Summary
En enkel protokoll for å bestemme den nøytrale fettinnhold av algecellene ved hjelp av en Nile Red fargingsfremgangsmåten beskrives. Denne tidsbesparende teknikken tilbyr et alternativ til tradisjonelle gravimetriske basert lipid kvantifisering protokoller. Det har blitt designet for den spesifikke anvendelsen av overvåking bioprosessteknologi ytelse.
Abstract
Alger anses gode kandidater for fornybare drivstoff kilder på grunn av deres naturlige fettlagringsmuligheter. Robust kontroll av alge fermenteringsprosesser og screening for nye oljerike stammer krever en rask og pålitelig protokoll for bestemmelse av intracellulær lipidinnhold. Dagens praksis hovedsak basere seg på gravimetriske metoder for å bestemme oljeinnhold, teknikker utviklet tiår siden som er tidkrevende og krever store prøvevolumer. I denne artikkelen er Nile Red, et fluorescerende fargestoff som er blitt brukt for å identifisere tilstedeværelse av lipid-legemer i en rekke typer av organismer, inkorporert i en enkel, rask og pålitelig protokoll for å måle den nøytrale fettinnhold av Auxenochlorella protothecoides, en grønn alge. Fremgangsmåten anvender etanol, en relativt mild oppløsningsmiddel, for å permeabilize cellemembranen før fargingen og en 96 brønn mikro-plate for å øke prøvekapasiteten under fluorescens intensitet målinger. Det har vært utforminged med den spesifikke anvendelsen av overvåking bioprosessteknologi ytelse. Tidligere tørkede prøver eller levende prøver fra en voksende kultur kan anvendes ved assay-bestemmelsen.
Introduction
På grunn av deres evne til å lagre lipidlegemer under visse stress forhold, har alger fått mye oppmerksomhet de siste årene som en potensiell fornybar drivstoffkilde 1,2. Nøytrale lipider kan utgjøre over 60% av celletørrvekt under egnede vekstbetingelser tre. Men næringen ikke har en enkel, ren, rask og pålitelig standardisert protokoll til å kvantifisere fettinnhold av algeceller for å riktig overvåke bioprosessteknologi ytelse, analysere kulturer, og skjermen for nye stammer.
Den Bligh-Dyer gravimetrisk metode utviklet noen 50 år siden er fortsatt blant de mest vanlige teknikker som brukes i dag 4,5. Mens denne prosedyren er enkel, pålitelig og enkel å utføre, er det tidkrevende, krever store prøvevolumer, og gjør bruk av giftige løsemidler. Det er ikke praktisk for å analysere mange prøver fra en gjæring kjøre eller screening for nye oljerike stammer. Andre metoder har been utviklet, men vanligvis krever avansert utstyr og har ikke blitt standardisert seks.
Et alternativ som har fått en stor interesse er Nilen rød flekk. Nile Red, et fargestoff som fluorescerer fortrinnsvis i ikke-polare omgivelser, har vært brukt til å identifisere eller kvantifisere lipid organer i forskjellige organismer inkludert nematoder 7, gjær 8, bakterier og alger 9, 10-19. Innledende teknikker som involverer Nile Red var for det meste kvalitative eller semi-kvantitativ, kombinerer flekken med single-kyvette spectrophotometry eller flowcytometri. I tillegg er noen klasser av alger slik som grønnalger har tykke cellebrønner som er stort sett ugjennomtrengelig for fargestoffet, som er begrenset til området av teknikken 10..
Nylige forbedringer i Nilen Røde flekker metoden har blitt rapportert at omgå de første svakhetene i protokollen 10,11. Farging av cellene i nærvær av en Carrier oppløsningsmiddel så som DMSO 10 eller etanol 10,11 linearizes forholdet mellom olje-innhold og absorbans, slik at for pålitelige kvantitative målinger. Løsningsmidlet bidrar permeabilize cellemembranen slik at Nile Red-molekyler kan passere gjennom. I tillegg, som omfatter et spektrofotometer med mikro-platelese egenskapene gjør det mulig for store gjennomgangs protokoller som er egnet for kvantitativ analyse.
