Summary
التنميط الجزيئي للخلايا الليزر microdissected وسدى من الاصطناعية، ونماذج سرطان القولون والمستقيم الأنسجة المهندسة يمثل الرواية والنهج manipulatable لتوصيف وتشريح الأحياء المتميزة في مجال التفاعل بين الخلايا السرطانية في الجبهة الغازية وسرطان الخلايا اللحمية المرتبطة.
Abstract
غزو سرطان القولون والمستقيم قد المكتسب (CRC) الخلايا القدرة على التحرر من الخلايا أختهم، اختراق سدى، ويعيد المصفوفة خارج الخلية (ECM). يمكن أن تميز بيولوجيا هذه المجموعة المتميزة ظاهريا من خلايا تحسين فهمنا بشكل كبير من الأحداث في وقت مبكر خلال تتالي النقيلي.
غزو الورم هو عملية ديناميكية سهلت التفاعلات ثنائية الاتجاه بين ظهارة الخبيثة والسرطان المرتبطة سدى. من أجل دراسة استجابات الخلايا المحددة في الورم سدى واجهة جمعنا بين عضوي النمط ثقافة مشتركة والتقنيات الدقيقة تشريح الليزر.
نماذج عضوي النمط، الذي المكونات الرئيسية مثل انسجة الخلايا الليفية هي 3 dimentioanally شارك في تربيتها مع سرطان الخلايا الظهارية، هي أدوات تجريبية manipulatable للغاية التي تمكن الغزو والتفاعلات السرطان سدى لدراستها في شبه فتاهشروط ysiological.
الليزر تسليخ مجهري (LMD) هو الأسلوب الذي ينطوي على تشريح الجراحي واستخراج الطبقات المختلفة داخل أنسجة الورم، مع مستوى الدقة ميكرون.
من خلال الجمع بين هذه التقنيات مع التنميط الجيني، transcriptomic وجينية ونحن نهدف إلى تطوير فهم أعمق للخصائص الجزيئية لغزو الخلايا السرطانية والأنسجة المحيطة اللحمية، وبذلك يحتمل أن تكشف المؤشرات الحيوية والفرص المتاحة لتطوير الأدوية في CRC الرواية.
Introduction
عضوي النمط المشترك الثقافات نماذج الأنسجة المهندسة التي تساعد في إعادة بناء في الجسم الحي الورم المكروية في 3 أبعاد ازدواجية بواسطة الخلايا الظهارية الخبيثة والخلايا اللحمية في هلام الكولاجين تحتوي على مكونات المصفوفة خارج الخلية الأساسية 1-3. تصور أساسا كوسيلة لقياس غزو الورم، organotypics تقليل الاعتماد على النماذج الحيوانية في الجسم الحي، وتجنب أوجه القصور في غيرها من تقنيات في المختبر مثل فحوصات Transwell، التي يضطر فيها الخلايا الغازية بشكل مصطنع في حالة تشتت أحادية 2-4. إدراج الخلايا اللحمية في هذه النماذج، مثل الخلايا الليفية، ويعكس الدور الأساسي للالمكروية الورم الخبيث في تنظيم الغزو والانبثاث 3-4، ولكن عدم التجانس المظهري للسدى هو أن هذه من أجل تحقيق أقصى قدر من الأهمية الفسيولوجية للعضوي النمط نماذج، محددة الجهاز ودقيقة تشريحيا فيفو السابقينينبغي أن تدرج الخلايا الليفية حيثما كان ذلك ممكنا 3،6.
