilmente determinada por comparação com a curva padrão. Para este protocolo, as algas foram cultivadas em balões de agitação sob condições heterotróficas (28 ° C, 100 rpm) com glicose como fonte de carbono (30 g / L) e glicina como a fonte de azoto (0,2-2,0 g / L). Para uma receita de mídia detalhada, consulte a Tabela 1.
Uma consideração importante na realização doprotocolo é as condições de secagem da biomassa de algas molhado quando da preparação da curva padrão. Um forno de vácuo a 45 ° C é recomendável. Um forno convencional a 45-50 ° C, também será suficiente, desde que o tempo adicional é deixada a secar completamente as amostras (24-48 hr). Temperaturas acima de 50 ° C pode fazer com que a biomassa se fundirem ou formar uma crosta impenetrável que não prontamente voltar a suspender em tampão de fosfato. A ressuspensão pode ser auxiliada com a utilização de um homogeneizador. Aditivos químicos, tais como surfactantes ou uma base forte deve ser evitada uma vez que estes normalmente influenciam a leitura de fluorescência. Culturas secas podem ser armazenadas por até 6 meses em um recipiente selado sem experimentar degradação lipídica significativa. Note-se que as medições realizadas em culturas de algas ao vivo, muitas vezes, têm maior erro associada, dependendo da precisão da curva de calibração de turbidez.
Outra consideração é a concentração de etanol utilizada para executar o samples em que o leitor de micro-placa. O etanol actua como um solvente transportador, facilitando o transporte de moléculas de Nile Red para dentro da célula. Em baixas concentrações (<30%) a relação entre o teor de óleo e torna-se a fluorescência não linear devido à fraca difusão através da membrana celular (Figura 2B). Em concentrações mais elevadas de etanol, melhorou a linearidade é obtido à custa da diminuição da intensidade de fluorescência (Figura 2A). Para protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, e Scenedesmus obliquo, uma concentração de etanol de 30%, proporciona o melhor compromisso entre linearidade melhorada e diminuição da intensidade de fluorescência 11. Pode ser necessário ajustar a concentração de etanol para optimizar os resultados para outros organismos.
Escolhendo os comprimentos de onda de excitação e emissão adequados para a leitura da fluorescência nas amostras de algas é crucial para ensure apenas lípidos neutros são incluídas na medição. Intensidade de fluorescência vermelha do Nilo irá variar em diferentes comprimentos de onda dependente da polaridade do ambiente 11,13. Para A. protothecoides, o pico de emissão de lípidos neutros é observada a 590 nm; um segundo pico que representa mais lípidos polares, que podem ser observados em 645 nm 11. Consequentemente, as medições da intensidade de fluorescência descritas neste procedimento foram realizados utilizando um filtro de excitação de 530 nm, com uma meia-largura de banda = 10 nm, e um filtro de emissão de 604 nm, com metade da largura de banda = 10 nm. Escolha de excitação e de onda de emissão deverá ser verificada para cada cepa de algas testadas.
Desde Vermelho do Nilo ficam fluorescentes em qualquer ambiente não polar, estruturas celulares em adição aos órgãos de lípidos irá ser detectado pelo espectrómetro (ver Figura 1B). Este facto, em combinação com a inerente heterogeneidade da biomassa celular, conduz a uma relação não linear entrebiomassa celular e de fluorescência 11. Este problema é resolvido através da garantia de todas as amostras são preparadas em um peso seco constante (5 g / L, recomendado). Em concentrações diluídas o sinal se torna fraco e suas tendências são difíceis de distinguir. Além disso, o sinal de fluorescência pode ser ruidoso, devido às variações de célula-célula e suspensões de partículas nos meios de comunicação. Consequentemente, cinco repetições de cada amostra são recomendados para resultados fiáveis 11.
Alguns protocolos de usar um padrão de óleo, tais como trioleina para calibrar a medição 10,20,21. Embora esta técnica tem sido relatada com sucesso para certas espécies de algas, como Bacillariophyceae e Dinophyceae, é menos adequado para as algas de paredes espessas, tais como Chlorella, devido a limitações de difusão através da membrana celular. Além disso, a adição de trioleina pode perturbar a distribuição das moléculas Nilo Red entre o padrão e os corpos lipídicos, levando tO estimativas imprecisas de teor de óleo. Usando amostras de algas de teor de óleo conhecido como padrões evita esses potenciais défices e é responsável por qualquer fluorescência de fundo causada pelas condições de biomassa e crescimento.
O protocolo apresentado neste estudo fornece um método simples, barato e rápido de quantificar lipídios neutros em amostras de algas. Ao usar um multi-bem placa, altas taxas de transferência de amostra são alcançados com economia de tempo significativa em relação a outros protocolos de coloração. Além disso, as condições do ensaio foram optimizadas para produzir tendências lineares reprodutíveis.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer às Ciências Naturais e Conselho de Pesquisa do Canadá Engenharia para a prestação de apoio financeiro para este projeto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur glass pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
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