Summary
Молекулярная профилирования лазерных микродиссекции клеток и стромы из синтетических, тканевой инженерии моделей колоректального рака представляет собой новый и которыми можно манипулировать подход характеризовать и анализировать отличительные биологии на границе раздела между опухолевых клеток в передней и инвазивного рака связаны стромальных клеток.
Abstract
Вторжение колоректального рака (CRC) клетки приобрели способность освободиться от своих сестринских клеток, проникнуть стромы и реконструировать внеклеточный матрикс (ECM). Характеризуя биологии этого фенотипически отдельной группы клеток могут существенно улучшить наше понимание ранних событий в течение метастатического каскада.
Опухоль вторжение представляет собой динамический процесс облегчается двунаправленного взаимодействия между злокачественной эпителия и рака связаны стромы. С целью изучения клеточно-специфической реакции в строме опухолевой-интерфейса мы сочетании Органотипической совместное культивирование и лазерные методы микро-рассечение.
Органотипической модели, в которых ключевые стромальных составляющие, такие как фибробласты 3-dimentioanally совместном культивировании с раковыми эпителиальных клеток, весьма, которыми можно манипулировать экспериментальные инструменты, которые позволяют вторжение и рак-стромы взаимодействия, чтобы быть изучены в ближайшем телysiological условия.
Лазерная микродиссекции (РМР) представляет собой метод, который влечет за собой хирургическое вскрытие и извлечение различных слоев в опухолевой ткани, с точностью уровня микрон.
Комбинируя эти методы с геномной, транскриптомных и эпигенетической профилирования мы стремимся развивать более глубокое понимание молекулярных характеристик вторжения опухолевые клетки и окружающие стромальную ткань, и при этом потенциально выявить новые биомаркеры и возможности для разработки лекарств в КПР.
Introduction
Органотипической со-культуры являются тканевой инженерии модели, которые помогают в восстановлении в естественных условиях опухоли микроокружения в 3 измерениях путем сопоставления злокачественные эпителиальные клетки и стромальные клетки в коллагенового геля, содержащей существенные компоненты внеклеточного матрикса 1-3. В принципе задумана как метод измерения опухолевой инвазии, organotypics уменьшить зависимость от ин виво животных моделях, и избежать недостатков других методов в пробирке, таких как Transwell анализов, в которых вторжение клетки вынуждены искусственно в монодисперсные состоянии 2-4. Включение стромальных клеток в этих моделях, таких как фибробласты, отражает важную роль микросреды опухоли в регулировании злокачественной инвазии и метастазирования 3-4, однако фенотипическая гетерогенность стромы такова, что в целях обеспечения максимальной физиологическое значение Органотипической модели, определенный орган, анатомически точны экс естественныхфибробласты должны быть включены по мере возможности 3,6.
Organotypics являются универсальной платформой для изучения взаимодействия между опухолью и стромальных клеток и все чаще используются в новых способов для изучения влияния на опухолевой инвазии химических ингибиторов и целевых изменения гена 7,8. Изучая инвазивной запас опухоли является особенно захватывающая перспектива. В органотипических моделей, созданная колоректальный рак (CRC) клеточные линии, как правило, производят также стратифицированную эпителиального слоя, и в поперечном сечении, клетки, которые приобрели способность вторгаться внеклеточный матрикс (ECM) легко различимы. В свете сложившейся микро-топографической неоднородностью опухоли и опухоли связано стромальных клеток в естественных условиях, извлечение этих клеток с помощью лазерного микродиссекции и изучение их в изоляции, может выявить важные биологические идеи относительно истоков колоректального метастазов рака и как это может быть более эффективно целенаправленными. Ян следующая методология, все пациенты, которые пожертвовали образцы ткани было получено письменное информированное согласие, а исследование было одобрено учреждений региональных исследовательских комитет по этике.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Установление первичной культуры фибробластов из толстой эксплантов
- Получение образцов нормальной слизистой оболочки толстой кишки человека ткани непосредственно из хирургической операционной, и приостановить в 7-10 мл ФСБ с добавлением 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,25 мкг / мл Fungizone.
