Summary
Molecular Profiling von Laser mikrodissektiert Zellen und Stroma aus synthetischen, Tissue-Engineering-Darmkrebs-Modelle stellt einen neuartigen Ansatz zur manipulierbaren und an der Schnittstelle zwischen Tumorzellen zu charakterisieren und zu sezieren die unverwechselbare Biologie an der invasiven Front und Krebs Stromazellen.
Abstract
Invasion Darmkrebs (CRC)-Zellen haben die Fähigkeit, aus ihrer Schwesterzellen zu befreien, das Stroma zu infiltrieren, und renovieren die extrazelluläre Matrix (ECM) erworben. Charakterisierung der Biologie dieser phänotypisch bestimmte Gruppe von Zellen könnte wesentlich unser Verständnis der frühen Ereignisse verbessern während der metastatischen Kaskade.
Tumorinvasion ist ein dynamischer Prozess, durch bidirektionale Interaktion zwischen dem Epithel und malignem Krebs Stroma erleichtert. Um Zell-spezifische Antworten auf den Tumor-Stroma-Schnittstelle haben wir organotypischen Kokultur und Laser Mikrodissektion Techniken kombiniert untersuchen.
Organotypische Modelle, in denen wichtige Bestandteile wie Stroma-Fibroblasten sind 3-dimentioanally co-kultiviert mit Krebs Epithelzellen, sind sehr manipulierbar experimentelle Werkzeuge, die Invasion und Krebs-Stroma-Interaktionen ermöglichen, in der Nähe von-ph studiert werdenysiological Bedingungen.
Laser Mikrodissektion (LMD) ist eine Technik, die die chirurgische Präparation und Extraktion der verschiedenen Schichten im Tumorgewebe, mit Mikrometer-Präzision Niveau bringt.
Durch die Kombination dieser Techniken mit genomischer, Transkriptom und epigenetische Profiling wollen wir zu einem tieferen Verständnis der molekularen Eigenschaften der Invasion von Tumorzellen und die umliegenden Stroma-Gewebe zu entwickeln, und dabei möglicherweise offenbaren neue Biomarker und Chancen für die Entwicklung von Medikamenten in CRC.
Introduction
Organotypische Co-Kulturen sind Tissue-Engineering-Modelle, die Hilfe bei der Rekonstruktion der in vivo Tumor-Mikroumgebung in drei Dimensionen durch Nebeneinander malignen Epithelzellen und Stromazellen in einem Kollagen-Gel, die wesentliche Komponenten der extrazellulären Matrix 3.1. Hauptsächlich als ein Verfahren zur Messung der Tumorinvasion konzipiert, organotypics die Abhängigkeit von in vivo-Tiermodellen, und vermeiden die Nachteile der anderen in vitro-Techniken, wie Transwell-Assays, bei dem eindringenden Zellen künstlich in einem monodispersen Zustand 2-4 gedrückt. Die Einbeziehung von Stromazellen in diesen Modellen, wie Fibroblasten, spiegelt die wesentliche Rolle der Tumor-Mikroumgebung bei der Regulierung der Invasion und Metastasierung maligner 3-4, jedoch ist die phänotypische Heterogenität des Stroma ist derart, dass, um die physiologische Relevanz der organotypischen maximieren Modelle, organspezifische, anatomisch genaue ex vivoFibroblasten aufgenommen werden sollten, wo immer möglich 3,6.
Organotypics sind eine vielseitige Plattform, um Interaktionen zwischen Tumor-und Stromazellen studieren und werden zunehmend in neue Wege, um die Auswirkungen auf die Tumor-Invasion von chemischen Inhibitoren und gezielten Genveränderungen 7,8 untersuchen eingesetzt. Das Studium der invasiven Tumorrand ist eine besonders aufregende Aussicht. In organotypischen Modellen etabliert Darmkrebs (CRC) Zelllinien in der Regel eine gut geschichtete Epithel, und im Querschnitt, Zellen, die die Fähigkeit, die extrazelluläre Matrix (ECM) eindringen erworben haben, sind leicht erkennbar. Angesichts der etablierten Mikro-topographische Heterogenität von Tumor-und Tumor-assoziierten Stroma-Zellen in vivo, Extrahieren, diese Zellen mit Laser-Mikrodissektion und studiert sie in Isolation, können wichtige biologische Erkenntnisse über die Entstehung von Darmkrebs Metastasen zeigen, und wie kann es effizienter sein richtet. Ichn die folgende Methode, alle Patienten, die Gewebeproben eine schriftliche Einverständniserklärung, und die Studie wurde gespendet von den Institutionen regionaler Forschungsethikkommission genehmigt.