I denne artikkelen detalj en enkel metode for måling av oljeinnholdet i algecellene ved farging kulturer med Nile Red i nærvær av etanol, et mildt oppløsningsmiddel. For å mest nøyaktig utgjør bakgrunnsstøy i målingene, er en standardkurve korrelere fluorescens-intensitet til oljeinnholdet utviklet ved hjelp av algecellene av kjente olje-komposisjon. Metoden er tilpasset fra tidligere publiserte protokoller 10,11. Ved å bruke en 96-brønns spektrofotometer, er man i stand til å analysere den samme mengden av prøvene i en time that ville ta dager å overvåke ved gravimetriske metoder. Videre, ved kalibrering ved hjelp av representative prøver av den ønskede algearter denne metoden gir forholdsvis nøyaktige målinger som er direkte tolkes. Det finnes mange protokoller som beskriver metoder for farging alger med Nile Red optimalisert for forskjellige stammer og programmer; protokollen som presenteres her ble opprinnelig utviklet av de la Hoz Siegler et al. 11 for Auxenochlorella protothecoides, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, og Scenedesmus obliquus, selv om det er sannsynlig egnet for mange flere arter og klasser. Det har blitt designet med den spesifikke anvendelsen av overvåking bioprosessteknologi ytelse, og det fungerer like godt for tidligere tørkede prøver og våte prøver fra en voksende kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Isolering av Dry Alge Biomasse som skal brukes som standarder for Fluorescens Readings
- Ta en prøve-volum fra den økende algekultur som vil gi i det minste 200 mg tørr biomasse, er 400 til 600 mg foretrekkes.
- Sentrifuger prøven ved 4 ° C i 10 min ved 10 000 x g. Kast supernatanten og vask pelleten med et like stort volum fosfatbuffer formulert til samme pH som vekstmediet.
- Gjenta trinn 1,2 i totalt tre vasketrinn.
- Re-suspendere pellet i de-ionisert vann og overføre til en pre-veid veie fatet. La tørke ved 50 ° C i 48 timer. MERK: Tørking under vakuum vil redusere tørketiden og tørking av kulturen ved temperaturer over 50 ° C kan gjøre resuspensjon vanskelig.
- Oppbevar tørket algekulturer ved romtemperatur for senere bruk.
2. Gravimetrisk Kvantifisering av nøytrale lipider av hexanekstraksjon (Tilpasset fra Bligh og Dyer 4)
- Mål ca 50 mg tørr alge biomasse i en veie fatet. MERK: Massene som strekker seg 40 til 80 mg kan anvendes uten tap av reproduserbarhet.
- Overfør biomassen til en mørtel på forhånd vasket med heksan. Hvis det er nødvendig, vaskes veie fatet med en liten mengde (1 ml) i heksan ved bruk av en Pasteur-pipette for å fullstendig overføre biomassen i morteren. MERK: Heksan er en svært volatil og giftig stoff. Det må håndteres i avtrekksskap med riktig verneutstyr.
- Grind alge biomasse i 5 min ved hjelp av en støter. Begynn med forsiktig sliping og gradvis øke intensiteten. Grind biomassen til en fin og glatt pasta i 5 min periode. Hvis overskytende heksan brukes ved overføring av biomassen i morteren, er det best å vente på at heksan for å fordampe før sliping.
- Til noen få ml heksan i morteren og bland den resulterende oppslemming med pistill inntil den er homogenisert. Sørg for at alle celleavfall levd opp til veggene av mortjære blir slått fri og suspenderes i væsken.
- Overfør heksan-cellemasse blandingen til et sentrifugerør. MERK: sentrifugerør må enten være av glass eller en egnet polymer som er kompatibel med heksan, for eksempel teflon.
- Gjenta trinn 2.4, og 2,5 til all biomasse har vært overført til sentrifugerør (3-5x).
- Sentrifuger prøven ved 4 ° C i 20 min ved 10 000 x g.
- Pipette supernatanten forsiktig inn i en pre-veide metall veie fatet. Oppbevar i avtrekksskap.
- Utfør en 2. heksan ekstraksjon ved tilsetning av 3 ml heksan for å pelleten og virvling kraftig i 1 min.
