Summary
פרופיל מולקולרי של תאי לייזר microdissected וstroma ממודלים סינטטיים, רקמות מהונדסות סרטן מעי גס מייצג רומן גישה למניפולציה כדי לאפיין ולנתח את הביולוגיה הייחודית בממשק שבין תאים סרטניים בחזית פולשנית ותאי סטרומה סרטן קשור.
Abstract
פלישה לסרטן מעי גס תאים (CRC) רכשו את היכולת להשתחרר מתאי אחותם, לחדור stroma, ולשפץ את מטריצת החוץ תאית (ECM). אפיון הביולוגיה של קבוצת phenotypically מובחנת זו של תאים יכול לשפר באופן משמעותי את ההבנה של אירועים המוקדמים שלנו במפל גרורתי.
פלישת גידול היא תהליך דינמי בהנחייתם של אינטראקציות דו כיוונית בין האפיתל הממאיר וstroma הסרטן קשור. על מנת לבחון את תגובות תא ספציפי בstroma ממשק גידול יש לנו שילוב organotypic תרבות משותפת וטכניקות מיקרו לנתיחה בלייזר.
מודלים Organotypic, שבו בוחרי סטרומה מפתח כגון fibroblasts הם 3-dimentioanally שיתוף תרבותי עם תאי האפיתל בסרטן, הם כלים ניסיוניים למניפולציה מאוד אשר יאפשר פלישה ואינטראקציות הסרטן stroma להיחקר בכמעט phתנאי ysiological.
microdissection הלייזר (LMD) הוא טכניקה שכרוכה נתיחה כירורגית וחילוץ של השכבות השונות בתוך רקמת גידול, עם דיוק ברמת מיקרון.
על ידי שילוב של טכניקות אלה עם פרופיל גנומי, transcriptomic ואפיגנטיים אנו שואפים לפתח הבנה עמוקה יותר של המאפיינים המולקולריים של פולשים לתאי גידול ורקמה מסביבו סטרומה, ותוך כדי כך שעלול לחשוף סמנים ביולוגיים והזדמנויות לפיתוח תרופה בCRC רומן.
Introduction
שיתוף תרבויות Organotypic דגמי רקמות מהונדסות אשר מסייע בשחזור in vivo microenvironment הגידול ב3 ממדים על ידי הפוצעים תאי האפיתל ממאירים ותאי סטרומה בג'ל קולגן המכיל רכיבי מטריצה תאית חיוניים 1-3. בעיקר נתפס כשיטת מדידת פלישת גידול, organotypics להפחית את התלות בin vivo מודלים של בעלי חיים, ולמנוע את החסרונות של טכניקות במבחנה אחרות כגון מבחני Transwell, שבו תאים פולשים נאלצים באופן מלאכותי למצב פיזור מונו 2-4. הכללתם של תאי סטרומה במודלים אלה, כגון fibroblasts, משקף את התפקיד החיוני של microenvironment הגידול בויסות פלישה גרורה 3-4 ממאירים, לעומת זאת ההטרוגניות פנוטיפי של stroma היא כזה שעל מנת למקסם את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של organotypic מודלים, ספציפי איבר, מדויק מבחינה אנטומית vivo לשעבריש לכלול fibroblasts בכל מקום אפשרי 3,6.
Organotypics הוא פלטפורמה מגוונת כדי לחקור אינטראקציות בין סרטניים ותאי סטרומה ומשמש יותר ויותר בדרכים חדשות כדי לבחון את ההשפעה על פלישת גידול של מעכבים כימיים ושינויי גן ממוקדים 7,8. לומד את שיעור גידול החודרני הוא סיכוי מרגש במיוחד. בדגמי organotypic, שורות תאי סרטן מעי גס שהוקם (CRC) בדרך כלל מייצרות שכבת האפיתל גם מרובד, ובחתך, תאים שרכשו את היכולת לפלוש למטריצה תאית (ECM) בקלות לעין. לאור ההטרוגניות הוקמה מיקרו הטופוגרפי של גידול ותאי סטרומה גידול קשור in vivo, הוצאת תאים אלה באמצעות microdissection לייזר ולומד אותם בבידוד, עשוי לחשוף תובנות ביולוגיות חשובות הנוגעות למקורות של גרורות סרטן מעי גס, ואיך זה יכול להיות בצורה יעילה יותר ממוקד. אניn המתודולוגיה הבאה, כל החולים שתרמו דגימות רקמה הניתנות בכתב הסכמה מדעת, והמחקר אושר על ידי ועדת אתיקה מוסדות מחקר האזורית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הקמת תרבויות עיקרי פיברובלסטים מExplants הגס
- להשיג דגימות של רקמת רירית מעי גס אנושי נורמלית ישירות מחדר הניתוח כירורגי, ולהשעות ב7-10 מיליליטר של PBS בתוספת 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו0.25 מיקרוגרם / Fungizone מיליליטר.
