Summary
Unser Bericht beschreibt eine einzigartige Methode zur Visualisierung und Analyse von CTC / EG Wechselwirkungen bei Prostatakrebs unter physiologischen Flussbedingungen.
Abstract
Metastasierung ist ein Prozess, in dem Tumorzellen zu vergießen aus dem Primärtumor intravasate Blut Gefäß-und Lymphsystem, damit, den Zugang zu extravasieren und bilden einen Sekundär Nische. Die Extravasation von Tumorzellen aus dem Blutgefäßsystem kann mit Endothelzellen (ECs) und Tumorzellen aus verschiedenen Zelllinien untersucht werden. Erste Studien wurden mit statischen Bedingungen durchgeführt, aber es ist gut dokumentiert, dass ECs anders unter physiologischen Flussbedingungen verhalten. Daher unterschiedlichen Strömungskammeranordnungen werden derzeit zum Studium Krebs-Zell-Interaktionen mit ECs verwendet. Aktuelle Durchflusskammer-Baugruppen bieten reproduzierbare Ergebnisse entweder mit verschiedenen Zelllinien oder Flüssigkeit bei unterschiedlichen Scherstressbedingungen. Jedoch zu beobachten und zu studieren Wechselwirkungen mit seltenen Zellen, wie zirkulierenden Tumorzellen (CTC), sind bestimmte Änderungen erforderlich, um das herkömmliche Strömungskammer-Anordnung hergestellt werden. CTCsind eine seltene Zellpopulation unter Millionen von Blutzellen. Folglich ist es schwierig, eine reine Population von CTC erhalten. Kontamination der CTC mit verschiedenen Arten von Zellen, die normalerweise im Blut gefundenen unvermeidlich mit vorliegenden Anreicherung oder Abreicherung Techniken. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir eine einzigartige Methode zur fluoreszenz Label zirkulierenden Prostatakrebszellen und studieren ihre Wechselwirkungen mit ECs in einer selbstorganisierten Flusskammer-System. Diese Technik kann weiter verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen Prostata-CTC und jedes Protein von Interesse zu beobachten.
Introduction
Metastasierung ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, der kaum verstanden bleibt. Der Ligand E-selectin/selectin Achse ist gezeigt worden, eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung durch Förderung der Primär adhäsiven Wechselwirkungen zwischen dem vaskulären Endothel und Krebszellen 1,2 spielen. Endothelzellen (E)-Selectin ist ein Transmembran-Protein von aktivierten Endothelzellen exprimiert wird, während die verschiedenen E-Selektin-Ligand (en) durch Tumorzellen 3 ausgedrückt. Zahlreiche in vitro-Ansätze wurden erfolgreich eingesetzt, um E-selectin/selectin Ligand-Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Endothelzellen (ECs) 1 zu modellieren. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, werden verschiedene Durchflusskammer-Systeme eingesetzt, um Blutgefäßsystem zu simulieren. Unter Flusskammer-Einheiten wird Parallelplatten-Durchflusskammer (PPFC) in Verbindung mit ECs routinemäßig als in vitro-Modell simuliert in vivo Scherstressbedingungen eingesetzt. HierinVerfahren ECs auf einem 35-mm-Schale gezüchtet und nach Erreichen einer Monoschicht werden ECs zum PPFC befestigt und Scherspannung basierend Experimente durchgeführt werden.
, PPFC und anderen aktuellen Systemen präsentieren jedoch viele Einschränkungen zum Studium adhäsive Wechselwirkungen zwischen zirkulierenden Tumorzellen (CTC) von Patienten und ECs stammen, die vorwiegend, weil CTC sind eine seltene Population von Zellen, aus dem Primärtumor Schuppen, unter den Millionen von zirkulierenden Blutzellen (1 CTC pro 10 9 Blutkörperchen) 4. Daher, im Gegensatz zu unbegrenzten Vorrat an kultivierten Zelllinien, geringe CTC zählt zu sehr wenigen und seltenen CTC / EC-Interaktionen, erfordern richtige Strömung Kanalbreite, um die Interaktionen für die Wiedergabe Analyse aufzeichnen. Darüber hinaus, da Patienten abgeleitet CTC sind eine unreine Bevölkerung, also eine Identifikationsmarkierung ist erforderlich, um in bestimmten CTC verfolgen. Um dieses Problem zu lösen, ein neues Verfahren, um Prostatakrebs zu identifizieren (PCa) CT entwickelten wirCs unter Ausnutzung der Tatsache, daß praktisch alle diese CTC auszudrücken Prostata-spezifischen Membranantigen (PSMA) auf ihrer Zelloberfläche 5,6. In diesem Bericht haben wir die Prostatakrebs-Zelllinie, MDA PCa2b (MDA), um den potentiellen Nutzen von unserem neuen System, um Prostatakrebs, CTC Wechselwirkungen mit ECs Studie zeigen, schließlich, um den Mechanismus der Metastasierung zu verstehen.
