Summary
सिंथेटिक, ऊतक इंजीनियर कोलोरेक्टल कैंसर मॉडल से लेजर microdissected कोशिकाओं और स्ट्रोमा की आणविक रूपरेखा आक्रामक सामने और कैंसर जुड़े stromal कोशिकाओं में ट्यूमर कोशिकाओं के बीच इंटरफेस में विशिष्ट जीव विज्ञान विशेषताएँ और काटना एक उपन्यास और manipulatable दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है.
Abstract
कोलोरेक्टल कैंसर हमलावर (सीआरसी) कोशिकाओं, उनकी बहन कोशिकाओं से मुक्त तोड़ने स्ट्रोमा घुसपैठ, और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) फिर से तैयार करने की क्षमता हासिल कर ली है. कोशिकाओं के इस phenotypically अलग समूह के जीव विज्ञान निस्र्पक काफी metastatic झरना के दौरान प्रारंभिक घटनाओं के बारे में हमारी समझ को बेहतर बना सकते हैं.
ट्यूमर आक्रमण घातक उपकला और कैंसर जुड़े स्ट्रोमा के बीच द्विदिश बातचीत से मदद की एक गतिशील प्रक्रिया है. हम सह संस्कृति और लेजर सूक्ष्म विच्छेदन तकनीक organotypic संयुक्त है ट्यूमर स्ट्रोमा इंटरफ़ेस में सेल विशिष्ट प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए आदेश में.
ऐसे fibroblasts के रूप में महत्वपूर्ण स्ट्रोमल घटक 3 dimentioanally कैंसर उपकला कोशिकाओं के साथ सह सुसंस्कृत, जिसमें Organotypic मॉडल, के पास पीएच में अध्ययन किया जा आक्रमण और कैंसर से स्ट्रोमा बातचीत सक्षम है जो अत्यधिक manipulatable प्रयोगात्मक उपकरण हैंysiological शर्तों.
लेजर MICRODISSECTION (LMD) माइक्रोन स्तर परिशुद्धता के साथ ट्यूमर के ऊतक के भीतर विभिन्न तबके की शल्य विच्छेदन और निकासी, जरूरत पर जोर देता है जो एक तकनीक है.
जीनोमिक transcriptomic और epigenetic रूपरेखा के साथ इन तकनीकों के संयोजन से हम ट्यूमर कोशिकाओं पर हमला और stromal ऊतकों आसपास के आणविक विशेषताओं का एक गहरी समझ विकसित करने, और ऐसा करने में संभावित उपन्यास बायोमार्कर और सीआरसी में नशीली दवाओं के विकास के लिए अवसरों प्रकट करना है.
Introduction
Organotypic सह संस्कृतियों जो आवश्यक बाह्य मैट्रिक्स घटकों 1-3 से युक्त एक कोलेजन जेल में घातक उपकला कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं juxtaposing द्वारा 3 आयामों में vivo में ट्यूमर microenvironment के पुनर्निर्माण में सहायता ऊतक इंजीनियर मॉडल हैं. मुख्यतः ट्यूमर आक्रमण को मापने की विधि के रूप में कल्पना की, organotypics में विवो पशु मॉडल पर निर्भरता को कम करने, और इस तरह के हमलावर कोशिकाओं एक मोनो छितरी राज्य 2-4 में कृत्रिम रूप से मजबूर कर रहे हैं जिसमें Transwell assays, के रूप में अन्य में इन विट्रो तकनीक की कमियों से बचने. ऐसे fibroblasts के रूप में इन मॉडलों में stromal कोशिकाओं के शामिल किए जाने,, घातक आक्रमण और मेटास्टेसिस 3-4 विनियमित करने में ट्यूमर microenvironment की अनिवार्य भूमिका को दर्शाता है, हालांकि स्ट्रोमा की प्ररूपी विविधता ऐसी है कि organotypic की शारीरिक प्रासंगिकता को अधिकतम करने के क्रम में मॉडल, अंग विशिष्ट, anatomically सही पूर्व vivoजहाँ भी संभव 3,6 fibroblasts शामिल किया जाना चाहिए.