Organotypics هي منصة متعددة لدراسة التفاعلات بين الورم والخلايا اللحمية وتستخدم بشكل متزايد في طرق جديدة لدراسة تأثير ذلك على غزو الورم من مثبطات الكيميائية والتعديلات الجين المستهدف 7،8. دراسة الهامش الورم الغازية هو احتمال مثيرة بشكل خاص. في النماذج عضوي النمط، سرطان القولون والمستقيم إنشاء (CRC) خطوط الخلايا عادة تنتج طبقة الطلائية الطبقية بشكل جيد، وفي المقطع العرضي، والخلايا التي اكتسبت القدرة على غزو المصفوفة خارج الخلية (ECM) يمكن تمييز بسهولة. في ضوء عدم التجانس الدقيقة الطبوغرافية أنشئت من الورم والأورام المرتبطة الخلايا اللحمية في الجسم الحي، واستخراج هذه الخلايا باستخدام الليزر تسليخ مجهري ودراستها في عزلة، قد تكشف عن رؤى البيولوجية الهامة المتعلقة أصول القولون والمستقيم ورم خبيث من السرطان وكيف يمكن أن تكون أكثر كفاءة المستهدفة. أنان المنهجية التالية، جميع المرضى الذين تبرعوا عينات الأنسجة قدمت موافقة خطية مستنيرة، والدراسة وتمت الموافقة من قبل المؤسسات جنة أخلاقيات البحوث الإقليمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. مؤسسة الثقافات الخلايا الليفية الأولية من القولون إإكسبلنتس
- الحصول على عينات من الأنسجة الطبيعية القولون المخاطي الإنسان مباشرة من غرفة العمليات الجراحية، ووقف في 7-10 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، و 0.25 ميكروغرام / مل Fungizone.
- في المختبر، ضع عينة في وسط طبق 10 سم زراعة الأنسجة ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني / القلم بكتيريا / Fungizone. لا نضح بعد غسل النهائي.
- مع ملقط معقم ومشرط، وقطع الأنسجة الى قطع صغيرة (2mm في تقريبا) ووضع كل قطعة في مركز الصليب تعادل مع شفرة المشرط في 12 لوحة جيدا. صخرة مشرط بلطف على الأنسجة لتمكينها من الالتزام.
- الثقافة العينات في 750 ميكرولتر سائل الإعلام نمو الخلايا الليفية الأساسية (DMEM تستكمل مع 20٪ مصل العجل الجنين (FCS)، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين و 292 ميكروغرام / مل L-الجلوتامين)، والتي ينبغي submeRGE الأنسجة دون تمكنها من أن تطفو. تجنب إزعاج لوحة على مدى 5 أيام القادمة إلا إلى إعادة تغذية كل يوم 2.
- خلال 5 أيام القادمة الليفية سوف تبدأ ببطء للتخلص من على حافة النسيج. في حوالي 7 أيام، وهذا سيكون أكثر وضوحا. بعد حوالي 3-4 أسابيع، وإذا كان هناك ما يكفي من الخلايا الليفية نابتا، إضافة 750 ميكرولتر التربسين إلى كل بئر. بعد الخلايا قد فصل (والذي قد يستغرق 5-10 دقيقة) وحوض سباحة ونقل إلى T-25 نسيج الثقافة قارورة.
2. إعداد عضوي النمط
إعداد الخلايا الليفية مشربة هلام عضوي النمط:
- إعداد تعليق خلية الليفية تحتوي على 5 × 10 5 خلايا لكل عضوي النمط في DMEM تستكمل مع FCS 10٪ و 292 ميكروغرام / مل L-الجلوتامين.
- تشكل المواد الهلامية عضوي النمط على الجليد، في النسب التالية:
- 7 مجلدات من-الجرذ الذيل الكولاجين: Matrigel مزيج (1:1)
- 1 حجم 10X تصفيتها DMEM
- 1 حجم FCS
- 1 حجم الخلايا الليفية تعليق خلية تحتوي على 5 × 10 5 الخلايا الليفية
ل9 المواد الهلامية (1 مل لكل هلام) إعداد 10 مل وتخلط برفق لتجنب الفقاعات.
- إضافة 1 مل لكل بئر من لوحة 24 جيدا واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 ° مئوية في جو مرطب للسماح المواد الهلامية لتعيين. بعد 1 ساعة إضافة 1 مل DMEM (10٪ FCS) / التخمة على رأس المواد الهلامية والعودة إلى الحاضنة بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، نضح المتوسطة من الجزء العلوي من لوحة والمواد الهلامية 1ml من وسائل الإعلام التي تحتوي على 5 × 10 5 CRC الخلايا الظهارية.