Unsere Methodik kann für verschiedene Scher basierte Experimente simuliert in vivo Gefäßsystem 9.7 angewendet werden. Neben der Prüfung PCa CTC / EC-Interaktionen, konnte der Stromfluss-Kammer-System leicht für die Analyse von peripheren mononukleären Blutzellen oder Wechselwirkungen Tumorzellen 'mit ECs angepasst werden. Die Einfachheit der Demontage und Wiedermontage der Strömungskammer, ein Mikroobjekt III (0,1) (nachstehend als Mikroobjekt bezeichnet), ermöglicht die Kultivierung ECs unter Perfusion und Stimulieren ECs mit verschiedenen Zytokinen induzieren protein Ausdruck. Außerdem kultivierten Endothelzellen, rekombinante Proteine, wie E-und P-Selektin auf der Mikroobjekt und Interaktion mit Tumorzellen, beschichtet werden können, unter laminaren Strömungsbedingungen 10 beobachtet werden.
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Protocol
1. Kultivierung HUVECs auf Mikroobjekttragerglaschen für Observing CTC-Endothel-Interaktionen
- Unter der Gewebekultur Kapuze, zuerst den Mikroobjekt spülen, Kanalbreite von 1 mm mit PBS. Sanft Beschichtung der Mikroobjekt mit 200 ul von 50 ug / ml Fibronektin (gelöst in PBS) unter Verwendung einer 1-ml-Luer-Lock-Spritze.
- Decken Sie die Mikroobjekt mit dem Deckel und halten Sie sie in der Gewebekultur Haube für 30 min. Langsame Abgabe der Flüssigkeit in den Mikroobjekt verhindert Blasenbildung im Kanal.
- Perfuse 200 &mgr; l warme (37 ° C) HUVEC-Wachstumsmedium (M199-Medium, 1 M HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml Heparin, 100 ug / ml Endothelzellen-Wachstumsfaktor und L-Glutamin) auf der Mikroobjekt inkubieren 20 min bei RT. Während der Perfusion, bereiten HUVEC Zellsuspension.
- Spülen HUVECs mit PBS und fügen 0,05% Trypsin-EDTA für 1-2 min bei RT. Zentrifuge HUVECs in 2 ml Wachstumsmedium bei 180 × g für 5 min.
- Messen Sie die Zellkonzentration mit Hilfe eines neubauer Hämozytometers und bereiten 10 7 HUVEC Zellen/100 ul Wachstumsmedium. Dann vorsichtig aus dem Einlass des Mikroobjekt mit einer 200-ul Pipettenspitze entfernen das Medium.
- Bringen Sie die Mikroobjekt auf Augenhöhe und mit einer 1-ml-Luer-Lock-Spritze vorsichtig perfuse 200 ul der vorbereiteten Konzentration von HUVECs in den Kanal. Vorsicht ist bei diesem Schritt erforderlich ist, um Blasenbildung zu verhindern. Wenn die Blasen erscheinen, halten Perfusion für eine etwas längere Zeit, bis sich Blasen geben Sie den Ablaufkanal.
- Setzen einer gleichen Menge (~ 80 &mgr; l) von HUVEC Medien sowohl dem Einlass und Auslass des Mikroobjekt. Dies verhindert den Fluss von Zellen in jeder Richtung.
- Decken Sie die Folie und halten Sie es in den Inkubator (37 ° C) für 1,5 Stunden.