- במעבדה, הנח את הדגימה במרכז צלחת תרבית רקמת 10 ס"מ ולשטוף 3 פעמים עם PBS / עט סטרפטוקוקוס / Fungizone. אל לשאוב לאחר לשטוף הסופי.
- עם מלקחיים ואזמל סטרילי, לחתוך את הרקמה לחתיכות קטנות (כ 2 מ"מ) ומניח כל חתיכה במרכזו של צלב נמשך עם להב סכין המנתחים ב12 גם צלחת. רוק האזמל בעדינות מעל הרקמות כדי לאפשר לו לדבוק.
- תרבות הדגימות ב750 μl תקשורת צמיחת פיברובלסטים ראשונית (DMEM בתוספת 20% עוברי עגל בסרום (FCS), 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ו292 מיקרוגרם / מיליליטר L-גלוטמין), אשר אמור submeRGE הרקמה מבלי לאפשר לו לצוף. הימנע מלהפריע את הצלחת ב -5 הימים הבאים מלבד מחדש הזנה כל 2 ימים.
- במהלך 5 הימים הבאים fibroblasts יתחיל לאט לגדול מהקצה של הרקמה. בכ -7 ימים, זה יהיה גלוי יותר. לאחר כ 3-4 שבועות, ואם יש מספיק fibroblasts צומח, להוסיף 750 טריפסין μl היטב כל אחד. אחרי תאים יש מנותקים (אשר עשוי להימשך 5-10 דקות), בריכה והעברה לבקבוק תרבית רקמת T-25.
2. Organotypic הכנה
הכנת ג'ל organotypic פיברובלסטים ספוגים:
- הכן את ההשעיה תא פיברובלסטים המכילה 5 x 10 5 תאים לכל organotypic DMEM בתוספת FCS 10% ו292 מיקרוגרם / מיליליטר L-גלוטמין.
- מרכיב את ג'לי organotypic על קרח, ביחסים הבאים:
- 7 כרכים של קולגן עכברוש זנב: תמהיל Matrigel (1:1)
- נפח של 1 DMEM 10x המסונן
- נפח של 1 FCS
- 1 נפח של השעיה תא פיברובלסטים המכילה 5 x 10 5 fibroblasts
ל9 ג'לים (1 מיליליטר לג'ל) להכין 10 מ"ל ומערבבים בעדינות כדי למנוע בועות.
- הוסף 1 מיליליטר היטב בכל צלחת 24 היטב דגירה במשך שעה 1 ב 37 ° C באווירת humidified לאפשר ג'לים להגדרה. אחרי שעה 1 להוסיף 1 מיליליטר DMEM (FCS 10%) / שפע על גבי ג'לים ולחזור לחממת לילה.
- למחרת, בינוני לשאוב מהחלק העליון של ג'לים ו1ml צלחת של תקשורת המכילה 5 x 10 5 תאי אפיתל CRC.
הכנת יריעות ניילון ג'ל מצופה:
- כן סטרילי, יריעות ניילון autoclaved מדידת 1.5 סנטימטר x 1.5 סנטימטר, מראש.
- בעזרת מלקחיים סטריליות, למקם את המספר הנדרש של יריעות ניילון בצלחת 10 סנטימטר תרבות (בדרך כלל ניתן לאכלס 4 יריעות ניילון לכל צלחת).
- מרכיב את הג'ל על קרח לפי הסדר הבא (סה"כ μl 250נפח נדרש לגיליון ניילון):
- 7 כרכים של קולגן עכברוש זנב
- נפח של 1 DMEM 10x המסונן
- נפח של 1 FCS
- נפח של 1 DMEM 10% FCS / שפע
- אם הפתרון הוא צהוב, לנטרל על ידי הוספת 0.1 M NaOH ב50 aliquots μl עד הפתרון הופך ורוד.
- הוסף 250 μl של פתרון זה לכל גיליון ניילון ולדגור על 37 ° C באווירת humidified של 5% CO 2 למשך 30 דקות כדי לאפשר לג'ל להגדרה.
- מאפרים 1% פתרון glutaraldehyde ב-PBS. הוסף 10 מיליליטר לכל מנה תרבות 10 סנטימטר פעם אחת את הג'ל יש להגדיר ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- יריעות ניילון לשטוף 3x ב PBS ו1x בDMEM (10% FCS) / Glu ו דגירה הלילה בDMEM / Glu ב 4 ° C.
העלאת ג'לי organotypic על גבי רשתות פלדה לפלישה:
- טרום להכין רשתות פיגומים על ידי קיפול סדיני נירוסטה להיווצרות חצובה. החיטוי לפני השימוש.