- В лаборатории, поместите образец в центре 10-см блюдо культуры ткани и промыть 3 раза с PBS / Пен-острый / Fungizone. Не аспирации после последней промывки.
- С стерильным пинцетом и скальпелем, разрезал ткань на мелкие кусочки (примерно 2 мм) и поместите каждую часть в центре креста, проведенной с лезвием скальпеля в 12-луночный планшет. Rock скальпель мягко по ткани, чтобы позволить ему придерживаться.
- Культура образцы в 750 мкл первичного медиа роста фибробластов (DMEM, дополненной 20% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 100 Е / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 292 мкг / мл L-глутамина), который должен submeRGE ткани без включения его плавать. Избегайте нарушая пластину в течение следующих 5 дней, за исключением вновь корма каждые 2 дня.
- В течение следующих 5 дней фибробласты будет медленно начинают расти из края ткани. Примерно в 7 дней, это будет более заметным. Примерно через 3-4 недели, а при наличии достаточных фибробласты, растущие из, добавить 750 мкл трипсина в каждую лунку. После клетки отдельно (это может занять 5-10 минут), бассейн и передачи в культуре ткани колбу Т-25.
2. Органотипической Подготовка
Подготовка фибробластов пропитанные органотипической геля:
- Подготовка фибробластов клеточной суспензии, содержащей 5 × 10 5 клеток на Органотипической в DMEM с добавлением 10% FCS и 292 мкг / мл L-глутамина.
- Составляют органотипической гели на льду, в следующих соотношениях:
- 7 объемов Rat-Хвост коллагена: Матригель смесь (1:1)
- 1 объем отфильтрованной 10x DMEM
- 1 объем ФТС
- 1 объем суспензии клеток фибробластов, содержащей 5 х 10 5 фибробласты
За 9 гелей (1 мл на гель) подготовить 10 мл и аккуратно перемешать, чтобы избежать пузырей.
- Добавить 1 мл в каждую лунку 24-луночного планшета и инкубировать 1 час при 37 ° С в увлажненной атмосфере, чтобы позволить гели для установки. Через 1 час добавляют 1 мл DMEM (10% FCS) / GLUT в верхней части гели и возвращают в инкубатор на ночь.
- На следующий день аспирации среды из верхней части гели и пластины 1 мл среды, содержащей 5 × 10 5 CRC эпителиальные клетки.
Подготовка геля покрытием нейлона листов:
- Приготовьтесь стерильные, автоклавного нейлоновые листы измерительные 1,5 см х 1,5 см, заранее.
- Использование стерильного пинцета, поместить необходимое количество нейлоновых листов в 10 см блюдо культуры (обычно 4 нейлоновые листы могут быть размещены за блюдо).
- Макияж гель на льду в следующем порядке (250 всего мклОбъем требуется на нейлоновой листа):
- 7 объемы Rat-Хвост коллагена
- 1 объем отфильтрованной 10x DMEM
- 1 объем ФТС
- 1 объем DMEM 10% FCS / Перенасыщение
- Если раствор желтого цвета, нейтрализовать добавлением 0,1 М NaOH в 50 мкл аликвоты, пока раствор не станет розовым.
- Добавить 250 мкл этого раствора в каждую из нейлона листа и инкубируют при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 в течение 30 мин, чтобы позволить гель для установки.
- Макияж 1%-ный раствор глютаральдегида в PBS. Добавьте 10 мл на каждый 10 см чашки для культивирования после того, как гель установил и инкубируют при 4 ° С в течение 1 часа.
- Нейлоновые листы Вымойте 3x в PBS и 1x в DMEM (10% FCS) / Glu и инкубировать в течение ночи в DMEM / Glu при 4 ° С.
Повышение органотипической гели на стальные сеток для вторжения:
- Предварительная подготовка строительных лесов сетки путем складывания из нержавеющей стали листы в пласт штатива. Автоклав перед использованием.
- С помощью пинцета стерилизованные в этаноле разместить стальную сетку в каждую лунку луночного планшета шесть.