- Gjenta trinn 2,7 og 2,8. Om nødvendig kan kjøre prøvene i 30 minutter i sentrifugen under den andre ekstraksjon for å sikre at all celleavfall fullt legger seg. Bestem massen av olje utvunnet gravimetrisk etter heksan har fordampet helt.
Tre. Fluorometrisk Kvantifisering av nøytrale lipider Bruke Nile Red (som Reported etter de la Hoz Siegler et al. 11)
MERK: Kun 10 pl av en algesuspensjon ved 5 g / L som er nødvendig for fluorescensen lesing. Vanligvis er isolering av tørr alge biomasse fra 1,5 ml av kulturmediet mer enn tilstrekkelig. Dessuten kan lysintensiteten av lampen i spektrofotometeret brytes ned over tid. Det anbefales å inkludere standarder i hvert eksperiment for å sikre at variasjoner i instrumentet ikke legger unødvendige feil i målingene.
- Tilbered en Nile Red-løsning ved en konsentrasjon på 10 mikrogram / ml oppløst i alkohol reagenskvalitet etanol. Oppbevar løsningen i mørket ved 4 ° C.
- Tilbered en 30% (v / v) etanol-løsning i deionisert vann og oppbevares ved 4 ° C.
- Å klargjøre alle algeprøver på samme biomassekonsentrasjon (5 g / l anbefales), og på samme måte som de standarder som brukes i målingen. Gjør dette ved å enten suspensjons pre-tørkede prøver i det aktuelle beløpeti fosfatbuffer (0,6 g / l kaliumfosfat dibasisk, 1,4 g / l kaliumfosfat monobasisk), eller å justere konsentrasjonen av en økende algekultur til 5 g / l med fosfatbuffer etter å måle turbiditeten. MERK: målinger utført på levende alge kulturer vil ofte ha større feil knyttet til dem, avhengig av presisjon av turbiditet kalibreringskurve. Resuspending tørkede prøver kan kreve bruk av en homogenisator for å full dispergere biomassen.
- For hver prøve, bland 80 ul av en 30% etanol-løsning, 10 pl av den Nile Red-løsning, og 10 ul av algesuspensjonen i en enkelt brønn av en 96-brønns plate. For å kunne ordentlig høyde for variasjonen av fluorescens måling, utføre fem replikater av hver prøve.
- Kjør en topunktskalibrering kurve med standarder utarbeidet tidligere for å gjøre rede for dag-til-dag-variasjoner i instrumentet og forberedelse. Forbered standarder for fluorescens måling med same fremgangsmåte som prøvene. MERK: Vanligvis to punkter er tilstrekkelig for rekalibrering av instrumentet, kan tre poeng kjøres for å verifisere linearitet.
- Utfør fluorescens målinger i en multi-brønn-plate-leser spektrofotometer. De følgende betingelser ble funnet å gi de mest konsistente resultater 11:
- Rist ved 1200 rpm, bane 3 mm, 30 sek.
- Inkuber ved 40 ° C i 10 min.
- Rist ved 1200 rpm, bane 3 mm, 30 sek.
- Record fluorescens, eksitasjon ved 530 nm, emisjon på 604 nm.
- Konverter fluorescens målingene til oljeinnhold ved hjelp av resultatene fra de interne standarder.
4. Fluorescensmikroskopi Technique
MERK: farging protokollen beskrevet i kapittel 3 er utformet for kvantitativ analyse, men det kan også være nyttig for å gi visuelle representasjoner av beis-baserte teknikker for pedagogisk og illustrer purposes. Å produsere bilder av fluorescens man trenger en optisk mikroskop med tradisjonelle overføring og ekstra epifluorescence belysning kilder. Eksitasjons-og emisjons lyset filtreres i 530 nm (grønt), og 604 nm (rød) område, henholdsvis, er nødvendig for Nile Red beis, samt et mikroskop montert kamera med tilhørende programvare. De som er vist i denne studien (figur 1) bildene ble anskaffet ved hjelp av en lys feltet mikroskop utstyrt med et kamera og monokrom til RGB konverter enhet. Prosedyren for å produsere Nile Red fluorescens bilder ved hjelp av disse verktøyene er beskrevet nedenfor:
- Forbered en kultur prøven med Nilen rød flekk i henhold til § 3 i protokollen. MERK: en prøve i 5 g / L konsentrasjonsområdet produserer lysbilder av tilstrekkelig celletetthet uten overbefolkning.
- Etter fullført trinn 3.6 i fargings protokollen, forberede et objektglass av den behandlede prøve i henhold til standard laboratorieprosedyrer.
- Fra og med mikroskop i sendemodus, legger du forberedt lysbilde i mikroskopet, og finne cellene på ønsket forstørrelse (bildene i denne artikkelen ble kjøpt med 100X objektiv).
- Når fokusert, slå mikroskop fra overføring til epifluorescence lysmodusen. Lyskilden skal nå kommer direkte fra objektivlinsen (dette kan bekreftes visuelt ved å observere rommet mellom dekselet og den objektivlinse).
- Sett en grønn eksitering filteret inn i lyskilden og en rød emisjon filter inn i observasjons lysbanen; fluorescens av de fargede cellene skal nå være direkte synlig gjennom okularet.
- Slå mikroskop observasjon modus fra okularet til montert kamera og bruke visningsprogramvare for å ta et bilde av den fluorescerende celler. Avhengig av følsomheten til kameraet, kan utvalget ikke i utgangspunktet vises i forhåndsvisningsvinduet (dvs. skjermen vilvære svart); å bøte på dette, justere eksponeringstiden og gevinst på kameraet til et nivå hvor cellene er synlig. Spesifikke innstillinger vil variere med instrumenter, utstyr og celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative alge-celler farget med Nile Red dye er avbildet i figur 1. Del A og B i figur 1 viser bilder av A. protothecoides dyrket i skytende nitrogen, noe som fører til meget lave intracellulære lipidakkumulering. I deler C og D, prøver av A. protothecoides dyrket under nitrogen begrensning er vist. Under overføring belysning, kan lipid legemer av cellen bli visualisert med nøye kontroll av figur 1C, hvor de vises som skinnende sirkulære strukturer og utgjør hoveddelen av cellevolumet. Resultatene vist i figur 1A-celler, som ble dyrket i skytende nitrogen, er bare 5% olje ved tørrvekt, og inneholder ikke betydelige nivåer av lipid organer.
Når vist under riktige lysforhold, er forskjellene i disse prøvene forstørret. De olje lean cellenevises som fluorescerende ringer med mørke kropper (Figur 1B) mens de oljerike cellene vise en lysende oransje-røde gløden der de har samlet lipidlegemer (figur 1D). I figur 1D, er det vanskeligere å se svak fluorescens av cellemembranen, og andre cellestrukturer. Nile Red vil fluorescere i nærvær av ikke-polare proteiner, så vel som lipider, noe som er grunnen til at cellemembranen og andre cellulære strukturer gi et bakgrunnsnivå av fluorescens i løpet av spektrofotometeret målinger.
Under optimaliserte betingelser for analysen, kalibreringskurver med R 2 verdier som er større enn 0.980 er lett oppnåelige (figur 2A). Forholdet mellom celleoljeinnhold og fluorescens blir ikke-lineær hvis cellene er farget i en oppløsning som mangler et bæreroppløsningsmiddel så som etanol. Dataene presentert i figur 2B, med en R 2 av 0.395, var 60, oppnådd ved utførelse av protokollen i et 0% etanol-løsning (rent avionisert vann).
Figur 1. Images of A. protothecoides farget med Nile Red. Et olje-lean sample (4,4% oljeinnhold av tørrvekt) er vist under A) overføres lysmikroskopi og B) epifluorescence belysning med grønt eksitasjon filter (510 nm). De lipidlegemer farget med Nile Red fluoresce på 604 nm. En olje-rik prøve (54,7% olje-innhold ved tørrvekt) vises i C) og D) under de samme overførte og epifluorescence lysforhold eksempel A) og B), henholdsvis.nk "> Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Kalibreringskurver sammenfaller innhold av A. olje protothecoides til fluorescensintensitet. In A), ble prøver fremstilt i henhold til den beskrevne protokoll. I B), ble prøver fremstilt på 0% etanol-oppløsning (avionisert vann). Vertikale feilfelt representerer standardavviket fem replikater i spektrofotometer. Horisontale feilfelt rapportere standardavviket på minst tre gjentak fra gravimetrisk kvantifisering av nøytrale lipider. Klikk her for å se større bilde.
