Ett enkelt protokoll för att bestämma den neutrala lipiden halt av algceller genom att använda en Nilrött färgningsprocedur beskrivs. Detta tidsbesparande teknik erbjuder ett alternativ till traditionella gravimetriska baserade lipid kvantifiering protokoll. Den har utformats för den specifika tillämpningen av övervakning bioprocess prestanda.
Alger anses vara utmärkta kandidater för källor på grund av deras naturliga lipid lagringsmöjligheter förnybara bränslen. Robust övervakning av alg-fermentationsprocesser och screening för nya oljerika stammar kräver ett snabbt och tillförlitligt protokoll för bestämning av intracellulär lipid content. Nuvarande praxis är beroende till stor del på gravimetriska metoder för att bestämma oljehalten, tekniker utvecklade årtionden sedan som är tidskrävande och kräver stora provvolymer. I detta dokument är Nile Red, ett fluorescerande färgämne, som har använts för att identifiera närvaron av lipid kroppar i många typer av organismer, införlivas i en enkel, snabb och pålitlig protokoll för mätning av den neutrala lipiden innehåll Auxenochlorella protothecoides, en grön alg. Metoden använder etanol, en relativt mild lösningsmedel, att permeabilize cellmembranet innan färgning och en 96 väl mikroplatta för att öka provkapacitet under fluorescensintensitetsmätningar. Det har varit konstruktioned med den specifika tillämpningen av övervakning bioprocess prestanda. Tidigare torkade proverna eller levande prover från en växande kultur kan användas vid analysen.
På grund av deras förmåga att lagra lipidkroppar under vissa stressförhållanden, har algerna fått stor uppmärksamhet de senaste åren som en potentiell förnybar energikälla 1,2. Neutrala lipider kan svara för över 60% av cellens torrvikt under lämpliga tillväxtbetingelser 3. Men branschen inte har en enkel, ren, snabb och pålitlig standardiserat protokoll för att kvantifiera lipidhalt av algceller för att ordentligt övervaka bioprocess prestanda, analysera kulturer, och skärm för nya stammar.
Den Bligh-Dyer gravimetrisk metod utvecklat några 50 år sedan är fortfarande bland de vanligaste tekniker som används i dag 4,5. Även om detta förfarande är enkelt, pålitligt och lätt att utföra, är det tidskrävande, kräver stora provvolymer, och använder sig av toxiska lösningsmedel. Det är inte praktiskt för att analysera många prover från en fermentationskörning eller screening för nya oljerika stammar. Andra metoder har been utvecklade, men vanligtvis kräver avancerad utrustning och har inte standardiserats 6.
Ett alternativ som har rönt ett stort intresse är den Nile Red-färgning. Nile Red, ett färgämne som fluorescerar preferentiellt i opolära miljöer, har använts för att identifiera eller kvantifiera lipidkroppar i olika organismer, inklusive nematoder 7, jäst 8, bakterier 9 och alger 10-19. Inledande tekniker som innefattar Nile Red var mestadels kvalitativ eller semi-kvantitativ kombinerar fläcken med singel-kyvett spektrofotometri eller flödescytometri. Dessutom är vissa typer av alger, såsom grönalger har tjocka cellbrunnar som är mest ogenomträngliga för färgämnet, vilket begränsade utbudet av tekniken 10.
Nya förbättringar av Nilen Röda färgningsmetoden har rapporterats att kringgå de ursprungliga bristerna i protokollet 10,11. Färgning av cellerna i närvaro av en Carrier lösningsmedel som DMSO 10 eller etanol 10,11 linearizes sambandet mellan oljehalt och absorbans, vilket möjliggör tillförlitliga kvantitativa mätningar. Lösningsmedlet hjälper till att permeabilisera cellmembranet så att Nile Red molekyler kan passera igenom. Dessutom, med en spektrofotometer med mikroplatt läsning kapacitet möjliggör hög genomströmning protokoll som lämpar sig för kvantitativ analys.
I denna artikel kommer vi detalj en enkel metod för att mäta halten av algceller olja genom färgning kulturer med Nile Red i närvaro av etanol, ett milt lösningsmedel. För att på bästa sätt ta hänsyn till bakgrundsbrus i mätningarna, är en standardkurva som korrelerar fluorescensintensiteten för oljeinnehåll utvecklats med användning algceller med känd oljekompositionen. Metoden är anpassad från tidigare publicerade protokoll 10,11. Genom att använda en 96-brunns-spektrofotometer, är en möjlighet att analysera samma mängd prov i en timme that skulle ta dagar att följa med gravimetriska metoder. Dessutom, genom att kalibrera med hjälp av representativa urval av den önskade algarter denna metod ger relativt exakta mätningar som är direkt tolkningsbar. Det finns många protokoll som beskriver metoder för färgning alger med Nile Red optimerade för olika stammar och tillämpningar; protokollet presenteras här utvecklades ursprungligen av de la Hoz Siegler et al. 11 för Auxenochlorella protothecoides, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus och Scenedesmus obliquus, även om det är sannolikt lämplig för många fler arter och klasser. Den har utformats med särskild tillämpning av övervakning bioprocess prestanda och det fungerar lika bra för tidigare torkade proverna och våta prover från en växande kultur.
Algerna används i standardkurvan måste vara samma art som odlas under samma försöksbetingelser som de som mäts. Betydande förändringar i mediesammansättning, odlingsteknik, och färgningsprotokollet kan påverka intensiteten i fluorescens läsning. Hexan extraktion (som beskrivs i avsnitt 1 och 2) användes för att bestämma den neutrala lipiden innehåll för prov använda i standardkurvan. För noggranna mätningar fluorescensintensiteten måste alla proverna analyseras vid samma koncentration av biomassa (5 …
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka de naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada för att ge ekonomiskt stöd för detta projekt.
Dry Weight | |||
25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
1.5 ml micro-centrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
Gravimetric Quantification | |||
Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
Pasteur Glass Pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
Hexanes | Fisher | H292-4 | |
Fluorometric quantification of oil content | |||
Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
Ethanol (Alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
Imaging Fluorescent cells | |||
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |