Summary
Bir Nile Red boyama prosedürü kullanılarak alg hücrelerinin nötral lipid içeriğini belirlemek için basit bir protokol tarif edilmektedir. Bu zaman tasarrufu tekniği geleneksel gravimetrik esaslı lipid miktar protokoller için bir alternatif sunuyor. Bu izleme biyoproses performansı belirli bir uygulama için tasarlanmıştır.
Abstract
Yosun doğal lipit depolama yetenekleri nedeniyle yenilenebilir yakıt kaynaklarından için mükemmel bir aday olarak kabul edilir. Alg fermantasyon süreçleri ve yeni petrol zengini suşları için tarama güçlü izleme hücre içi lipit içeriğinin belirlenmesi için hızlı ve güvenilir bir protokolü gerektirir. Güncel uygulamalar yağ içeriğini belirlemek büyük ölçüde gravimetrik yöntemler güvenmek, teknikler zaman alıcı ve büyük örnek hacimleri gerektiren onlarca yıl önce geliştirdi. Bu yazıda, Nile Red, organizmaların çok sayıda türleri lipid cisimlerin varlığının belirlenmesi için kullanılan bir floresan boya, Auxenochlorella protothecoides nötr lipid içeriği, yeşil bir ölçmek için basit, hızlı ve güvenilir bir protokole zikredilen alg. Yöntem, boyama önce hücre zarı ve fluoresans yoğunluğu ölçümleri sırasında örnek kapasitesini artırmak için, 96 oyuklu bir mikro-plaka nüfuz edilebilir kılınması için, etanol, nispeten hafif bir çözücü kullanmaktadır. Bu tasarım olmuşturİzleme biyoproses performansı belirli bir uygulama ile ed. Büyüyen bir kültürden önce kuru numune veya canlı numuneleri deneyde kullanılabilir.
Introduction
Nedeniyle bazı stres koşullarında lipit cesetleri saklamak için kendi yeteneği, yosun potansiyel yenilenebilir bir yakıt kaynağı 1,2 gibi son yıllarda ilgi büyük aldık. Nötr lipidler uygun büyüme koşulları altında 3 hücre kuru ağırlığının% 60'ın üzerinde hesap. Oysa sanayi düzgün, biyoproses performansını izlemek kültürleri analiz etmek ve yeni suşları için ekran için alg hücrelerinin lipid içeriğini ölçmek için, basit, temiz, hızlı ve güvenilir standart bir protokol yoktur.
Bligh-Dyer gravimetrik yöntem yaklaşık 50 yıl önce bugün gelişmiş 4,5 kullanılan en yaygın teknikler arasında kalır. Bu işlem, basit, güvenilir ve yürütmek kolay olsa da, bu, zaman alıcıdır büyük örnek hacmi gerektirir, ve toksik çözücülerin kullanımı yapar. Bu fermantasyon vadede birçok örnekleri analiz veya yeni petrol zengini suşları için tarama için pratik değildir. Diğer yöntemler b vareen geliştirdi, ancak genellikle gelişmiş donanım gerektirmez ve 6 standardize edilmemiştir.
Ilgi bir hayli topladı alternatif Nil Kızıl leke. Nile Red, polar olmayan ortamlarda tercihen floresant bir boya, nematodlar 7, 8, maya, bakteri 9 ve 10-19 yosunu dahil olmak üzere çeşitli organizmalarda lipid organları belirlemek ve ölçmek için kullanılmıştır. Nile Red ilgili ilk teknikleri tek bir küvet spektrofotometri yöntemi ile ya da akış sitometrisi leke birleştirerek, niteliksel ya da yarı-nicel idi. Ayrıca, yeşil yosunu gibi yosun bazı sınıfları tekniği 10 aralığını sınırlı boya, çoğunlukla geçirmeyen kalın hücre kuyulara sahiptir.