| Kjemisk | Selskapet | Konsentrasjon |
| KH 2 PO 4 | Fisher Scientific | 2,8 g · L -1 |
| K 2 HPO 4 | Fisher Scientific | 1,2 g · L -1 |
| MgSC 4 · 7H 2 O | Fisher Scientific | 1,2 g · L -1 |
| FeSO 4 · 7H 2 O | Fisher Scientific </ Td> | 48 mg · L -1 |
| H 3 BO 3 | Fisher Scientific | 11,6 mg · L -1 |
| CaCl 2 · 2H 2 O | Fisher Scientific | 10 mg · L -1 |
| MnCl 2 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 7,2 g · L -1 |
| ZnSO 4 · 7H 2 O | Fisher Scientific | 0,88 mg · L -1 |
| CuSO 4 · 5H 2 O | Fishennes Scientific | 0,32 mg · L -1 |
| Na 2 Moo 4 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 0,12 mikrogram · L -1 |
| tiaminhydroklorid | Fisher Scientific | 40 mikrogram · L -1 |
| glukose | Fisher Scientific | 30 g · L -1 |
| glysin | Fisher Scientific | 0,2 til 2,0 g · L -1 |
Tabell 1. Kultur media oppskrift. Alle reagenser var av analysekvalitet.Løsninger ble utarbeidet etter avionisert vann. De glycin-konsentrasjon ble anvendt for å kontrollere karbon til nitrogen-forhold i kultur, og følgelig den endelige oljeinnholdet i alger. Celler som spenner fra 8,5% til 55% nøytralt lipid-innhold ved masse (tørr basis) ble anvendt til å lage standardkurven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De alger som brukes i standardkurven må være de samme arter dyrket under de samme eksperimentelle betingelser som de som blir målt. Vesentlige endringer i mediesammensetning, dyrking teknikk, og fargings protokollen kan påvirke intensiteten av fluorescens-leser. Heksan ekstraksjon (beskrevet i avsnitt 1 og 2) ble anvendt for å bestemme den nøytrale lipid-innhold av prøver som benyttes i standardkurven. For nøyaktig fluorescens intensitet målinger må alle prøvene analyseres på samme biomassekonsentrasjon (5 g / l ble anvendt i denne studien). Olje-innhold kan da lett bestemmes ved sammenligning med standardkurven. For denne protokollen ble algene dyrket i ryste-flasker i henhold til heterotrofe betingelser (28 ° C, 100 opm) med glukose som karbonkilde (30 g / L) og glycin som nitrogenkilde (0,2 til 2,0 g / L). For en detaljert media oppskrift, se tabell 1.
En viktig faktor i å utføreprotokollen er vilkårene for å tørke våte alge biomasse ved utarbeidelsen av standardkurve. En vakuum-ovn ved 45 ° C anbefales. En konvensjonell ovn ved 45-50 ° C vil også være nok så lenge ekstra tid er lov å fullstendig tørke prøvene (24-48 t). Temperaturer over 50 ° C kan føre biomassen til å smelte sammen og danne en ugjennomtrengelig skorpe som ikke lett resuspender i fosfatbuffer. Resuspendering, kan støttes ved bruk av en homogenisator. Kjemiske additiver såsom overflateaktive midler, eller en sterk base bør unngås da disse vanligvis påvirke fluorescens lesing. Tørket kulturer kan lagres i opp til seks måneder i en forseglet container uten å oppleve betydelig lipid degradering. Legg merke til at målinger utført på levende algekulturer vil ofte ha større feil i forbindelse med dem, avhengig av nøyaktigheten av turbiditeten kalibreringskurve.