Organotypics ट्यूमर और stromal कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी मंच हैं और तेजी से रासायनिक inhibitors का ट्यूमर आक्रमण पर प्रभाव और लक्षित जीन परिवर्तन 7,8 जांच करने के लिए उपन्यास मायनों में उपयोग किया जाता है. आक्रामक ट्यूमर मार्जिन का अध्ययन करने के लिए एक विशेष रूप से रोमांचक संभावना है. Organotypic मॉडल में, स्थापित कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) सेल लाइनों आम तौर पर एक अच्छी तरह से स्तरीकृत उपकला परत का उत्पादन, और पार अनुभाग में, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) पर आक्रमण करने की क्षमता हासिल कर ली है कि कोशिकाओं को आसानी से साफ़ कर रहे हैं. लेजर microdissection का उपयोग और अलगाव में उन्हें अध्ययन कर इन कोशिकाओं को निकालने ट्यूमर और vivo में ट्यूमर जुड़े stromal कोशिकाओं की स्थापना की सूक्ष्म स्थलाकृतिक विविधता, के प्रकाश में, कोलोरेक्टल कैंसर मेटास्टेसिस के मूल के बारे में महत्वपूर्ण जैविक अंतर्दृष्टि प्रकट हो सकता है और यह कैसे और अधिक कुशलता से किया जा सकता है को निशाना बनाया. मैंn निम्नलिखित पद्धति, ऊतक सूचित सहमति लिखा प्रदान के नमूने, और अध्ययन का दान सभी रोगियों को जो क्षेत्रीय अनुसंधान आचार समिति संस्थानों द्वारा अनुमोदित किया गया था.
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Protocol
Colonic explants से प्राथमिक Fibroblast संस्कृतियों का 1. स्थापना
- सीधे सर्जिकल ऑपरेशन थियेटर से सामान्य मानव पेट के म्यूकोसा ऊतक के नमूने प्राप्त, और 7-10 में निलंबित पीबीएस के एमएल 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और / एमएल Fungizone 0.25 ग्राम के साथ पूरक.
- प्रयोगशाला में, एक 10 सेमी टिशू कल्चर डिश के केंद्र में नमूना जगह और पीबीएस / पेन स्ट्रेप / Fungizone साथ 3 बार धोएं. अंतिम धोने के बाद महाप्राण मत करो.
- बाँझ संदंश और स्केलपेल के साथ, (लगभग 2mm) छोटे टुकड़ों में ऊतक में कटौती और एक 12 अच्छी तरह से थाली में स्केलपेल ब्लेड के साथ तैयार की एक क्रॉस के केंद्र में प्रत्येक टुकड़ा रखें. यह पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए ऊतक पर धीरे स्केलपेल रॉक.
- संस्कृति 750 μl में नमूनों प्राथमिक fibroblast वृद्धि मीडिया subme चाहिए, जो (DMEM 20% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन और 292 माइक्रोग्राम / एमएल एल Glutamine के साथ पूरक)फ्लोट करने के लिए इसे सक्रिय करने के बिना ऊतक rge. हर 2 दिनों फिर से फीड को छोड़कर अगले 5 दिनों में थाली परेशान करने से बचें.
- अगले 5 दिनों में fibroblasts धीरे धीरे ऊतक के किनारे से बाहर हो जाना शुरू कर देंगे. लगभग 7 दिनों में, यह अधिक दिखाई जाएगी. बाहर से बढ़ पर्याप्त fibroblasts अगर वहाँ के बाद लगभग 3-4 सप्ताह, और, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 750 μl trypsin जोड़ें. कोशिकाओं को एक टी 25 टिशू कल्चर फ्लास्क, पूल और हस्तांतरण (5-10 मिनट का समय लग सकता है) अलग कर लेने के बाद.
2. Organotypic तैयारी
Fibroblast गर्भवती organotypic जेल की तैयारी:
- 10% FCS और 292 माइक्रोग्राम / एमएल एल Glutamine के साथ पूरक DMEM में organotypic प्रति 5 एक्स 10 5 कोशिकाओं से युक्त एक fibroblast सेल निलंबन तैयार करें.
- निम्न अनुपात में, बर्फ पर organotypic जैल के लिए:
- चूहे की पूंछ कोलेजन के 7 संस्करणों: Matrigel मिश्रण (1:1)
- फ़िल्टर्ड 10x DMEM के 1 मात्रा
- एफसीएस की 1 मात्रा
- 5 एक्स 10 5 fibroblasts युक्त fibroblast सेल निलंबन की 1 मात्रा
9 जैल (जेल प्रति 1 मिलीलीटर) के लिए 10 मिलीलीटर की तैयारी और बुलबुले से बचने के लिए धीरे मिश्रण.
- 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ें और 37 पर 1 घंटे के लिए सेते जैल स्थापित करने के लिए अनुमति देने के लिए एक humidified वातावरण में सी °. 1 घंटा बाद जैल के शीर्ष पर 1 मिलीलीटर DMEM (10% एफसीएस) / भरमार जोड़ने के लिए और रातोंरात इनक्यूबेटर पर लौटें.