Nile Red boyama yöntemi için yeni gelişmeler protokol 10,11 ilk eksiklikleri bypass olduğu bildirilmiştir. Bir Carr mevcudiyetinde hücrelerin boyanmasıier 10, DMSO gibi bir çözücü veya etanol 10,11 güvenilir niceliksel ölçümler için izin veren, yağ içeriği ve absorbansı ile süre arasındaki ilişkiyi linearizes. Çözücü, Nile Red moleküllerin geçmesine ve böylece, hücre membran geçirgenliği sağlar. Buna ek olarak, mikro-plaka okuma yetenekleri olan bir spektrofotometre içeren kantitatif analiz için uygun olan yüksek verim protokolleri sağlar.
Bu makale, detaylı olarak, etanol, bir uygun çözücü varlığında, Nil kırmızısı ile kültürleri boyanarak alg hücrelerinin yağ içeriğini ölçmek için basit bir yöntemdir. En doğru amacıyla ölçümlerde arka plan gürültü hesabı, yağ içeriği için floresan yoğunluğu ilişkilendirerek, standart bir eğri bilinen bir yağ bileşiminin yosun hücreleri kullanılarak geliştirilmiştir. Bu yöntem, daha önce yayınlanmış protokollere 10,11 uyarlanmıştır. 96 çukurlu bir spektrofotometre kullanılarak, tek bir saat tha numune aynı miktarda analiz edebilmektedirt gravimetrik yöntemlerle izlemek için gün alacaktı. Ayrıca, istenen alg türlerinin temsili numuneler kullanılarak kalibre bu yöntemi doğrudan yorumlanabilir nispeten hassas ölçümler üretir. Farklı suşları ve uygulamalar için optimize Nil Kırmızı yosun boyama yöntemlerini özetleyen birçok protokol var; Bu çok daha fazla türlere ve sınıflar için muhtemel uygun olmasına rağmen burada sunulan protokol başlangıçta, Auxenochlorella protothecoides için de la Hoz Siegler ve ark. 11 tarafından Chlorella vulgaris, Scenedesmus'u dimorphus ve Scenedesmus Obliquus geliştirilmiştir. Bu izleme biyoproses performansı belirli bir uygulama ile dizayn edilmiştir ve bu büyüyen bir kültürden önce kurutulmuş bir numune ve sulu numuneler için aynı şekilde iyi çalışır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kuru Alg Biyokütle İzolasyonu Floresan Okumalar için Standartlar olarak kullanılır edilecek
- Kuru biyo-kütle, en az 200 mg olan artan alg kültürden bir numune hacmi kaldırma, 400-600 mg tercih edilir.
- 10,000 x g de 10 dakika süre ile 4 ° C'de santrifüj örneği. Süpernatant atılır ve büyüme ortamı ile aynı pH'a formüle fosfat tampon maddesinin eşit hacmi ile pelet yıkayın.
- 3 yıkama işlemi bir toplam adım 1.2 tekrarlayın.
- De-iyonize su içinde pelet yeniden askıya ve ağırlık önceden tartılmış çanak aktarın. 48 saat boyunca 50 ° C 'de kuru olsun. Not: vakum altında kurutma, kurutma süresini azaltmak ve 50 ° C üzerindeki sıcaklıklarda kurutulması yeniden süspansiyon kültürü zor hale getirebilir.
- Ileride kullanmak için oda sıcaklığında saklayınız kurutulmuş alg kültürleri.
Hekzan Ekstraksiyon tarafından Nötr Lipidlerinin 2. Gravimetrik niceliksel (Bligh ve Dyer 4 uyarlanmıştır)
- Bir ağırlık tabak kuru alg biyokütlesinin yaklaşık 50 mg ölçün. Not: 40-80 mg kadar Kütleleri tekrarlanabilirlik kaybı olmadan kullanılabilir.
- Bir havan heksan ile önceden yıkanmıştır biyokütle aktarın. Eğer gerekli ise, tam olarak harç için biyokütle transfer etmek için bir Pasteur pipeti kullanarak heksan küçük bir miktarı (1 mi) ile tartın çanak yıkayın. NOT: Hekzan derece uçucu ve zehirli bir maddedir. Bu uygun koruyucu giysi ile davlumbaz ele alınması gerekir.