2. Vorbereitung der Flusskammer Versammlung für Übernachtung HUVEC Kultur auf einem Microslide
- Legen Sie eine sterile 20-ml-Spritze, weiblichen und männlichen Luer-Anschlüsse, Schläuche und eine Spritzenpumpe im Inkubator für 15 kmn.
- Für minimale Totvolumen, verwenden Sie die Schläuche mit Innendurchmesser von 0,04 Zoll. Kleinere Rohrdurchmesser verhindert Blasenbildung.
- Füllen die 20-ml-Spritze mit warmem (37 ° C) HUVEC-Medium (12 ml). Befestigen Sie die Schläuche mit den Anschlüssen auf die Spritze. Entfernen Sie die Luftblasen. Verbinden Sie dieses Anordnung an der Mikroobjekt.
- Vollständig zu füllen den Einlass des Mikroobjekt mit HUVEC Medien. Bringen des gefüllten 20-ml-Spritze an dem Verbinder angebracht neben dem Mikroobjekt. Den Stecker zu befestigen vorsichtig auf die Mikroobjekt.
- Bringen Sie das Set-up in den Inkubator und verbinden Sie es mit der Spritzenpumpe, bei 10 ml / min Scherrate eingestellt. Lassen Sie die Zellen O / N im Brutschrank bei 37 ° C
- Am nächsten Tag, zerlegen den Aufbau durch Entfernen des Verbinders an dem Einlass des Mikroobjektträger befestigt.
- Um E-Selektin-Expression auf Endothelzellen hochregulieren, bereiten Sie frisches Wachstumsmedium mit IL-1β bei 10 ng / ml in 4 ml Medium. Saugen Sie das Medium in einem 10-ml-Spritze. T entfernener Medium aus dem Einlass des Mikroobjekt und der Spritze zu verbinden, um die Folie.
- Stellen Sie die Spritzenpumpe mit 10 ul / min Schergeschwindigkeit für 4 Stunden in den Brutschrank.
3. Herstellung von anti-PSMA (J591-488) gekennzeichnet Prostatakrebszellen
- Während IL-1β Inkubation von HUVECs, bereiten anti-PSMA-J591-Alexa488 PCa-Zellen. Hinzufügen von 0,05% Trypsin-EDTA-MDA-Zellen für 1 min. Nicht die Zellen Trypsin für längere Zeit ausgesetzt werden, da sie die auf der Zelloberfläche vorhanden Glycopeptide beeinflussen. Enzym-freie Zelle Dissoziation Reagenz kann auch anstelle von Trypsin verwendet werden. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min.
- Resuspendieren MDA Zellpellet in 1 ml H / H-Puffer (Hanks balanced salt solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM CaCl 2). In anti-PSMA-J591-Alexa488 Antikörper bei 20 pg / ml für 30 min bei RT in einer dunklen Ort. Resuspendieren der Zellen während der Inkubation.
- Nach 30 min Zentrifugation der Zelllösung bei 800 × g für 5 min. AspiRate und das Pellet in 1 ml H / H-Puffer. Zählen Sie die markierten Zellen und MDA bringen die Endkonzentration auf 1x10 6 Zellen / ml. Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit J591-488 markierten Zellen MDA und die Bläschen.
4. Vorbereitung der Anti-PSMA (J591-488) beschriftet CTC Enriched von PCa Patienten
- Sammeln Sie 7,5 ml Blut von Patienten mit Prostatakrebs in einem blauen Kappe Rohr (mit Na-Citrat). Sanft Blut verdünnen 01.01 in 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS.
- Add 5.3 ml Ficoll-Paque Plus in einem 50 ml konischen Röhrchen. Schicht verdünntes Blut auf dem Ficoll-Paque. Zentrifugieren bei 400 g für 30 min.
- Vorbeschichtung alle Rohre oder Spitzen in Kontakt mit CTC mit 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCl 2/4 mM MgCl 2 (R / S-Puffer) nicht-spezifische Bindung von CTC an den Oberflächen zu verhindern. Aufrechtzuerhalten 4 ° C Temperatur der Medien und Puffer in Kontakt mit CTC.
- Das Blut peripheren mononuklearen Zellen (PBMCs)-Fraktionenthält CTC von der Schnittstelle in einem anderen 50-ml konischen Röhrchen, enthaltend 30 ml R / S-Puffer. Zentrifugieren bei 400 g für 8 min.