- Поставьте нейлона лист гель покрытием с коллагеновой стороной вверх, на каждой сетке.
- Тщательно передать органотипической гели от пластины 24-а в нейлоновой листа повышенной помощью шпателя стерилизованное в этаноле.
- Заполните скважины с DMEM 10% FCS / Glut с добавлением 10% FCS, пока нейлон лист не находится в контакте со средой, но не погружен в воду. Убедитесь, что среда не прикасайтесь к органотипической гель.
- Инкубировать в течение 14 дней при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO 2, замену носителя каждые 2 дня.
3. Органотипической Фиксация
- Удалить всю Органотипической включая нейлона листа из хорошо и поместить на пищевой пленкой.
- Пополам Органотипической и нейлона лист, используя чистую одноразовую скальпель и исправить обе половинки в формальдегиде в течение 24 часов при комнатной температуре.
- Заменить формальдегид 70% Итаномол после 24 часов и оставить на ночь до внедрения в парафин, секционирования и окрашивания.
4. Лазерная микродиссекция из инвазивным маржи
- Раздел 10 мкм толщины на мембрану слайды.
- Deparaffinize секции, применяя ксилоле в течение 1 мин, а затем удалить ксилол и зафиксировать в 75%-ном этаноле в течение еще 1 мин.
- Удаление этанола и пятно с 0,125% раствора крезиловым фиолетовым в течение 1 мин. Крезил Фиолетовый подчеркивает эпителиальные клетки и позволяет легко с дискриминацией со стороны стромы.
- Удалить крезиловым фиолетовым и применить 100% этанола в течение 1 мин перед промывкой 100% этанола. Разрешить слайды высохнуть на воздухе в течение 30 мин.
- Проведение лазерного микродиссекции используя выбранную платформу (например, системы Leica AS).
- Поместите предметное стекло с окрашенных разделе должны быть микродиссекции лицом вниз на столик микроскопа.
- Установите на 0,5 трубки микроцентрифужных мл в кассету сбора и добавить 50 мклбуфера для лизиса клеток (например, ДНК, РНК или белок буфера для лизиса) с крышкой, в которую микродиссекции ткани будет собирать.
- Под контролем зрения с помощью джойстика для идентификации ткани интересов, и с помощью программного интерфейса, комментировать запятнанную органический раздел, выделяя ячейки, которые будут микродиссекции в опухолевой инвазии фронт.
- Поручить лазер, чтобы огонь, который должен как вырезать выделенную секцию и вывести микродиссекции ткани в крышке трубки микроцентрифужных.
- После того, как достаточное количество материала было собрано, извлечь кассету для сбора, закройте микроцентрифужную пробирку и осторожно вращать обратить буфере для лизиса на дне пробирки.
- Поместите образцы на льду до микродиссекции не будет завершена. Образцы процесс, с помощью соответствующего метода для извлечения интерес аналит.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы применили данный метод для нескольких комбинаций CRC клеточных линий и стромальных клеток. Одним из примеров, представленные здесь, SW480 эпителиальных CRC клеточные линии с первичными Экс Vivo толстой фибробластов человека. 3-мерные сокультурах построены (рис. 1), подвергают микроскопии и лазерного захвата микродиссекции (рис. 2), и анализировали с помощью микроРНК (микроРНК) профилирования (рис. 3) для сравнения разному экспрессируются микроРНК между клетками в инвазивной перед опухоли а те, в стратифицированных (не вторжение) опухолевых зон.