En annen vurdering er etanolkonsentrasjonen som brukes til å kjøre samples i mikro-plateleser. Etanol fungerer som et bæreoppløsningsmiddel, å lette transporten av Nile Red-molekyler inn i cellen. Ved lave konsentrasjoner (<30%) i forholdet mellom olje-innhold og fluorescens blir ikke-lineær på grunn av dårlig diffusjon gjennom cellemembranen (figur 2B). Ved høyere etanolkonsentrasjoner, er forbedret linearitet oppnås på bekostning av redusert fluorescens-intensitet (figur 2A). For Auxenochlorella protothecoides ble Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, og Scenedesmus Obliquus, en etanolkonsentrasjon på 30% funnet å gi en optimal avveining mellom forbedret linearitet og redusert fluorescens intensitet 11. Det kan være nødvendig å justere etanolkonsentrasjonen for å optimalisere resultatene for andre organismer.
Velge riktig eksitasjon og emisjon bølgelengder for å lese fluorescens i algeprøvene er avgjørende for ensure bare nøytrale lipider er inkludert i målingen. Nile Red fluorescens intensitet vil variere ved forskjellige bølgelengder, avhengig av polariteten av miljøet 11,13. For A. protothecoides, er emisjonstoppen for nøytrale lipider observeres ved 590 nm; en sekundær topp representerer mer polare lipider kan observeres på 645 nm 11. Følgelig, ble fluorescensintensiteten målinger som er beskrevet i denne fremgangsmåten utføres ved bruk av en 530 nm eksitasjon filter, med en halv båndbredde på 10 nm, og et 604 nm emisjonsfilter, med en halv båndbredde på 10 nm. Valg av eksitasjon og emisjon bølgelengde bør verifiseres for hver alge belastning testet.
Siden Nile Red vil fluorescere i en hvilken som helst ikke-polare omgivelser, vil cellestrukturer i tillegg til lipid organer detekteres av spektrofotometeret (se figur 1B). Dette faktum, kombinert med den iboende heterogenitet av celle biomasse, fører til et ikke-lineært forhold mellomcelle biomasse og fluorescens 11. Dette problemet løses ved å sørge for alle prøvene er fremstilt ved en konstant tørrvekt (5 g / l anbefalt). Ved fortynnede konsentrasjoner signalet blir svak og dens tendenser er vanskelige å skille. I tillegg kan det fluorescens-signalet være støyende på grunn av celle-til-celle-variasjoner og partikkelsuspensjoner i mediet. Følgelig er fem replikater av hver prøve anbefales for pålitelige resultater 11.
Noen protokoller bruke en olje standard som triolein å kalibrere målingen 10,20,21. Mens denne teknikken har blitt rapportert med hell for visse arter av alger slik som Bacillariophyceae og Dinophyceae, er det mindre egnet for tykkveggede alger som Chlorella grunn av diffusjons-begrensninger over cellemembranen. Videre kan tilsetningen av triolein forstyrre fordelingen av Nile Red-molekyler mellom standard og lipid organer, som fører to unøyaktige beregninger av oljeinnhold. Ved hjelp av algeprøver av kjente oljeinnhold som standarder unngår disse potensielle mangler og står for noen bakgrunn fluorescens forårsaket av biomasse og vekstvilkår.
Protokollen som presenteres i denne undersøkelse er en enkel, billig og hurtig metode for å kvantifisere nøytrale lipider i algeprøver. Ved å bruke en multi-brønn-plate blir høye prøvemengder oppnås med betydelige tidsbesparelser fremfor andre fargings protokoller. I tillegg er betingelsene for forsøket er optimalisert for å gi reproduserbare lineære trender.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada for å gi økonomisk støtte til dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur glass pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
- Chisti, Y.
- National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , Available from: http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf (2010).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy. Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Hara, A., Radin, N. S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).
- Han, Y., et al. Review of methods used for microalgal lipid-content analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Pino, E. C., et al. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).
- Izard, J., Limberger, R. J. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells. J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).
- Chen, W., et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures. Algal Res. 1, 176-184 (2012).
- de la Jara, A., et al. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii. J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).
- Elsey, D., et al. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).
- Feng, G. -D., et al. Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination. Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).
- Guzmán, H., et al. Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions. Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).
- Huang, G. -H., et al. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence. Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).
- Lee, S., et al. Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii. Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).
- Montero, M., et al. Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting. J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).
- Vigeolas, H., et al. Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus. J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).
- Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).
- Kou, Z., et al. Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii. J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).