إعداد هلام المغلفة ورقة النايلون:
- إعداد العقيمة، وصحائف النايلون تعقيمها قياس 1.5 سم × 1.5 سم، مقدما.
- باستخدام ملقط معقم، ضع العدد المطلوب من أوراق النايلون في طبق ثقافة 10 سم (عادة 4 صحائف النايلون يمكن استيعابها لكل طبق).
- تشكل هلام على الجليد في الترتيب التالي (250 ميكرولتر مجموعمطلوب لكل ورقة النايلون حجم):
- 7 مجلدات من-الجرذ الذيل الكولاجين
- 1 حجم 10X تصفيتها DMEM
- 1 حجم FCS
- 1 حجم DMEM 10٪ FCS / تخمة
- إذا الحل هو الأصفر، وتحييد بإضافة هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M في 50 ميكرولتر مأخوذة حتى يتحول الحل الوردي.
- إضافة 250 ميكرولتر من هذا الحل إلى كل ورقة النايلون واحتضان عند 37 درجة مئوية في جو ترطيب 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة للسماح للهلام لتعيين.
- يشكلون 1٪ من محلول غلوتارالدهيد في برنامج تلفزيوني. إضافة 10 مل لكل طبق ثقافة 10 سم مرة واحدة وضعت جل واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- صحائف النايلون غسل 3x أخرى في برنامج تلفزيوني و 1X في DMEM (10٪ FCS) / غلو واحتضان بين عشية وضحاها في DMEM / غلو في 4 درجات مئوية.
رفع المواد الهلامية عضوي النمط على شبكات الصلب لغزو:
- قبل إعداد شبكات السقالات من قبل للطي ورقة الفولاذ المقاوم للصدأ في تشكيل ترايبود. الأوتوكلاف قبل استخدامها.
- استخدام ملقط معقم في الإيثانول لوضع شبكة من الصلب في كل بئر من لوحة جيدا ستة.
- وضع ورقة النايلون المغلفة هلام الكولاجين مع الجانب العلوي، على كل الشبكة.
- نقل بعناية المواد الهلامية عضوي النمط من 24 لوحة جيدا إلى ورقة النايلون التي أثيرت باستخدام ملعقة معقمة في الايثانول.
- ملء البئر مع DMEM 10٪ FCS / تخمة تستكمل مع FCS 10٪ حتى ورقة النايلون هو في اتصال مع المتوسطة ولكن لا تغمرها المياه. تأكد من وسيلة لا تلمس هلام عضوي النمط.
- احتضان لمدة 14 يوما عند 37 درجة مئوية في جو ترطيب 5٪ CO 2، لتحل محل وسائل الإعلام كل يوم 2.
3. عضوي النمط التثبيت
- إزالة عضوي النمط كله بما في ذلك ورقة النايلون من بئر ووضع على التشبث الفيلم.
- شطر عضوي النمط ورقة النايلون باستخدام مشرط المتاح نظيفة وإصلاح كل شطر في الفورمالديهايد لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- استبدال الفورمالديهايد مع 70٪ إيثانرأ بعد 24 ساعة وترك بين عشية وضحاها قبل التضمين في البارافين، باجتزاء، وتلطيخ.
4. تسليخ مجهري ليزر من الهامش الغازية
- القسم إلى 10 ميكرون سماكة الغشاء شنت على الشرائح.
- Deparaffinize المقاطع من خلال تطبيق الزيلين لمدة 1 دقيقة، ثم إزالة الزيلين وإصلاح في 75٪ من الإيثانول ل1 دقيقة أخرى.
- إزالة الإيثانول وصمة عار مع 0.125٪ حل البنفسجي cresyl لمدة 1 دقيقة. البنفسجي cresyl يسلط الضوء على الخلايا الظهارية ويسمح سهلة التمييز من سدى.
- إزالة البنفسجي cresyl وتطبيق الإيثانول بنسبة 100٪ ل1 دقيقة أخرى قبل الشطف مع الإيثانول بنسبة 100٪. تسمح الشرائح إلى الهواء الجاف لمدة 30 دقيقة.