- Das Pellet und waschen wieder in R / S-Puffer bei 400 g für 8 min. Nach der Zentrifugation das Pellet in H / H-Puffer. In anti-PSMA-J591-488-Antikörper bei 20 pg / ml für 30 min bei RT in einer dunklen Ort.
- Nach 30 min zentrifugieren die PBMCs enthält J591-488 markierten CTC bei 800 g für 5 min. Resuspendieren in H / H-Puffer. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze (mit R / S-Puffer vorgezogen) mit der Probe.
5. Herstellung von Mikroskop, Spritzenpumpe und Durchflusskammerversammlung
- Schalten Sie den umgekehrten Mikroskop und stellen Sie die Beleuchtung bei Kohler 10X-Objektiv. Bringen Sie die Spritzenpumpe auf dem gleichen Niveau wie der Probentisch des Mikroskops und setzen Sie ihn auf 1 dyn / cm 2 Schubspannung (~ 10 ml / min).
- Öffnen Sie die Zeiss Axiovision Software. Wählen Sie das Ziel auf dem Computer-Bildschirm. Erstellen Sie eine neueOrdner unter der Option-Tools in der Software.
- Öffnen Sie die Option Smart-Experimente in Axiovision und die Einstellungen zu kurzen 30 Sekunden Videos für 30 Minuten aufzeichnen.
- Für die Live-Videofluoreszenz, stellen Sie die Bildoptionen-12 ms Belichtungs, 2 x 2 bin, 5 zu gewinnen. Diese Parameter helfen bei der Erreichung Videos der Nähe des Video-Bildrate (~ 23 Bildern pro Sekunde) mit der Zeiss MRM-Kamera.
- Um die volle Breite des Strömungskanals bei 10 X Ziel auf dem Bildschirm sichtbar zu machen, mit einem C-Mount-Adapter (0,63 mm xf/60 Interface).
- Schalten Sie den Quecksilberlampe.
- Legen Sie die Spritze und den Stecker mit den Zellen auf den Spritzenpumpe.
- Bringen IL-1β stimulierten HUVECs aus dem Inkubator. Befestigen Sie den Stecker mit dem gefüllt Einlasskanal des Mikroobjekt enthält HUVECs.
- Verbinden der Austrittskanal mit dem Anschluss an die Rohrleitung angebracht ist. Setzen Sie den Schlauch in eine Schale oder 15 ml konischen Röhrchen, um die Strömung durch sammeln.
- Starten Sie den infusiauf durch die Mikroobjekt bei 10 ul / min. Beachten Sie die Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und Zellen der Bezeichnung MDA oder markierte CTC von Patienten unter 488-nm-Filter auf der Epifluoreszenzmikroskop abgeleitet.
- Starten Sie die Aufnahme des Experiments als 30 Sekunden kurze Videos. Während der Wiedergabe Analyse, messen die Walzgeschwindigkeit. Walzgeschwindigkeit wird durch Division des Abstandes von den Zellen über die Zeit zurück gemessen.
6. Immunfärbung des Microslide
- Druckmaterial aus dem Einlaß und Auslaß der Mikroobjekt nach Perfusion MDA-Zellen auf IL-1β-stimulierten HUVEC-Zellen für 10 min.
- Verwendung einer 200 ul-Spitze, setzen warm (37 ° C) PBS, das Calcium und Magnesium in den Einlass des Mikroobjektträger für 5 min. Neigen Sie den Mikroobjekt mit seinem Deckel als Stütze auf der Bank. Halten Sie die Mikroobjekt in einer gekippten Position für alle Inkubationen während Immunfärbung.
- Fix HUVECs durch Perfusion warmen 2% Formaldehyd in den Einlass
- Hinzufügen Triton-X 100 (0.1%) in 5% BSA in PBS für 10 min bei RT.
- Gründlich zweimal mit PBS für jeweils 5 min. Blockieren mit 5% BSA in PBS für 30 min.
- Inkubieren mit primärem Antikörper Ziege-anti-VE-Cadherin (1:100) in 2,5% BSA O / N bei 4 ° C.
- Am nächsten Tag, zweimal waschen mit PBS für jeweils 5 min. In Sekundär Esel-anti-Ziege-647-Antikörper für 45 min. Zweimal waschen mit PBS für jeweils 5 min.