- Bir havan tokmağı kullanılarak 5 dakika boyunca alg biyokütlesinin öğütün. Nazik taşlama ile başlayan ve giderek şiddetini artırmak. 5 dakikalık bir süre içinde ince ve pürüzsüz bir hamur haline biyokütle öğütün. Harca biyokütle aktarırken fazla heksan kullanılırsa, bu heksan öğütme önce buharlaşması için beklemek en iyisidir.
- Harç için heksan ile birkaç ml ilave edilir ve homojen hale gelinceye kadar havan tokmağı ile elde edilen bulamaç karıştırılır. Tüm hücre döküntüsü mor duvarlarına yapıştırılmış emin oluntar serbest kaldığında ve sıvı içinde süspansiyon haline getirilir.
- Bir santrifüj tüpüne heksan-hücre kütlesi karışımı aktarın. Not: santrifüj tüpü cam ya da Teflon gibi heksan ile uyumlu uygun bir polimer şeklinde olmalıdır.
- Tüm biyokütle santrifüj tüpüne (3-5x) transfer edilene kadar tekrar 2,4 ve 2,5 adımları tekrarlayın.
- Santrifüj 10,000 x g 'de 20 dakika boyunca 4 ° C' de örnek.
- Dikkatli bir şekilde önceden tartılmış metal çanak içine tartın süpernatan pipetle. Davlumbaz saklayın.
- Topağa heksan 3 ml ilave 1 dakika boyunca kuvvetlice girdaplanarak bir 2. heksan çıkarma yapın.
- Tekrar 2.7 ve 2.8 adımları. Gerekirse, tüm hücre döküntüsü tam yerleşir sağlamak için ikinci çıkarma sırasında santrifüj içinde 30 dakika boyunca örneklerini yürüt. Hekzan tamamen buharlaşmış sonra gravimetrik çıkarılan yağın kütlesini belirlemek.
Nil Kırmızı kullanma Nötr Lipidlerinin 3.. Florimetrik Kantitasyonu (RAPORU olarakted de la Hoz Siegler ve diğ. 11 oranında)
Not: 5 g / L, bir alg süspansiyonu sadece 10 ul floresans okuma için gereklidir. Genel olarak, kültür sıvısının 1.5 ml kuru alg biyokütlesinin yeterli izolasyonu daha fazladır. Ayrıca, spektrofotometre içinde lambanın ışık yoğunluğu zamanla düşürebilir. Bu enstrüman varyasyonlar ölçümlerin gereksiz hata katmayan sağlamak için her deneyde standartlara dahil edilmesi önerilmektedir.
- Alkol reaktif dereceli etanol 10 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda bir Nile Red çözelti hazırlayın. 4 ° C de karanlıkta bu çözüm saklayın
- 4 ° C'de deiyonize su ve mağaza içinde% 30 (v / v) etanol çözeltisi hazırlayın
- Aynı biyokütle konsantrasyonu (/ L 5 g önerilir) de ve ölçümünde kullanılan standartlar ile aynı şekilde tüm alg örnekleri hazırlayın. Olan uygun miktarda ya da süspansiyon önceden kurutulmuş numuneler ile bu Yapılacakfosfat tamponu (0.6 g / L potasyum fosfat dibazik, 1.4 g / L potasyum fosfat monobazik) ya da bulanıklık ölçüm sonra fosfat tampon maddesi ile 5 g / L büyüyen alg kültür konsantrasyonunun ayarlanması. NOT: Canlı alg kültürleri üzerinde yapılan ölçümler genellikle bulanıklık kalibrasyon eğrisinin hassas bağlı olarak onlarla ilgili büyük bir hata olacaktır. Kurutuldu örnekleri tam olarak yeniden süspanse biyokütle dağıtılması için bir homojenleştiricinin kullanımını gerektirebilir.
- Her bir örnek için, 96 oyuklu bir plaka tek bir oyuk içinde% 30 etanol çözeltisi içinde 80 ul, Nile Red çözeltisinin 10 ul ve alg süspansiyonu 10 ul karıştırın. Uygun şekilde floresan ölçüm arasındaki farklılıkları hesaba amacıyla, her bir örnek 5 çoğaltır.