Рисунок 1. Схема и фотографические представления модели органотипической. CRC клетки высевают на слой синтетической стромы, содержащей фибробласты и эфирные компоненты внеклеточного матрикса. Клетки культивируют совместно на границе раздела воздух-жидкость, созданного путем повышения органотипической гель на стерильной нержавеющей стали сетки. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
.. Рисунок 2 LMD из SW480 CRC клеток, вторгающихся в органотипической стромы Крезил Фиолетовый используется для выделения CRC эпителиальные клетки (а); инвазивных опухолей островков затем определяется (B); до лазерного рассечения происходит (C) и отрезанный кусок транспортируется по сбору платежей устройства (D). Номера вторжение клетки и клетки стромы идентифицированы и выделены с использованием той же методологии.w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. МикроРНК микрочипов данных. Массивы были отсканированы с использованием GenePix Pro 3.0.5 сканер для обнаружения Cy5 на длине волны 635 нм. Средние люминесцентные интенсивности были нормализованы и отношения выражении вычисляемого между лазером микродиссекции инвазивных полей CRC клетки и неинвазивные полей CRC клетки в слоистых эпителиальных слоев. Данные были отсортированы по Сменить и значения данных + / - 2 смены раза от типичного эксперимента, показывающие перепад микроРНК экспрессии генов между инвазивных маржинальных клеток и неинвазивных маржинальных клеток. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем метод специально выделить и охарактеризовать опухолевые клетки, которые приобрели способность вторгаться в рака, связанного стромы на самых ранних стадиях метастатического прогрессирования в 3-мерном сокультуры конструкции эпителиальных и стромальных клеток.
Модели Сотрудничество культуры, состоящие из CRC эпителиальных клеток, расположенных рядом с синтетическим стромы, содержащей Экс Vivo толстой фибробласты человека были использованы для изучения CRC вторжение в 3 измерениях. Это физиологически актуальны система, которая имитирует в условиях естественных условиях могут быть адаптированы для других сценариев рака путем замены клеток в эпителии и построения стромы помощью Экс Vivo фибробласты различных анатомических происхождения. Одним из ограничений такого подхода является упрощение стромы отсека, подцепив только клетки фибробластов, как в естественных условиях толстой стромы является сложной и динамичной ткани с разной челл составляющие. Одним из примеров является клетки иммунной полученный, которые присутствуют в значительных количествах в первичного опухолевого материала, но отсутствует в этой модели. Несмотря на это, надежный воспроизводимость этой модели в сочетании с легкостью, с которой клеточные компоненты могут быть экспериментально манипулировать (например более чем на выражения или нокдаун отдельных генов в эпителиальных и стромальных отсеков), сделать это ценный и экономически эффективная модель сравнению с обычными в естественных условиях эксперимента.
В этой рукописи мы также показали, что CRC клетки в опухоли инвазивного фронта в этой модельной системы выражают различные профили экспрессии микроРНК в идентичных клеток не в инвазивной спереди и расположен в слоистых эпителиальных слоев. Это представляет собой доказательство концепции, что лазерная микродиссекции ткани из органотипических моделей совместного культивирования является действительным подход к изучению ранних процессов в метастазирования. В центре внимания онвновь был исключительно на выражение микроРНК, так как микроРНК сильно вовлечены в патогенез многочисленных злокачественных новообразований и дерегулирование выражение как в эпителиальных и рак связаны стромальных клеток имеют важные последствия в CRC 2,3,5. Кроме того микроРНК устойчивы к извлечения и анализа от обычного архивного формалином фиксированной парафин ткани, что делает их мощными биомаркеры для диагностики и прогнозирования на ткани человека, подвергнутого обычной обработке в обычных гистологических лабораторий 9,10. Тем не менее, наша методология может очень легко быть адаптирован для геномики и протеомики анализа, далее подчеркивая универсальность этого подхода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не раскрывают ни одного потенциального конфликта интересов.
Acknowledgments
МБ поддерживается грантового финансирования из общения MRC. КП и АНМ поддерживаются грантового финансирования из Уэссекса медицинских исследований и исследований рака Великобритании / RCS (Англия) (C28503/A10013). Мы благодарны за поддержку университета Саутгемптона гистохимия исследовательское подразделение.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al. miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance. Cancer Res. , (2013).
- Bullock, M. D., et al. Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression. Cell Death Dis. 20 (4), (2013).
- Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. Measuring invasion in an organotypic model. Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).
- De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth. Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).
- Fries, K. M., et al. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).
- Moutasim, K. A., et al. Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis. J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).
- Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).
- Li, J., et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells. BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).
- Szafranska, A. E., et al. Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling. J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).