- Inkubation bei RT mit humanisierten J591-Alexa488 konjugierte Antikörper für 1 Stunde.
- Zweimal waschen mit PBS für jeweils 5 min. In DAPI für 5 min. Waschen mit destilliertem Wasser für 5 min.
- In PBS (Mowiol oder für langfristige Lagerung). Visualisieren Sie die Mikroobjekt unter dem konfokalen Mikroskop.
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Representative Results
Figur 1 zeigt ein O / N-Kultur von einer Monoschicht von Endothelzellen auf der Mikroobjekt. Die Skalierungen auf Fig. 1A zeigt, dass 100% der Mikroobjekt sichtbar mit 5X Ziel, während 70% sichtbar mit einem 10X-Objektiv (Abbildung 1B). Für E-Selektin-vermittelte Wechselwirkungen werden die Zellen rollen an den Kanten nicht berücksichtigt, die mehr als 70% der Mikroobjekt verfügbar für Video-Aufnahme und-Wiedergabe Analyse macht. In unserer Erfahrung, zunächst dieses Set-up-Montage braucht einige Übung, um eine Monokultur von ECs unter Scherbeanspruchung. Nach der Gründung EG Wachstum auf der Mikroobjekt wir beschriftet MDA-, Prostata-Krebszellen. Die Spezifität der J591-488 anti-PSMA-Antikörper wurde mit MDA-Zellen in gesunden Spenderblut versetzt und mit Fluoreszenz-anti-PSMA-J591-488 monoklonale Antikörper markiert ist getestet. Kein PSMA Immunfärbung wurde in PBMCs (Daten nicht gezeigt) beobachtet. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass J591-488-Bindung und Internalisierung alters Rollverhalten, markierten wir MDA-Zellen mit J591-488 und vergleicht die Rollverhalten mit unmarkiertem MDA-Zellen bei Scherspannungen im Bereich von 1-10 dyn / cm 2. Der Box-Plot zeigt die Verteilung der Walzgeschwindigkeiten der beiden unmarkierten und J591-488-markierten MDA-Zellen auf IL-1β-stimulierten ECs bei unterschiedlichen Scherstressbedingungen. Kein signifikanter Unterschied wurde in der Walzgeschwindigkeiten an 1 beobachtet und 5 dyn / cm 2, p = 0,634 und p = 0,601, bzw. (2). Bei höheren Scherspannung von 10 dyn / cm 2, wurde ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Walzgeschwindigkeiten von unmarkiertem und J591-488-markierten MDA-Zellen (p <0,05) beobachtet. Frühere Studien zeigen, dass bei höheren Scherspannung (> 3 dyn / cm 2) Bedingungen, weniger Tumorzellen haften und rollen auf ECs im Vergleich zu niedrigeren Scherstressbedingungen 11,12. Daher sind Studien zur Analyse Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und ECs bei niedrigeren Schubspannungen durchgeführt. Thuns, unsere Daten darauf hin, dass CTC mit J591-488 und dass Fluoreszenzmarkierung von CTC nicht das Rollverhalten auf einer Vielzahl von Schubspannung nicht wesentlich beeinträchtigen gekennzeichnet werden. Der Hinweis, wir konnten keine CTC / EC-Wechselwirkungen in der Abwesenheit von IL-1β Stimulation des ECs (Daten nicht gezeigt) zu erfassen. Zusätzlich als proof of principle wir auch angereichert CTC von Patienten mit CRPC J591-488 isoliert und über IL-1β-stimulierten Endothelzellen perfundiert gekennzeichnet. Ein zeit genäht Video zeigt die verschiedenen Arten von Wechselwirkungen zwischen Prostata-CTC und ECs (Video 1). Das Video zeigt drei Arten von Wechselwirkungen stabile Haftung (CTC nicht einmal nach 30 Sekunden zu lösen), Tethering (CTC befestigen und wieder zu befestigen) und keine Wechselwirkungen. Mikroobjekttragerglaschen leicht immun und Fluoreszenzbilder getroffen werden können, weil die Mikroobjekt haben ähnliche optische Eigenschaften wie ein 1,5 mm dickes Deckglas 7. Abbildung 3 zeigt die feste Haftung der J591-488-markierten Zellen MDA achterner Perfusion über die IL-1β-stimulierten ECs.