- Enstrüman ve hazırlanmasında gün-gün varyasyonları için hesap için önceden hazırlanmış standartlar ile iki noktalı kalibrasyon eğrisi. S kullanarak floresan ölçümü için standartlar hazırlamak, örnek olarak ame prosedür. NOT: Genellikle iki nokta aletin kalibrasyon için, üç puan doğrusallık doğrulamak için çalıştırılabilir yeterlidir.
- Bir çok-yuvalı plaka okuyucu spektrofotometre içinde floresans ölçümleri yapın. Aşağıdaki koşullar en tutarlı sonuçlar 11 elde bulundu:
- 30 saniye için, 1.200 rpm, yörünge 3 mm çalkalayın.
- 10 dakika boyunca 40 ° C'de inkübe edilir.
- 30 saniye için, 1.200 rpm, yörünge 3 mm çalkalayın.
- Tutanak floresan, 530 nm'de eksitasyon, 604 nm emisyon.
- Iç standartları elde edilen sonuçları kullanarak yağ içeriği için floresans ölçümleri dönüştürme.
4. Floresan Mikroskopi Tekniği
NOT: Bölüm 3 açıklanan boyama protokolü kantitatif analiz için tasarlanmış, ama aynı zamanda eğitici ve açıklayıcı pu için leke dayalı tekniklerin görsel temsillerini sağlamak için yararlı olabilirrposes. Örnek floresan biri görüntülerini üretmek için geleneksel iletim ve ek epifluorışıma aydınlatma kaynakları ile bir optik mikroskop gerektirir. 530 nm (yeşil) ve 604 nm (kırmızı) aralığında Eksitasyon ve emisyon ışık filtreleri, sırasıyla, Nile Red leke hem de yazılım ile bağlantılı bir mikroskop monte edilmiş bir kamera için ihtiyaç vardır. Bu çalışmada (Şekil 1) de gösterilen görüntüler RGB dönüştürücü ünite için bir kamera ve Monokrom ile donatılmış aydınlık alan mikroskobu kullanılarak elde edildi. Bu araçları kullanarak Nil Kırmızı floresan görüntüleri üretmek için prosedür aşağıda özetlenmiştir:
- Protokol bölümü 3'e uygun Nil kırmızı leke ile bir kültür örnek hazırlayın. Not: 5 g / L konsantrasyon aralığı içinde bir örnek aşırı kalabalık olmadan yeterli hücre yoğunluğunun slaytlar üretir.
- Boyama protokolü adım 3.6 tamamladıktan sonra, standart laboratuar prosedürlere göre işlenen numunenin bir mikroskop slaydı hazırlar.
- Iletim modunda mikroskop ile başlayarak, mikroskop içine hazırlanan slayt yük ve istenen büyütme (bu yazıda gösterilen görüntüler 100X amacı ile satın alındı) de hücreleri bulmak.
- Odaklı kez epifluorışıma aydınlatma moduna iletim gelen mikroskop geçiş. Işık kaynağı artık (bu slayt ve objektif lens arasındaki boşluk gözlemleyerek görsel olarak teyit edilebilir) objektif lens doğrudan gelen edilmelidir.
- Gözlem ışık yoluna ışık kaynağı ve kırmızı emisyon filtre içine yeşil bir uyarım filtre takın; boyalı hücrelerin floresans artık mercek doğrudan görünür olmalıdır.
- Monte kameraya Mercekten mikroskop gözlem moduna geçmek ve floresanlama hücrelerin bir görüntü yakalamak için görüntüleme yazılımı kullanın. Kameranın duyarlılığına bağlı olarak, örnek başlangıçta (önizleme penceresinde görünmeyebilir ekranında yani olacak) siyah olacak; Bu durumu düzeltmek için, hücreler görebilir bir düzeye maruz kalma süresi ve kameranın kazancını kontrol etmektedir. Özel ayarlar alet, ekipman ve hücre tipleri ile değişecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nile Red boya ile boyanmış Örnek yosun hücreleri, Şekil 1 'de tasvir edilmektedir. Parça A ve A Şekil 1 ekran görüntülerinin B protothecoides oldukça düşük hücre içi lipid birikimine neden fazla nitrojen içinde büyütülür. A, C ve D parçaları, örneklerde azot sınırlaması altında yetiştirilen protothecoides gösterilmiştir. Iletim aydınlatma altında, hücrenin lipit organları onlar parlak dairesel yapılar olarak görünür ve hücre hacminin çoğunluğunu oluşturan Şekil 1C, dikkatli muayene ile görülebilir. Aşırı azot büyütüldü, şekil 1A'da gösterilen hücreleri, kuru ağırlık olarak sadece% 5 yağ ve lipid cisimlerinin önemli seviyelerde içermez.