- إجراء تسليخ مجهري ليزر باستخدام منصة المختار (مثل نظام لايكا AS).
- وضع شريحة زجاجية مع القسم الملون أن يكون وجهه لأسفل microdissected على المسرح المجهر.
- جبل أنبوب 0.5 مل ميكروسنتريفوج في الكاسيت جمع وإضافة 50 ميكرولتر منالعازلة تحلل الخلية (مثل DNA، RNA أو البروتين تحلل العازلة) إلى الحد الأقصى في الأنسجة التي سوف microdissected جمع.
- تحت الرؤية المباشرة، استخدم عصا التحكم لتحديد الأنسجة من الاهتمام، واستخدام واجهة البرنامج، تعليم قسم العضوية الملون، وتسليط الضوء الخلايا المراد microdissected في الجبهة غزو الورم.
- تكليف ليزر لاطلاق النار، والتي يتعين على قطع المقطع أبرز ودفع الأنسجة microdissected إلى الحد الأقصى من أنبوب microcentrifuge.
- مرة واحدة وقد تم جمع مادة كافية، إخراج الكاسيت جمع وإغلاق أنبوب microcentrifuge وتدور بلطف لرسم تحلل العازلة إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
- وضع العينات على الجليد حتى تسليخ مجهري كاملة. عينات العملية من خلال طريقة مناسبة لاستخراج تحليلها من الفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد طبقنا الأسلوب أعلاه إلى مجموعات متعددة من خطوط الخلايا اتفاقية حقوق الطفل والخلايا اللحمية. أحد الأمثلة المعروضة هنا هي خطوط الخلايا الظهارية SW480 جنة حقوق الطفل مع فيفو السابقين الخلايا الليفية القولون الإنسان الأساسية. هي التي شيدت 3 الابعاد المشترك الثقافات (الشكل 1)، تعرض لالمجهري والليزر التقاط تسليخ مجهري (الشكل 2)، وتحليلها من قبل الرنا الميكروي (ميرنا) التنميط (الشكل 3) للمقارنة لل miRNAs وأعرب تفاضلي بين الخلايا في الجزء الأمامي الورم الغازية وتلك في طبقية (غير الغازية) مناطق الورم.
الشكل 1. تخطيطي وتمثيل تصويري للنموذج عضوي النمط. هي المصنفة الخلايا اتفاقية حقوق الطفل على طبقة اللحمية الاصطناعية التي تحتوي على الخلايا الليفية ومكونات المصفوفة خارج الخلية الأساسية. الخلايا شارك في تربيتها في واجهة الهواء السائل التي أنشأتها رفع هلام عضوي النمط على العقيمة شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
. الرقم 2 LMD الخلايا SW480 CRC غزو سدى عضوي النمط يستخدم البنفسجي cresyl لتسليط الضوء على اتفاقية حقوق الطفل الخلايا الظهارية (A)؛ ثم يتم تعريف الجزر الورم الغازية (B)؛ قبل تشريح الليزر يحدث (C) ويتم نقل قطع قطعة لجهاز جمع (D). يتم تحديد غير غزو الخلايا والخلايا اللحمية ومعزولة باستخدام نفس المنهجية.w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. الرنا الميكروي البيانات ميكروأري. تم مسحها ضوئيا باستخدام صفائف GenePix برو 3.0.5 الماسح الضوئي للكشف عن Cy5 في طول موجة من 635 نانومتر. كانت شدة الفلورسنت يعني تطبيع ونسب احتساب التعبير بين الليزر microdissected الخلايا CRC هامش الغازية والخلايا CRC الهامش غير الغازية في الطبقات الظهارية الطبقية. تم فرز البيانات عن طريق التغيير أضعاف وقيم البيانات + / - 2 تغيير أضعاف من تجربة تمثيلية يتم عرض يظهر الفرق ميرنا التعبير الجيني بين الخلايا والخلايا الغازية هامش الهامش غير الغازية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا تصف طريقة لعزل وتوصيف تحديدا الخلايا السرطانية التي حصلت على القدرة على غزو السرطان المرتبطة سدى خلال المراحل الأولى من تطور المنتشر في 3 الابعاد بناء ثقافة مشتركة من الخلايا الظهارية واللحمية.