Abbildung 1:. Eine Monoschicht von Endothelzellen auf der Mikroobjekt kultivierten HUVECs wurden kultiviert O / N auf Fibronectin (50 ug / ml) beschichtete Mikroobjekt III (0.1) unter Scherbeanspruchung (1 dyn / cm 2)) bei 5x Ziel. (EC Plan Neofluar 5X/0.16), komplette Strömungskanalbreite mit kultivierten Endothelzellen beobachtet. Die Breite des Kanals wurde gemessen, um 1,545.95 um. B) Bei 10X-Objektiv (Plan Neofluar 10X/0.3 Ph1), um 1,065.79 des Kanals beobachtet wurde. Dies deutet darauf hin, dass ECs auf der Mikroobjekt kultiviert werden, O / N und 70% der Mikroobjekt bei 10-facher Vergrößerung sichtbar ist. Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößern version dieser Figur.
Abbildung 2. Rollgeschwindigkeit von MDA-Zellen kultiviert auf ECs auf der Mikroobjekt. Eine Million unmarkierten und J591-488 markierten MDA-Zellen wurden über IL-1β-stimulierten HUVECs durchblutet. Zehn Videos in verschiedenen Bereichen auf dem Mikroobjektträger wurden in 1,5 aufgenommen und 10 dyn / cm 2. Shear Stress Berechnungen wurden vom Hersteller zur Verfügung gestellt. Offline-Analyse für die Walzgeschwindigkeit durchgeführt wurde. n = Anzahl von Zellen für die Rollgeschwindigkeitsmessungen gezählt. Box-Plot zeigt die Verteilung der Walzgeschwindigkeiten und mittlere Unterschiede zwischen J591-488 markierten und unmarkierten MDA-Zellen. p <0,05, Wilcoxon-Rangsummentest. Die Kreise stellen die Ausreißer. Bitte klicken Sie hier, um view eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Immunfärbung von MDA-Zellen die Interaktion mit ECs auf der Mikroobjekt. Eine Million MDA-Zellen wurden über IL-1β-stimulierten HUVECs bei 1 dyn / cm 2 Schubspannung durchblutet. Nach der Perfusion wurde die Immunfärbung auf der Mikroobjektdurchgeführt. Die gelben Pfeile zeigen MDA Zellen fest mit der ECs geklebt. PSMA = Rot, VE-Cadherin = Grün, Blau = DAPI. Das fusionierte Bild zeigt alle Farben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Video 1. Ein Video, das die Wechselwirkungen zwischen IL-1β-stimulierten HUVECs und anti-PSMA-J591-488-markierten CTC von einer Prostata-Krebs-Patienten bereichert. Eine Monoschicht of HUVECs wurde auf der Mikroobjekt III (0.1) und anti-PSMA-J591-488-markierten peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), die von einem Patienten CTCs angereichert kultivierten HUVECs wurde mit 1 dyn / cm 2 durchströmt. Während der Perfusion wurden kurze 30 Sekunden Videos aufgenommen, auf verschiedenen Feldern auf der Mikroobjekt. Die Aufnahmezeit des Videos wird in der linken unteren Ecke angezeigt. Verschiedene kurze Videos wurden zusammengenäht, um dieses Video zu kompilieren. 02.16.36 an, ein nicht-wechselwirkenden CTC tritt in den oberen linken Bereich der Ansicht; am 02.19.16, einem anderen nicht-wechselwirkenden CTC in die linke Ecke Feld; am 02.23.12, eine stabil eingehalten CTC in der oberen Mittelfeld zu sehen ist. 02.38.09 an, wird eine stabil verklebt CTC auf der rechten Seite des Feldes aus gesehen wird gesehen. Dieses Video wurde unter Verwendung sowohl Hellfeld-und Fluoreszenzkanal, um die Wechselwirkungen von PBMCs als auch zu zeigen übernommen. Am 02.40.18, wurden stabil eingehalten CTC in der oberen Mittelfeld beobachtet. Dieses Video wurde mit Hellfeld genommenund fluoreszierende Kanal, um die Rollverhalten in PBMCs zu zeigen. Vom 02.51.39 bis 02.51.49 wurde ein CTC ausstellenden Tethering Verhalten in der unteren Gesichtsfeld beobachtet. Klicken Sie hier, um Video anzusehen.