- अगले दिन, जैल और 5 एक्स 5 10 सीआरसी उपकला कोशिकाओं से युक्त मीडिया की थाली 1ml के ऊपर से महाप्राण मध्यम.
जेल लेपित नायलॉन शीट की तैयारी:
- , 1.5 सेमी को मापने autoclaved नायलॉन शीट अग्रिम में, 1.5 सेमी बाँझ x तैयार करते हैं.
- बाँझ संदंश का प्रयोग, एक 10 सेमी संस्कृति डिश (आमतौर पर 4 नायलॉन शीट पकवान प्रति शामिल किया जा सकता है) में नायलॉन शीट की अपेक्षित संख्या जगह है.
- इस क्रम में बर्फ पर जेल को बनाओ (250 μl कुलमात्रा) नायलॉन प्रति पत्रक की जरूरत है:
- चूहे की पूंछ कोलेजन के 7 संस्करणों
- फ़िल्टर्ड 10x DMEM के 1 मात्रा
- एफसीएस की 1 मात्रा
- 1 DMEM की मात्रा 10% FCS / भरमार
- समाधान पीला है, तो समाधान गुलाबी हो जाता है जब तक 50 μl aliquots में 0.1 एम NaOH जोड़कर बेअसर.
- प्रत्येक नायलॉन शीट को इस समाधान के 250 μl जोड़ें और 37 पर सेते डिग्री सेल्सियस जेल स्थापित करने के लिए अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में.
- पीबीएस में 1% glutaraldehyde समाधान अप करें. जेल की स्थापना की है एक बार हर 10 सेमी संस्कृति डिश के लिए 10 मिलीलीटर जोड़ें और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- धो नायलॉन शीट पीबीएस और DMEM में 1x (10% एफसीएस) / ग्लू में 3 x और 4 डिग्री सेल्सियस पर DMEM / ग्लू में रातोंरात सेते
आक्रमण के लिए स्टील ग्रिड पर organotypic जैल स्थापना:
- एक तिपाई गठन में स्टेनलेस स्टील शीट तह द्वारा मचान ग्रिड पूर्व तैयार करते हैं. उपयोग करने से पहले आटोक्लेव.
- एक छह अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में एक स्टील ग्रिड स्थान के लिए इथेनॉल में निष्फल संदंश का प्रयोग करें.
- प्रत्येक ग्रिड पर, ऊपरवाला कोलेजन पक्ष के साथ एक जेल में लिपटे नायलॉन शीट रखें.
- ध्यान से इथेनॉल में निष्फल एक रंग का उपयोग उठाया नायलॉन शीट को 24 अच्छी तरह से थाली से organotypic जैल हस्तांतरण.
- नायलॉन शीट माध्यम के साथ संपर्क में है लेकिन जलमग्न नहीं जब तक 10% FCS साथ पूरक DMEM 10% FCS / भरमार के साथ अच्छी तरह से भरें. मध्यम organotypic जेल स्पर्श नहीं करता है सुनिश्चित करें.
- हर 2 दिनों मीडिया की जगह, 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 14 दिनों के लिए सेते हैं.
3. Organotypic फिक्सेशन
- अच्छी तरह से नायलॉन शीट सहित पूरे organotypic निकालें और फिल्म चिपटना पर जगह है.
- Organotypic और एक स्वच्छ डिस्पोजेबल स्केलपेल का उपयोग नायलॉन शीट द्विविभाजित और कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए formaldehyde में दोनों हिस्सों को ठीक.
- 70% एतान साथ formaldehyde बदलेंराजभाषा 24 घंटे के बाद और पहले, आयल में एम्बेड सेक्शनिंग, और धुंधला करने के लिए रात भर छोड़ दें.
आक्रामक मार्जिन के 4. लेजर Microdissection
- झिल्ली पर 10 माइक्रोन मोटाई को धारा स्लाइड मुहिम शुरू की.
- 1 मिनट के लिए xylene लगाने से Deparaffinize वर्गों, तो एक और 1 मिनट के लिए xylene हटाने और 75% इथेनॉल में तय कर लो.
- 1 मिनट के लिए 0.125% cresyl बैंगनी समाधान के साथ इथेनॉल और दाग को दूर. Cresyl बैंगनी उपकला कोशिकाओं पर प्रकाश डाला गया और स्ट्रोमा से आसान भेदभाव परमिट.