Uygun ışık koşulları altında gösterilen, bu örneklerde farklar büyütülmüş. Petrol-yalın hücrelerpetrol zengini hücrelerin lipid organları (Şekil 1D) birikmiş olan parlak turuncu-kırmızı kızdırma ekran ise karanlık organları (Şekil 1B) ile floresan halkalar olarak görünür. Şekil 1D, bu hücre zarı ve hücre yapıları soluk floresan görmek zordur. Nile Red polar olmayan proteinlerin varlığı hem de hücre zarı ve hücre yapıları spektrofotometre ölçümleri sırasında bir floresan arka plan düzeyi sağlamak nedeni olan lipidler içinde floresan olacaktır.
Tahlilin optimize edilmiş koşullar altında, 0,980 'den daha büyük değerler 2 R kalibrasyon eğrileri (Şekil 2A) kolayca elde edilebilir. Hücreler bir taşıyıcı, örneğin etanol gibi bir çözücü içermeyen bir çözelti içinde boyanmış ise, hücre yağ içeriği ve floresan arasındaki ilişki, doğrusal olmayan bir hale gelir. Ar 0,395 2 ile Şekil 2B'de de sunulan veriler, idi 60, bir% 0 etanol çözeltisi (saf deiyonize su) protokolü gerçekleştirilmesiyle elde edilmiştir.
Şekil 1. A. Görüntüleri Nil Kırmızı ile boyanan protothecoides., bir yağ-yalın örneği (kuru ağırlığının% 4.4 yağ içeriği)) A'da gösterilen ışık mikroskobu bulaşan ve yeşil eksitasyon filtresi (510 nm) ile B) epifluorışıma aydınlatma edilir. Nil Kırmızı ile boyanan lipid yapılar 604 nm'de floresan. Bir yağ açısından zengin numune (kuru ağırlık olarak% 54.7 yağ içeriği), sırasıyla, aynı iletilen ve epifloresans ışık A gibi koşullar) ve B) altında c) ve d) 'de gösterilmiştir.nk "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
A. yağ içeriğini korele Şekil 2,. Kalibrasyon eğrileri protothecoides yoğunluğu floresan. A'da), örnekler tarif edilen protokole göre hazırlandı. B) 'de, numune, bir% 0 etanol çözeltisi (deiyonize su) içinde hazırlanmıştır. Dikey hata çubukları, spektrofotometre ile beş kez tekrarlanmış standart sapmasını temsil eder. Yatay hata çubukları nötral lipidlerin gravimetrik miktarının en az üç çoğaltır standart sapma rapor. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
| Kimyasal | Şirket | Konsantrasyon |
| KH 2 PO 4 | Fisher Scientific | 2.8 g · L-1 |
| K 2 HPO 4 | Fisher Scientific | 1.2 g · L-1 |
| MgSO 4 · 7H 2 O | Fisher Scientific | 1.2 g · L-1 |
| FeSO 4 · 7H 2 O | Fisher Scientific </ Td> | 48 mg · L-1 |
| H 3 BO 3 | Fisher Scientific | 11.6 mg · L-1 |
| CaCl2 · 2H 2 O | Fisher Scientific | 10 mg · L-1 |
| MnCI2 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 7.2 g · L-1 |
| ZnSO 4 · 7H 2 O | Fisher Scientific | 0.88 mg · L-1 |
| CuSO 4 · 5H 2 O | FisOnu Bilimsel | 0.32 mg · L-1 |
| Na 2 MoO 4 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 0.12 mg · L-1 |
| tiamin hidroklorür | Fisher Scientific | 40 mg · L-1 |
| glikoz | Fisher Scientific | 30 g · L-1 |
| glisin | Fisher Scientific | 0,2-2,0 g · L-1 |