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Discussion
Aufgrund der geringen Anzahl von CTC unter Blutzellen, ist es schwierig, CTC als reine Population von Zellen zu isolieren. Um CTC / EC-Interaktionen zu untersuchen, die seltene und unreine Bevölkerung von CTC stellt zwei großen Herausforderungen: a) Identifikation von CTC unter Blutzellen; b) Beobachtung der CTC / EC-Interaktionen.
Um die erste Einschränkung der Identifizierung Prostata CTC unter Blutzellen zu überwinden, nutzten wir die Tatsache, dass praktisch alle Prostata-Tumorzellen exprimieren PSMA-6. Monoklonale Antikörper J591-488 wird nach Zelloberflächenbindungs darauf hindeutet, dass PCa CTC können ex vivo markiert und untersucht für CTC / EC 13 Wechselwirkungen werden verinnerlicht. Für optimale Internalisierung des Antikörpers und die maximale Immunfluoreszenz, inkubierten wir MDA-Zellen mit dem Antikörper bei entweder 4 ° C oder 37 ° C für entweder 30 Minuten oder 1 Stunde. Wir beobachteten, dass die maximale Immunfluoreszenz wurde beobachtet37 ° C für 30 min (Daten nicht gezeigt) und Immunfluoreszenz-Markierung von Prostatazellen haben im Vergleich mit nicht-markierten Zellen der Prostata nicht auf die Rollverhalten.
Um die zweite Einschränkung zu überwinden, testeten wir verschiedene Strömungskammer Baugruppen wie PPFC, BioFlux Mikrofluidik-System, und Mikroobjekttragerglaschen 7. Die PPFC hat sich zu einem Standbein auf Leukozyten und Tumorzellinteraktionen mit ECs unter physiologischen Strömungsverhältnisse 9 zu prüfen. Dieses Strömungssystem funktioniert gut, um Wechselwirkungen der großen Anzahl von Zellen wie Krebszelllinien zu untersuchen, aber nicht ideal zur Beobachtung und Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen seltenen Zellen, wie Patienten stamm CTCs und ECs. CTC, wobei seltene Zellen können mit ECs zufällig an einem beliebigen Ort im Strömungskanal interagieren, daher wird die Aufnahme der vollen Breite des Strömungskanals erforderlich, um während der Wiedergabe Analyse beobachten und analysieren die seltenen Fall Wechselwirkungen zwischen CTC / ECs. The Breite des Silastik Dichtung in der PPFC (2,5 mm) verwendet wird, nicht mit einer vollständigen Gesichtsfeld unter 10-fach Objektiv. Während bei einer niedrigeren Vergrößerung als 10X-Objektiv, wird es schwierig, CTC / EG Wechselwirkungen deutlich zu beobachten. Ferner ist ein geringes Totvolumen in den Verbindungsrohren wesentlich Einfangen von CTC in den Verbindungsrohren zu vermeiden. Die Silastik Verbindungsrohre mit dem Standard PPFC vorgesehen haben eine große Innendurchmesser (0,16 Zoll). Im Gegenteil, bietet BioFlux Mikrofluidik-System Vollbild unter 20X Objektiv und ist nützlich bei der Untersuchung scherinduzierten Veränderungen in der ECs 14, jedoch beginnen die Krebszellen Ansiedlung in den Kammer Brunnen, die zu nicht-gleichförmige Strömung. BioFlux Mikrofluidik ist nützlich bei der Untersuchung scherinduzierten Veränderungen in der ECs jedoch technisch umständlich zu bedienen ist. Unsere selbstorganisierten Flusskammer mit Mikroobjekt hat einen schmalen Kanalbreite (1 mm) als die Standard-Kanalbreite in PPFC, so dass mehr Beobachtungenlen Bereich. Auch ECs unter Perfusion in Mikroobjekt Simulation physiologischen Blutfluss im Gegensatz zu Ganguly et al. 7 kultiviert, Studien, in denen ECs auf Mikroobjekttragerglaschen (mit breiteren Kanalbreite) unter statischen Bedingungen gewachsen. Das Totvolumen im Inneren der Verbindungsrohre unter Verwendung eines Verbindungsrohrs mit einem Innendurchmesser von 0,02 in. Zusammen Immunofluoreszenz-Markierung von Prostata-Tumorzellen, die richtige Strömungskanalbreite und kleineren Innendurchmesser der Verbindungsrohre verringert erlaubt es, Prostata CTC identifizieren und ihre Wechselwirkungen mit ECs beobachten.