- Cresyl बैंगनी निकालें और 100% इथेनॉल के साथ rinsing से पहले एक और 1 मिनट के लिए 100% इथेनॉल लागू होते हैं. 30 मिनट के लिए शुष्क हवा की स्लाइड की अनुमति दें.
- चुने हुए मंच (जैसे Leica के रूप में सिस्टम) का उपयोग कर लेजर microdissection आचरण.
- खुर्दबीन मंच पर चेहरा नीचे microdissected होने के लिए दाग अनुभाग के साथ कांच स्लाइड रखें.
- संग्रह कैसेट में एक 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब माउंट और 50 μl का जोड़microdissected ऊतक एकत्रित करेगा जिसमें टोपी को सेल lysis बफर (जैसे डीएनए, आरएनए या प्रोटीन lysis बफर).
- प्रत्यक्ष दृष्टि के तहत, ब्याज के ऊतकों की पहचान करने के लिए जॉयस्टिक का उपयोग, और सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस का उपयोग कर, ट्यूमर आक्रमण मोर्चे पर microdissected किया जा कोशिकाओं पर प्रकाश डाला, दाग जैविक अनुभाग व्याख्या.
- पर प्रकाश डाला अनुभाग बाहर कटौती करनी चाहिए, जो दोनों आग में लेजर, शिक्षा और microcentrifuge ट्यूब की टोपी में microdissected ऊतक में वृद्धि.
- एक बार जब पर्याप्त सामग्री एकत्र की गई है, संग्रह कैसेट बेदखल microcentrifuge ट्यूब बंद करने और ट्यूब के नीचे करने के लिए lysis बफर आकर्षित करने के लिए धीरे स्पिन.
- Microdissection पूरा हो गया है जब तक बर्फ पर नमूने रखें. एक उचित विधि द्वारा प्रक्रिया के नमूने ब्याज की analyte निकालने के लिए.
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Representative Results
हम सीआरसी सेल लाइनों और stromal कोशिकाओं के कई संयोजनों को उपरोक्त विधि आवेदन किया है. यहाँ प्रस्तुत एक उदाहरण प्राथमिक मानव पूर्व vivo colonic fibroblasts के साथ SW480 उपकला सीआरसी सेल लाइनों है. 3 आयामी सह संस्कृतियों आक्रामक ट्यूमर मोर्चे पर कोशिकाओं के बीच विभिन्न व्यक्त miRNAs की तुलना के लिए माइक्रोस्कोपी और लेजर कब्जा MICRODISSECTION (चित्रा 2) के अधीन चित्रा (1), निर्माण, और microRNA (miRNA) की रूपरेखा (चित्रा 3) से विश्लेषण कर रहे हैं और स्तरीकृत (गैर हमलावर) ट्यूमर क्षेत्रों में उन.
चित्रा 1. योजनाबद्ध और organotypic मॉडल की फोटो अभ्यावेदन. सीआरसी कोशिकाओं से युक्त एक सिंथेटिक stromal परत पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं fibroblasts और आवश्यक बाह्य मैट्रिक्स घटकों. कोशिकाओं एक बाँझ स्टेनलेस स्टील ग्रिड पर organotypic जेल को ऊपर उठाने के द्वारा बनाई गई एक एयर तरल इंटरफेस में सह सुसंस्कृत हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
.. Organotypic स्ट्रोमा हमलावर SW480 सीआरसी कोशिकाओं के चित्रा 2 LMD cresyl बैंगनी सीआरसी उपकला कोशिकाओं (ए) को उजागर करने के लिए प्रयोग किया जाता है; आक्रामक ट्यूमर द्वीपों तो (बी) में परिभाषित कर रहे हैं; लेजर विच्छेदन (सी) होता है और कटौती टुकड़ा एक संग्रह डिवाइस (डी) के लिए ले जाया जाता है पहले. गैर हमलावर कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं की पहचान की है और एक ही पद्धति का उपयोग कर अलग कर रहे हैं.w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. MicroRNA माइक्रोएरे डेटा. सारणियों 635 एनएम के तरंग दैर्ध्य में Cy5 पता लगाने के लिए एक GenePix प्रो 3.0.5 स्कैनर का उपयोग कर स्कैन किया गया. मीन फ्लोरोसेंट तीव्रता सामान्यीकृत थे और लेजर के बीच गणना की अभिव्यक्ति अनुपात स्तरीकृत उपकला परतों में आक्रामक मार्जिन सीआरसी कोशिकाओं और गैर इनवेसिव मार्जिन सीआरसी कोशिकाओं microdissected. आक्रामक मार्जिन कोशिकाओं और गैर इनवेसिव मार्जिन कोशिकाओं के बीच अंतर miRNA जीन अभिव्यक्ति दिखा प्रस्तुत कर रहे हैं एक प्रतिनिधि प्रयोग से 2 गुना परिवर्तन - डेटा गुना परिवर्तन और डेटा मान + / द्वारा क्रमबद्ध किया गया था. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
यहाँ हम विशेष रूप से अलग और उपकला और stromal कोशिकाओं का एक 3 आयामी सह संस्कृति निर्माण में metastatic प्रगति के प्रारंभिक चरणों के दौरान कैंसर जुड़े स्ट्रोमा पर आक्रमण करने की क्षमता हासिल कर ली है, जो ट्यूमर कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए एक विधि का वर्णन.