- שימוש במלקחיים מעוקרים באתנול למקם רשת פלדה לבאר כל צלחת גם שש.
- מניחים יריעת ניילון מצופה ג'ל עם צד קולגן עליון, על גבי כל רשת.
- להעביר בזהירות את ג'לי organotypic מצלחת 24 גם ליריעת הניילון שהועלתה בעזרת מרית המעוקרת באתנול.
- מלא היטב עם 10% FCS / שפע DMEM בתוספת FCS 10% עד גיליון הניילון הוא במגע עם המדיום, אבל לא מתחת למים. ודא הבינוני אינו נוגע ג'ל organotypic.
- דגירה של 14 ימים על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO 2, החלפת תקשורת כל 2 ימים.
3. Organotypic קיבוע
- הסר את כל organotypic כולל יריעת ניילון מהיטב ומניח על סרט נצמד.
- לחצות organotypic וגיליון ניילון באמצעות אזמל חד פעמי נקי ולתקן את שני חצאים בפורמלדהיד ל24 שעות בטמפרטורת חדר.
- החלף פורמלדהיד עם איתן 70%ol לאחר 24 שעות ולהשאיר למשך לילה לפני ההטבעה בפרפין, חתך, וצביעה.
4. Microdissection הלייזר של בטחונות פולשני
- סעיף ל10 מיקרומטר עובי גבי קרום רכוב שקופיות.
- סעיפי Deparaffinize ידי יישום קסילן דקות 1, ולאחר מכן להסיר קסילן ולתקן ב75% אתנול ל1 דקות נוספות.
- הסר אתנול וכתם עם 0.125% פתרון cresyl יולט דקות 1. Cresyl יולט מדגיש תאי האפיתל ומתיר אפליה קלה מstroma.
- הסר cresyl ויולט ולהחיל 100% אתנול ל1 דקות נוספות לפני השטיפה עם 100% אתנול. לאפשר שקופיות לייבוש באוויר למשך 30 דקות.
- לנהל microdissection לייזר תוך שימוש בפלטפורמה שנבחרה (למשל המערכת לייקה AS).
- מניחים את שקף הזכוכית עם הסעיף המוכתם להיות microdissected עם פנים כלפי מטה על הבמה מיקרוסקופ.
- הר צינור 0.5 מיליליטר microcentrifuge לקלטת האוסף ולהוסיף 50 μl שלמאגר תמוגה התא (לדוגמא: DNA, RNA או מאגר תמוגה חלבון) לכובע שלרקמות microdissected יאספו.
- תחת ראייה ישירה, להשתמש בג'ויסטיק כדי לזהות רקמות של עניין, ותוך שימוש בממשק התוכנה, יסמן את הקטע האורגני המוכתם, הדגשת תאים להיות microdissected בחזית פלישת גידול.
- להנחות את הלייזר לירות, שאמורה גם לחתוך את הקטע המודגש ולהניע את רקמות microdissected לתוך הכובע של צינור microcentrifuge.
- ברגע שיש מספיק חומר כבר נאסף, להוציא את קלטת האוסף, סגור את צינור microcentrifuge ספין עדינות לצייר מאגר תמוגה לחלק התחתון של הצינור.
- מקום דגימות על קרח עד microdissection הושלם. דגימות תהליך על ידי שיטה מתאימה כדי לחלץ את אנליטי של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יש לנו ליישם את השיטה הנ"ל לשילובים רבים של שורות תאי CRC ותאי סטרומה. דוגמא אחת שהוצגה כאן היא שורות תאי אפיתל SW480 CRC עם האקס fibroblasts אדם העיקרי vivo במעי הגס. שיתוף תרבויות 3 ממדים בנויים (איור 1), נתון למיקרוסקופיה וmicrodissection ללכוד לייזר (איור 2), ונותחו על ידי microRNA פרופיל (מירנה) (איור 3) להשוואה של miRNAs הביע באופן דיפרנציאלי בין תאים בחזית הגידול פולשני ואלה שבאזורי הגידול (שאינו פולש) מרובדת.