Es gibt einige kritische Schritte in der Protokoll jedoch mit der richtigen Pflege die Experimente reibungslos laufen. Verhinderung von Blasen ist entscheidend für jede flussbasierten Experimenten. Nach unserer Erfahrung mit warmem (37 ° C) Wachstumsmedium, Anschlüsse und Spritze verhindert die Bildung von Blasen, die durch die Verringerung der Temperaturunterschiede. In zusätzn, sollte darauf während Sie die Spritze mit der Mikroobjekt genommen werden. Sowohl der Stecker an der Spritze und dem Einlaß der Mikroobjekt angebracht ist bis zum Rand gefüllt werden, wodurch verhindert Blasenbildung. Einer der Nachteile dieser Technik ist, dass, da die Mikroobjektkanal 45 x 1 mm (Länge x Breite), kann es nur halten 4,5 ul Wachstumsmedium. Daher kann nicht für statische Mikroobjektkultur verwendet werden und erfordert kontinuierliche Perfusion des Wachstumsmediums zur Versauerung zu verhindern und die Aufrechterhaltung der richtigen Zufuhr von Nährstoffen für HUVECs. Jedoch kann eine kontinuierliche Zufuhr von Medium leicht durch Verwendung einer Spritzenpumpe zu dem Mikroobjekt im Inkubator verbunden erreicht werden. Während bereichern CTC von Patienten mit Prostatakrebs, sollte darauf geachtet werden, vor fällt werden alle Röhrchen, Spitzen, Pipetten oder Spritzen in Kontakt mit CTC mit R / S-Puffer nicht-spezifische Bindung zu verhindern. Zusätzlich werden alle Schritte nach Ficoll-Paque-Dichtezentrifugation, Except J591-488-Antikörper-Inkubation bei 4 ° C durchgeführt werden, um den Abbau des CTC zu verhindern.
Unsere Technik ist im Vergleich zu verschiedenen Methoden verstehen CTC Biologie einzigartig. Der vorliegende Bericht beschreibt tragfähige Fluoreszenzimmunmarkierung von Prostata-CTC, die man, um die funktionellen Eigenschaften von Prostata-CTC zu beobachten, außer nur die phänotypischen Eigenschaften ermöglicht. Darüber hinaus erfordert das beschriebene Verfahren geringen Proben / Reagenz Volumen als andere Methoden, so dass es ein ideales System für Immunfluoreszenz-Studien. Unsere Methode bietet eine einzigartige Plattform, um Wechselwirkungen zwischen CTC Prostata von Patienten und ECs abgeleitet studieren somit hilft, die Mechanismen der Entwicklung von Prostatakrebs-Metastasen zu verstehen. Diese Technik hat das Potential für mehrere Anwendungen, die durch Scherströmung basierend Studien wie Zell-Zell-Interaktionen 8, Zelle-Protein-Wechselwirkungen 15 16 und scherinduzierten Veränderungen in ECs 14.
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Disclosures
Dr. Bander ist der Erfinder von Patenten, die Cornell Research Foundation ("CRF") für die Antikörper-J591 in diesem Artikel verwendet zugeordnet sind. Dr. Bander ist Berater und besitzt Lager in BZL Biologics, des Unternehmens, dem die Patente wurden von CRF für die weitere Forschung und Entwicklung lizenziert.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung von Department of Defense-Prostate Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124) unterstützt, U54CA143876 von der National Cancer Institute, und der Robert McCooey Genitourinary Oncology Research Fund. Wir würden uns für die Bereitstellung von HUVECs Herrn Dr. Annarita Lorenzo (Institut für Pathologie) zur Bereitstellung von VE-Cadherin-Antikörper danken und Dr. Marco Seandel (Abteilung für Chirurgie).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Cole Parmer | EW-96115-08 | |
| Male Luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female Luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
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- Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
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