पूर्व vivo मानव colonic fibroblasts युक्त सिंथेटिक स्ट्रोमा साथ juxtaposed सीआरसी उपकला कोशिकाओं के शामिल सह संस्कृति मॉडल 3 आयामों में सीआरसी आक्रमण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. Vivo परिस्थितियों में mimics उपकला में कोशिकाओं प्रतिस्थापन और विभिन्न संरचनात्मक मूल के पूर्व vivo fibroblasts का उपयोग स्ट्रोमा के निर्माण से अन्य कैंसर परिदृश्यों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो इस physiologically प्रासंगिक प्रणाली. Vivo में colonic स्ट्रोमा अलग सेल के साथ एक जटिल और गतिशील ऊतक है के रूप में इस दृष्टिकोण की एक सीमा है, केवल fibroblast कोशिकाओं का उपयोग कर stromal डिब्बे का अति सरलीकरण हैएल घटक. एक उदाहरण प्राथमिक ट्यूमर सामग्री में काफी मात्रा में मौजूद है, लेकिन इस मॉडल से अनुपस्थित रहे हैं, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं व्युत्पन्न है. इस के बावजूद, आसानी के साथ मिलकर इस मॉडल की विश्वसनीय reproducibility के साथ जो सेल घटक प्रयोगात्मक (उपकला और stromal डिब्बों में व्यक्तिगत जीनों की अभिव्यक्ति या पछाड़ना अधिक से उदाहरण के लिए) चालाकी से किया जा सकता है, यह एक मूल्यवान और लागत प्रभावी मॉडल की तुलना करना विवो प्रयोग में पारंपरिक करने के लिए.
इस पांडुलिपि में हम भी इस मॉडल प्रणाली में ट्यूमर आक्रामक मोर्चे पर सीआरसी कोशिकाओं आक्रामक मोर्चे पर समान कोशिकाओं को अलग miRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल नहीं व्यक्त और स्तरीकृत उपकला परतों में स्थित है कि प्रदर्शन किया. इस organotypic सह संस्कृति मॉडल से लेजर microdissected ऊतक मेटास्टेसिस में जल्दी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक वैध तरीका है कि अवधारणा के एक सबूत का प्रतिनिधित्व करता है. फोकस वहपुन miRNAs दृढ़ता से कई दुर्दमताओं के रोगजनन में फंसा रहे हैं के बाद से, miRNA अभिव्यक्ति पर विशेष रूप से किया गया था और उपकला में और कैंसर जुड़े stromal कोशिकाओं सीआरसी 2,3,5 में महत्वपूर्ण परिणाम हो दोनों अभिव्यक्ति अविनियमित. इसके अलावा miRNAs उन्हें दिनचर्या histopathological प्रयोगशालाओं 9,10 में पारंपरिक प्रसंस्करण के अधीन मानव ऊतक पर निदान और भविष्यवाणी के लिए शक्तिशाली बायोमार्कर बनाने, पारंपरिक अभिलेखीय formalin-तय आयल एम्बेडेड ऊतक से निष्कर्षण और विश्लेषण करने के लिए स्थिर रहे हैं. हालांकि, हमारी पद्धति बहुत आसानी से आगे इस दृष्टिकोण की चंचलता पर बल जीनोमिक और प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखक ब्याज की कोई संभावित संघर्ष का खुलासा.
Acknowledgments
एमबी एक एमआरसी फैलोशिप से अनुदान धन के द्वारा समर्थित है. केपी और AHM वेसेक्स मेडिकल रिसर्च और कैंसर रिसर्च यूके / आरसीएस (इंग्लैंड) (C28503/A10013) से अनुदान धन से समर्थन कर रहे हैं. हम साउथेम्प्टन ऊतकरसायनविज्ञान रिसर्च यूनिट के विश्वविद्यालय के समर्थन के लिए आभारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
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