Tablo 1. Kültür medya tarifi. Tüm kimyasallar analitik sınıftadır.Solutions deiyonize su kullanılarak hazırlandı. Glisin konsantrasyonu kültür içinde azot oranına karbon kontrol etmek ve yosun sonuç olarak, son yağ içeriği için kullanılmıştır. 8.5 'den% kütle (kuru temelde),% 55 nötral bir lipid içeriğine kadar hücreler, standart eğri için kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standart eğri kullanılan yosunlar, bu ölçülen ile aynı deney koşulları altında ekilen aynı tür olmalıdır. Medyum kompozisyonu, yetiştirme tekniği ve boyama protokolü önemli değişiklikler floresans okuma yoğunluğunu etkileyebilir. (Bölümler 1 ve 2'de tarif edilmiştir) ekstre Heksan, standart eğri kullanılan numunelerin nötr lipid içeriğini belirlemek için kullanılmıştır. Doğru floresan yoğunluğu ölçümleri için, bütün numuneler aynı biyokütle konsantrasyonu (5 g / L, bu çalışmada kullanılmıştır) analiz edilmelidir. Yağ içeriği daha sonra kolayca, standart eğri ile karşılaştırma yoluyla belirlenebilir. Bu protokol için, yosun azot kaynağı (0,2-2,0 g / L) gibi bir karbon kaynağı (30 g / L) ve glisin gibi glukoz ile heterotrofik koşullarda (28 ° C, 100 rpm) altında çalkalama şişelerinde yetiştirildi. Ayrıntılı bir medya tarifi için, bakınız Tablo 1.
Yürütülmesinde önemli bir hususturprotokol standart eğri hazırlanırken, ıslak alg biyokütlesinin kurutulması için koşullar. 45 ° C'de bir vakum fırın tavsiye edilir. 45-50 ° C 'de geleneksel bir fırında da çok uzun ilave zaman tamamen örnekleri (24-48 saat) kurumaya bırakılır olarak yeterli olacaktır. 50 ° C'nin üzerindeki sıcaklıklar, biyokütle birlikte sigorta ya da hali hazırda fosfat tamponu içinde tekrar süspansiyon olmayan bir nüfuz edilemez bir kabuk oluşmasına neden olabilir. Yeniden süspansiyon bir homojenleştiricinin kullanılması ile destekli olabilir. Bu genellikle floresans okuma etkisi gibi yüzey aktif maddeler veya güçlü bir bazla kimyasal katkılar olarak kaçınılmalıdır. Kuru lipid kültürleri önemli bozulma yaşamadan sızdırmaz şekilde kapalı bir kap içinde 6 ay boyunca saklanabilir. Canlı alg kültürleri üzerinde yapılan ölçümler genellikle bulanıklık kalibrasyon eğrisinin hassas bağlı olarak onlarla ilgili büyük hata olacağını unutmayın.
Diğer bir önemli husus SAMP çalıştırmak için kullanılan etanol konsantrasyonudurmikro-plaka okuyucusu içinde les. Etanol hücreye Nile Red moleküllerin taşınmasını kolaylaştıran bir taşıyıcı çözücü olarak işlev görür. Düşük konsantrasyonlarda (<% 30), yağ içeriği ve floresan arasındaki ilişki nedeniyle, hücre zarı (Şekil 2B) üzerindeki zayıf yayılma için doğrusal olmayan bir hale gelir. Yüksek etanol konsantrasyonlarda, daha iyi doğrusallık floresan yoğunluğu (Şekil 2A) düşmüştür. Auxenochlorella protothecoides için, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus ve Scenedesmus obliquus,% 30 bir etanol konsantrasyonu, uygun ödünleşim verdiği bulunmuştur pahasına elde edilir geliştirilmiş doğrusallık ve floresan yoğunluğu 11 arasında azalma. Diğer organizmalar için iyi sonuçları elde etmek için etanol konsantrasyonunu ayarlamak için gerekli olabilir.