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Protocol
1. Gründung der Primär Fibroblasten-Kulturen von Darm Explantate
- Erhalten Proben von normalem menschlichen Darmschleimhaut Gewebe direkt von der chirurgischen Operationssaal und Aussetzung in 7-10 ml PBS, ergänzt mit 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,25 &mgr; g / ml Fungizon.
- Im Labor stellen die Probe in der Mitte einer 10-cm-Gewebekulturschale und 3 x waschen mit PBS / Pen-Strep / Fungizone. Nach dem letzten Waschen saugen nicht.
- Mit einer sterilen Pinzette und Skalpell geschnitten das Gewebe in kleine Stücke (ca. 2 mm) und legen jedes Stück in der Mitte des Kreuzes mit dem Skalpell in einer 12-Well-Platte gezogen. Rock the Skalpell vorsichtig über das Gewebe, damit sie halten.
- Kultur die Proben in 750 ul primären Fibroblasten-Wachstumsmedium (DMEM, ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum (FCS), 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 292 ug / ml L-Glutamin), die subme sollterge das Gewebe ohne Aktivierung es zu schweben. Vermeiden Sie die Platte stören in den nächsten 5 Tagen außer neu Feed alle 2 Tage.
- Im Laufe der nächsten 5 Tage Fibroblasten langsam beginnen, von der Kante des Gewebes herauswachsen. Bei etwa 7 Tage, das mehr sichtbar sein. Nach ca. 3-4 Wochen, und wenn es genügend Fibroblasten wachsen aus, fügen Sie 750 ul Trypsin in jede Vertiefung. Nach Zellen abgelöst, Pool und in ein T-25-Zellkulturflasche (die 5-10 Minuten dauern kann).
2. Organotypische Vorbereitung
Vorbereitung der Fibroblasten-Gel imprägniert organotypischen:
- Vorbereitung einer Fibroblastenzellsuspension mit 5 x 10 5 Zellen pro organotypischen in DMEM mit 10% FCS und 292 ug / ml L-Glutamin ergänzt.
- Bilden die organotypischen Gele auf Eis, in den folgenden Verhältnissen:
- 7 Volumen Rattenschwanz Collagen: Matrigel-Mischung (1:1)
- 1 Volumen gefiltert 10x DMEM
- 1 Volumen FCS
- 1 Volumen der Fibroblasten-Zellsuspension mit 5 x 10 5 Fibroblasten
Für 9 Gele (1 ml pro Gel) 10 ml vorzubereiten und vorsichtig mischen, um Blasen zu vermeiden.
- 1 ml in jedes Well einer 24-Well-Platte und Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C in einer feuchten Atmosphäre zu ermöglichen Gele einzustellen. Nach 1 Stunde 1 ml DMEM (10% FCS) / Glut auf der Gele und zurück in den Inkubator über Nacht.
- Am folgenden Tag absaugen Medium von der Oberseite des Gels und der Platte 1 ml Medium, enthaltend 5 × 10 5 CRC Epithelzellen.
Herstellung von Gel-beschichteten Nylon Blätter:
- Bereiten steril, autoklavierbar Nylon Blätter Messung 1,5 cm x 1,5 cm, im Voraus.
- Mit einer sterilen Pinzette, legen Sie die gewünschte Anzahl der Blätter in einer Nylon 10 cm Kulturschale (in der Regel 4 Nylonblätter können pro Schale untergebracht werden).
- Make-up-Gel auf Eis in der folgenden Reihenfolge (250 ul GesamtNylon pro Blatt Volumen erforderlich):
- 7 Volumen Rattenschwanz Collagen
- 1 Volumen gefiltert 10x DMEM
- 1 Volumen FCS
- 1 Volumen DMEM 10% FCS / Glut
- Wenn die Lösung gelb, zu neutralisieren, indem 0,1 M NaOH in 50 &mgr; l Aliquots, bis die Lösung rosa.
- Add 250 ul dieser Lösung zu jeder Nylonfolie und bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 für 30 min, damit Gel einzustellen.
- Make-up 1% Glutaraldehyd-Lösung in PBS. 10 ml zu je 10 cm Kulturschale einmal das Gel gesetzt und Inkubation bei 4 ° C für 1 Stunde.
- Wasch Nylon Blätter 3x in PBS und 1 x in DMEM (10% FCS) / Glu beimpft und über Nacht in DMEM / Glu bei 4 ° C.
Raising organotypischen Gele auf Stahlgitter für die Invasion:
- Pre-Vorbereitung Gerüstnetze durch Falten Edelstahlbleche in einem Stativ Bildung. Autoklavieren vor der Verwendung.