איור 1. סכמטי וייצוגים מצולמים של מודל organotypic. תאי CRC הם זורעים על שכבת סטרומה סינתטית המכילה fibroblasts ורכיבי מטריצה תאיים חיוניים. תאים הם שיתוף תרבותיים בממשק אוויר נוזלי נוצר על ידי הרמת ג'ל organotypic על גבי רשת נירוסטה סטרילית. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
.. איור 2 LMD של תאי SW480 CRC הפולשים stroma organotypic cresyl יולט משמש כדי להדגיש תאי האפיתל CRC (); לאחר מכן איי גידול פולשני מוגדרים (ב); לפני נתיחת הלייזר מתרחשת (C) והחתיכה לחתוך מועברת למכשיר אוסף (ד '). תאים שאינם פולשים ותאי סטרומה מזוהים ומבודדים באמצעות אותן השיטות.w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
נתוני microarray microRNA. מערכים נסרקו באמצעות סורק 3.0.5 Pro GenePix לזהות Cy5 באורך גל של 635 ננומטר איור 3.. עוצמות ניאון ממוצעת היו מנורמלות ויחסי ביטוי מחושבים בין לייזר microdissected תאים פולשניים שוליים CRC ותאי CRC שוליים לא פולשנית בשכבות אפיתל מרובדת. הנתונים מוינו על ידי שינוי קיפול וערכי נתונים + / - 2 שינוי קיפול מניסוי נציג מוצגים מראה ההפרש ביטוי גני מירנה בין תאי מרווח פולשנית ותאי שוליים לא פולשנית. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים שיטה לבודד באופן ספציפי ולאפיין תאים סרטניים אשר רכשו את היכולת לפלוש stroma הקשורים לסרטן בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות גרורתי במבנה תרבות משותפת 3 ממדים של תאי אפיתל וסטרומה.
מודלים שיתוף התרבות מורכבים מתאי אפיתל CRC זה לצד זה עם stroma סינטטי המכיל vivo לשעבר fibroblasts מעי הגס האנושי שימשו ללמוד פלישת CRC ב 3 ממדים. מערכת רלוונטית מבחינה פיזיולוגית זה שמחק בתנאי vivo יכול להיות מותאמת לתרחישי סרטן אחרים על ידי החלפת תאים באפיתל ובניית stroma באמצעות fibroblasts vivo לשעבר ממוצא אנטומיים שונים. מגבלה אחת של גישה זו היא פשטנית של תא סטרומה באמצעות תאי פיברובלסטים בלבד, כstroma הגס in vivo הוא רקמה מורכבת ודינמית עם cel משתנהמרכיבי ליטר. דוגמא אחת היא נגזר תאים חיסוניים, אשר נמצאים בכמות משמעותית בחומר גידול ראשוני, אך נעדרו ממודל זה. למרות זאת, שחזור אמין של מודל זה בשילוב עם הקלות שבה מרכיבי התא ניתן להשפיע באופן ניסיוני (למשל על ידי על ביטוי או מציאה של גנים בודדים בתאי אפיתל וסטרומה), להפוך את זה למודל יקר וחסכוני בהשוואה לקונבנציונלי בניסויים vivo.
בכתב היד הזה אנחנו גם הראינו כי תאי CRC בחזית פולשנית הגידול במערכת מודל זה להביע את פרופילי ביטוי מירנה שונים לתאים זהים לא בחזית פולשנית וממוקמים בשכבות אפיתל מרובדת. זה מייצג הוכחה של מושג כי רקמת microdissected לייזר ממודלי שיתוף התרבות organotypic היא גישה בתוקף ללמוד תהליכים בשלב מוקדמים של גרורות. התמקדותומחדש היה אך ורק על ביטוי מירנה, מאז miRNAs מאוד הם מעורבים בפתוגנזה של גידולים ממאירים רבים ושוחרר ביטוי הן באפיתל ותאי סטרומה סרטן הקשורים השלכות חשובות בCRC 2,3,5. יתר על כן miRNAs יציב למיצוי וניתוח מרקמות מוטבעת פרפין קונבנציונלי ארכיונים קבוע פורמלין, מה שהופך אותם סמנים ביולוגיים רבי עוצמה לאבחון ונבוי על הרקמה אנושית נתון לעיבוד קונבנציונלי במעבדות histopathological שגרתיות 9,10. עם זאת, המתודולוגיה שלנו יכולה מאוד בקלות להיות מותאמת לניתוח גנומי וproteomic, תוך שימת דגש על הרבגוניות של גישה זו עוד יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לחשוף שום פוטנציאל לניגודי עניינים.
Acknowledgments
MB נתמך על ידי מימון מענק ממלגת MRC. KP וAHM נתמכים על ידי מימון מענק ממחקר רפואי וסקס וחקר הסרטן בבריטניה / RCS (אנגליה) (C28503/A10013). אנו אסירי תודה על התמיכה של אוניברסיטת סאות'המפטון היסטוכימיה יחידת מחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al. miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance. Cancer Res. , (2013).
- Bullock, M. D., et al. Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression. Cell Death Dis. 20 (4), (2013).
- Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. Measuring invasion in an organotypic model. Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).
- De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth. Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).
- Fries, K. M., et al. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).
- Moutasim, K. A., et al. Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis. J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).
- Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).
- Li, J., et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells. BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).
- Szafranska, A. E., et al. Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling. J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).