Alg numunelerdeki floresan okumak için uygun uyarma ve emisyon dalga boyları seçimi ensu için çok önemlidirSadece nötr lipidler ölçümüne dahil ediliyorsa. Nile Red floresan yoğunluğu çevre 11,13 polaritesine bağlı olarak, farklı dalga boylarında değişir. A için protothecoides, nötr lipitleri için emisyon tepe 590 nm'de gözlenir; Daha fazla polar lipidler temsil eden ikinci bir tepe noktası 645 nm 11 de görülmektedir. Sonuç olarak, bu prosedür de tarif floresan yoğunluğu ölçümleri, yarı bant genişliği = 10 nm, yarı bant-genişliğinin = 10 nm ve 604 nm emisyon filtresi ile, 530 nm uyarma filtresi kullanılarak yapıldı. Uyarma ve emisyon dalga seçimi her test alg gerginlik için kontrol edilmelidir.
Nile Red herhangi polar olmayan bir ortamda floresan bu yana, lipid maddelere ek olarak hücre yapıları (Şekil 1B'ye bakınız), spektrofotometre tarafından tespit edilecektir. Bu durum, hücre biyokütle doğal heterojenite ile kombinasyon halinde arasında doğrusal olmayan bir ilişkiye neden olurHücre biyoması ve floresan 11. Bu sorun, tüm örnekler sabit bir kuru ağırlık (5 g / L tavsiye edilir) hazırlanır sağlanması ile çözülmektedir. Seyreltik konsantrasyonlarında sinyal soluk hale gelir ve eğilimlerini ayırt etmek zordur. Ayrıca, floresans sinyali nedeniyle medya hücre-hücre varyasyonları ve parçacık süspansiyonlarına gürültülü olabilir. Sonuç olarak, her bir numunenin 5 kopya 11 güvenilir sonuçlar için tavsiye edilir.
Bazı protokoller gibi ölçüm 10,20,21 kalibre trioleİn gibi bir yağ standardı kullanabilir. Bu teknik, Bacillariophyceae ve Dinofase gibi yosun belirli türler için başarı ile rapor edilmiş olmasına rağmen, bunun nedeni, hücre zarından difüzyon sınırlama bu tür Chlorella gibi kalın duvarlı yosun için daha az uygundur. Ayrıca, triolein ve buna ek olarak standart ve lipid gövdeleri, önde gelen t arasındaki Nile Red moleküllerin dağılımını rahatsız edebiliryağ içeriği o yanlış tahminleri. Standartları olarak bilinen yağ içeriği alg örnekleri kullanarak bu potansiyel eksiklikleri önler ve biyokütle ve büyüme koşullarından kaynaklanan herhangi bir eşiğe oluşturmaktadır.
Bu çalışmada sunulan protokol alg örneklerde nötr lipidler miktarının basit, ucuz ve hızlı bir yöntem sağlar. Çok iyi bir plaka kullanarak, yüksek numune verimlerin diğer boyama protokolleri üzerinde önemli zaman tasarrufu elde edilir. Buna ek olarak, tayinin koşulları tekrarlanabilir lineer trendler elde etmek için optimize edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar bu proje için mali destek sağlamak için Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur glass pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
- Chisti, Y.
- National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , Available from: http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf (2010).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy. Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Hara, A., Radin, N. S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).
- Han, Y., et al. Review of methods used for microalgal lipid-content analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Pino, E. C., et al. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).
- Izard, J., Limberger, R. J. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells. J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).
- Chen, W., et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures. Algal Res. 1, 176-184 (2012).
- de la Jara, A., et al. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii. J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).
- Elsey, D., et al. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).
- Feng, G. -D., et al. Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination. Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).
- Guzmán, H., et al. Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions. Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).
- Huang, G. -H., et al. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence. Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).
- Lee, S., et al. Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii. Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).
- Montero, M., et al. Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting. J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).
- Vigeolas, H., et al. Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus. J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).
- Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).
- Kou, Z., et al. Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii. J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).