- Verwenden einer Pinzette in Ethanol sterilisiert, um eine Stahl-Gitter in jede Vertiefung einer sechs Well-Platte zu platzieren.
- Legen Sie ein Gel-beschichteten Nylon-Blatt mit der Kollagen-Seite nach oben, auf jedes Netz.
- Organotypischen die Gele vorsichtig übertragen von der 24-Well-Platte in die erhöhte Nylon Blatt mit einem Spatel in Ethanol sterilisiert.
- Füllen Sie die gut mit DMEM 10% FCS / Glut mit 10% FCS, bis die Nylonfolie in Kontakt mit dem Medium, aber nicht unter Wasser. Stellen Sie sicher, dass das Medium nicht die organ Gel berühren.
- Inkubation für 14 Tage bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 ersetzt Medien alle 2 Tage.
3. Organotypische Fixation
- Entfernen ganzen organotypischen einschließlich Nylon Blatt von gut und setzen auf Frischhaltefolie.
- Halbierung organotypischen und Nylon-Blatt mit einem sauberen Einmalskalpell und fixieren beide Hälften in Formaldehyd für 24 Stunden bei Raumtemperatur.
- Formaldehyd Ersetzen mit 70% ethanol nach 24 Stunden und lassen Sie über Nacht vor der Einbettung in Paraffin, Schneiden und Färben.
4. Laser Mikrodissektion des Invasive Margin
- Abschnitt bis 10 um-Dicke auf Membran Dias.
- Entparaffinieren Abschnitte durch die Anwendung Xylol für 1 min, dann entfernen Xylol und fixieren in 75% Ethanol für eine weitere 1 min.
- Entfernen Ethanol und Fleck mit 0,125% Kresylviolett Lösung für 1 min. Kresylviolett hebt Epithelzellen und erlaubt die einfache Unterscheidung von Stroma.
- Entfernen Kresylviolett und gelten 100% Ethanol für eine weitere 1 min vor dem Spülen mit 100% Ethanol. Lassen Sie Folien an der Luft trocknen für 30 min.
- Führen Lasermikrodissektion mit gewählten Plattform (zB Leica AS-System).
- Setzen Sie den Glasobjektträger mit dem gefärbten Abschnitt, um sich auf den Mikroskoptisch mikrodissektiert Gesicht werden.
- Montieren Sie eine 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in die Sammelkassette und 50 ulZell-Lyse-Puffer (z. B. DNA, RNA oder Protein-Lyse-Puffer) an der Kappe in die microdissected Gewebe zu sammeln.
- Unter direkter Sicht mit dem Joystick, um Gewebe von Interesse zu identifizieren, und mit Hilfe der Software-Schnittstelle, kommentieren die gefärbte Bio-Ecke, Hervorhebung Zellen bei der Tumorinvasionsfront mikrodissektiert werden.
- Weisen Sie den Laser zu feuern, die beide aus den markierten Bereich schneiden sollte und treiben mikrodissezierten Gewebe in der Kappe des Mikrozentrifugenröhrchen.
- Sobald genügend Material gesammelt worden ist, werfen Sie die Kassette Sammlung, schließen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen und Spin sanft, um die Lyse-Puffer auf den Boden der Röhre zu ziehen.
- Zeigen Proben auf Eis, bis Mikrodissektion abgeschlossen ist. Verfahren Proben durch ein geeignetes Verfahren, um den Analyten von Interesse zu extrahieren.
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Representative Results
Wir haben das obige Verfahren, um mehrere Kombinationen von CRC-Zelllinien und Stromazellen aufgebracht. Ein Beispiel hier präsentiert wird, ist SW480 CRC epithelialen Zelllinien mit primären humanen ex vivo Darm Fibroblasten. 3-dimensionale Co-Kulturen sind zum Vergleich der unterschiedlich exprimierten miRNAs zwischen Zellen an der invasiven Tumorfront ausgebildet (Fig. 1), um Mikroskopie und Laser-Capture-Mikrodissektion (Fig. 2) unterzogen und durch microRNA (miRNA) Profilierung (3) analysiert, und die in den Schichtladungs-(nicht-eindringenden) Tumorzonen.