واستخدمت نماذج التعاون ثقافة تتألف من اتفاقية حقوق الطفل الخلايا الظهارية جنبا إلى جنب مع سدى الاصطناعية التي تحتوي على فيفو السابقين الخلايا الليفية القولون الإنسان لدراسة الغزو اتفاقية حقوق الطفل في 3 أبعاد. هذا النظام من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة التي يقلد في ظروف فيفو يمكن تكييفها لسيناريوهات السرطان الأخرى عن طريق استبدال الخلايا في الظهارة وبناء سدى باستخدام فيفو السابقين الخلايا الليفية من مختلف الأصول التشريحية. واحد الحد من هذا النهج هو التبسيط من المقصورة اللحمية باستخدام الخلايا الليفية فقط، كما سدى القولون في الجسم الحي هو نسيج معقد وديناميكي مع سل متفاوتةالمكونات لتر. ومن الأمثلة على الخلايا المشتقة من المناعة، والتي هي موجودة بكميات كبيرة في المواد الورم الرئيسي ولكن تغيب عن هذا النموذج. على الرغم من هذا، ويمكن الاعتماد عليها استنساخ هذا النموذج إلى جانب السهولة التي مكونات الخلية يمكن التلاعب بها تجريبيا (على سبيل المثال من قبل أكثر من التعبير أو ضربة قاضية الجينات الفردية في الظهارية وانسجة مقصورات)، وجعل هذا نموذج القيمة والفعالة من حيث التكلفة مقارنة لالتقليدية في الجسم الحي التجريب.
في هذه المخطوطة أثبتنا أيضا أن الخلايا لجنة حقوق الطفل في الجبهة الغازية الورم في هذا النظام النموذجي التعبير عن مختلف التشكيلات ميرنا التعبير إلى خلايا متطابقة لا في الجبهة الغازية والتي تقع في طبقات الطلائية الطبقية. هذا يمثل دليلا على أن مفهوم الليزر الأنسجة microdissected من نماذج التعاون ثقافة عضوي النمط هو نهج صحيح لدراسة العمليات في وقت مبكر من ورم خبيث. التركيز كانإعادة كانت حصرا على ميرنا التعبير، منذ miRNAs متورطين بشدة في التسبب في العديد من الأورام الخبيثة وحررت التعبير سواء في الظهارية والسرطان المرتبطة الخلايا اللحمية تكون له عواقب هامة في اتفاقية حقوق الطفل 2،3،5. وعلاوة على ذلك miRNAs مستقرة لاستخراج وتحليل من الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين الثابتة الفورمالين الأرشيفية التقليدية، مما يجعلها المؤشرات الحيوية القوية لأغراض التشخيص والتكهن في الأنسجة البشرية يتعرض للمعالجة التقليدية في مختبرات الأنسجة الروتينية 9،10. ومع ذلك، يمكن بسهولة جدا أن تتكيف منهجيتنا للتحليل الجيني والبروتين، كذلك التأكيد على براعة هذا النهج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفين الكشف عن أي تعارض محتمل في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم MB بتمويل منحة زمالة من لجنة نهر الميكونج. معتمدة KP وAHM بتمويل منحة من يسيكس البحوث الطبية ومعهد أبحاث السرطان في المملكة المتحدة / RCS (انجلترا) (C28503/A10013). ونحن ممتنون للدعم من جامعة ساوثهامبتون حدة أبحاث كيمياء الأنسجة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al. miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance. Cancer Res. , (2013).
- Bullock, M. D., et al. Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression. Cell Death Dis. 20 (4), (2013).
- Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. Measuring invasion in an organotypic model. Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).
- De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth. Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).
- Fries, K. M., et al. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).
- Moutasim, K. A., et al. Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis. J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).
- Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).
- Li, J., et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells. BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).
- Szafranska, A. E., et al. Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling. J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).