Abbildung 1. Schematische und fotografische Darstellungen der organotypischen Modell. CRC-Zellen werden auf einem Kunst Stroma-Schicht, die ausgesät Fibroblasten und wesentliche Komponenten der extrazellulären Matrix. Zellen sind co-kultiviert bei einem Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche geschaffen durch Erhöhung der organotypischen Gel auf einem sterilen Edelstahlnetz. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
.. Abbildung 2 LMD von SW480 Zellen CRC Invasion der organotypischen Stroma Kresylviolett wird verwendet, um CRC-Epithelzellen (A) zu markieren; invasive Tumor Inseln werden dann definiert (B); vor der Laser Präparation auftritt (C) und das geschnittene Stück wird zu einer Sammelvorrichtung (D) transportiert. Nicht eindringenden Zellen und Stromazellen werden identifiziert und isoliert nach der gleichen Methodik.w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
3. MicroRNA Microarray-Daten. Arrays wurden unter Verwendung eines GenePix Pro 3.0.5 Scanner Cy5 bei einer Wellenlänge von 635 nm zu detektieren abgetastet. Mittlere Fluoreszenzintensitäten wurden normalisiert und Expressionsverhältnisse zwischen Laser Mikrodissektion invasive Spanne berechnet CRC-Zellen und nicht-invasive Rand CRC-Zellen in den geschichteten Epithelien. Die Daten wurden durch fache Veränderung und Datenwerte + / sortiert - 2-fach Wechsel von einem repräsentativen Experiment vorgestellt, die Differential miRNA-Genexpression zwischen den Zellen Marge invasive und nicht-invasive Marge Zellen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
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Discussion
Hier beschreiben wir ein Verfahren, um spezifisch zu isolieren und zu charakterisieren, Tumorzellen, die die Fähigkeit, den Krebs Stroma in den frühesten Stadien der metastatische Fortschreiten in einer 3-dimensionalen Co-Kultur-Konstrukt von epithelialen und stromalen Zellen eindringen erworben.
Co-Kultur-Modelle der CRC-Epithelzellen mit einem synthetischen Stroma enthält ex vivo menschlichen Kolon-Fibroblasten nebeneinander bestehen wurden verwendet, um CRC-Invasion in 3-Dimensionen zu studieren. Dieses System, das physiologisch relevanten ahmt in vivo-Bedingungen können auch für andere Krebs Szenarien durch Substitution Zellen im Epithel und Stroma Bau der Verwendung von Ex-vivo-Fibroblasten verschiedenen anatomischen Ursprung angepasst werden. Eine Einschränkung dieses Ansatzes ist die Vereinfachung der Stromazellen Fach nur mit Fibroblastenzellen, die in vivo Colon Stroma ist ein komplexes und dynamisches Gewebe mit unterschiedlichen cell Bestandteile. Ein Beispiel ist die Immun-abgeleiteten Zellen, die in signifikanten Mengen in primären Tumormaterial aber fehlt diesem Modell sind. Trotzdem ist die zuverlässige Reproduzierbarkeit dieses Modell in Verbindung mit der Leichtigkeit, mit der die Zellbestandteile können experimentell manipuliert werden (zB durch Überexpression oder Knockdown von einzelnen Genen in den Epithel-und Stromazellen Fächer), ist dies ein wertvolles und kostengünstiges Modell verglichen zu herkömmlichen in-vivo-Experimente.
In diesem Manuskript auch wir gezeigt, dass CRC-Zellen an der Tumorinvasionsfront in diesem Modellsystem zum Ausdruck bringen verschiedene miRNA-Expressionsprofilen, um identische Zellen, die nicht an der invasiven Front-und im Schicht epithelialen Schichten entfernt. Dies stellt ein Proof of Concept, dass Laser-mikrodissektiert Gewebe von organotypischen Co-Kultur-Modelle ist ein gültiger Ansatz zur frühen Prozesse der Metastasierung zu studieren. Der Schwerpunkt erre war ausschließlich auf miRNA-Expression, da miRNAs sind stark in der Pathogenese von zahlreichen bösartigen Erkrankungen beteiligt und deregulierten Expression sowohl in Epithel-und Stromazellen Krebs haben wichtige Konsequenzen für CRC 2,3,5. Außerdem miRNAs sind stabil, um die Extraktion und Analyse von konventionellen Archivierungs Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe, so dass sie leistungsfähiger Biomarker für die Diagnose und Prognose von menschlichem Gewebe zu herkömmlichen Verarbeitung in der Routine histopathologische Labors 9,10 unterzogen. Allerdings könnte unsere Methode sehr leicht für Genom-und Proteom-Analyse angepasst werden, weitere Betonung der Vielseitigkeit dieses Ansatzes.
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Disclosures
Die Autoren offenbaren keine potenziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
MB wird durch Zuschüsse aus einem MRC-Stipendium unterstützt. KP und AHM werden durch Zuschüsse von Wessex Medical Research and Cancer Research UK / RCS (England) (C28503/A10013) unterstützt. Wir sind dankbar für die Unterstützung der Universität von Southampton Histochemistry Research Unit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
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