Summary
Molekylär profilering av laser microdissected celler och stroma från syntetiska, vävnadstekniska kolorektalcancer modeller representerar en roman och manipulerbar metod för att karakterisera och dissekera den distinkta biologin i gränssnittet mellan tumörceller vid den invasiva fronten och cancer tillhörande stromaceller.
Abstract
Invaderande kolorektal cancer (CRC) celler har förvärvat förmågan att bryta sig loss från sina systerceller, infiltrera stroma, och omforma den extracellulära matrisen (ECM). Karakterisera biologin av denna fenotypiskt distinkt grupp av celler skulle väsentligt förbättra vår förståelse av tidiga händelser under metastaserande kaskad.
Tumör invasion är en dynamisk process underlättas av dubbelriktade samspelet mellan malignt epitel och cancer associerade stroma. För att undersöka cellspecifika svar på tumör stroma-gränssnittet har vi kombinerat organotypisk co-kultur-och lasermikro dissektion tekniker.
Organotypiska modeller, där viktiga stromal beståndsdelar såsom fibroblaster är 3-dimentioanally co-odlade med cancer epitelceller, är mycket manipulerbar experimentella verktyg som möjliggör invasion och cancer-stroma interaktioner som skall studeras i nära-physiological förhållanden.
Laser microdissection (LMD) är en teknik som innebär att kirurgisk dissektion och utvinning av de olika skikten i tumörvävnad, med micron nivå precision.
Genom att kombinera dessa tekniker med genomisk, transcriptomic och epigenetisk profilering strävar vi efter att utveckla en djupare förståelse för de molekylära egenskaper invaderande tumörceller och omgivande stromal vävnad, och därmed potentiellt avslöja nya biomarkörer och möjligheter för utveckling av läkemedel i barnkonventionen.
Introduction
Organotypiska samkulturer är vävnadstekniska modeller som stöd i att rekonstruera in vivo tumormicroenvironmenten i 3-dimensioner genom juxtaposing maligna epitelceller och stromaceller i en kollagen gel som innehåller väsentliga extracellulära matrixkomponenter 1-3. Huvudsakligen tänkt som en metod för att mäta tumörinvasion, organotypics minska beroendet av in vivo-djurmodeller, och undviker de brister hos andra tekniker in vitro, såsom Transwell-analyser, i vilka invaderande celler tvingas artificiellt i en mono-dispergerat tillstånd 2-4. Införandet av stromaceller i dessa modeller, såsom fibroblaster, återspeglar den viktiga roll tumormicroenvironmenten i regleringen av malign invasion och metastasering 3-4, men den fenotypiska heterogenitet stroma är sådan att för att maximera den fysiologiska relevansen av organotypisk modeller, organspecifika, anatomiskt korrekta ex vivofibroblaster bör inkluderas där så är möjligt 3,6.
Organotypics är en mångsidig plattform för att studera interaktioner mellan tumör-och stromaceller och används alltmer på nya sätt för att undersöka påverkan på tumörinvasion av kemiska hämmare och riktade gen 7,8 förändringar. Studera den invasiva tumörmarginalen är en särskilt spännande utsikter. I organotypic modeller etablerade kolorektal cancer (CRC)-cellinjer producerar typiskt en väl stratifierat epitel-skikt, och i tvärsnitt, celler som har förvärvat förmågan att invadera den extracellulära matrisen (ECM) är lätt att urskilja. Mot bakgrund av den etablerade mikro topografisk heterogenitet tumörer och tumörassocierade stromaceller in vivo, utvinna dessa celler med hjälp av laser microdissection och studera dem i isolering, kan avslöja viktiga biologiska insikter om ursprunget till kolorektal cancer metastaser och hur det kan vara mer effektivt målinriktad. Jagn följande metod, alla patienter som donerat vävnadsprover som skriftligt informerat samtycke, och studien godkändes av institutionerna regionala forskningsetisk kommitté.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fastställande av Primär fibroblastkulturer från Kolon Explantat
- Erhålla prover av normal human kolon mukosa vävnaden direkt från det kirurgiska operationssalen, och suspendera i 7-10 ml PBS supplementerat med 100 enheter / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 0,25 | ig / ml Fungizone.
- I laboratoriet, placera provet i centrum för en 10 cm vävnadsodlingsskål och tvätta 3 gånger med PBS / Pen-strep / Fungizone. Inte aspirera efter den sista tvätten.
- Med steril pincett och skalpell, skär vävnaden i små bitar (ca 2 mm) och placera varje del i mitten av en tvär ritas med skalpellblad i en 12-brunnars platta. Vagga skalpellen försiktigt över vävnaden så att den kan ansluta sig till.
- Kultur exemplaren i 750 | il primär fibroblast-tillväxtmedium (DMEM kompletterat med 20% fetalt kalvserum (FCS), 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 292 | ig / ml L-glutamin), som bör submerge vävnaden utan gör det möjligt att flyta. Undvik att störa plattan under de kommande 5 dagarna förutom att re-foder varje 2 dagar.
- Under de kommande 5 dagarna fibroblaster kommer sakta börjar växa ut från kanten av vävnaden. Vid ca 7 dagar, kommer detta att vara mer synliga. Efter ca 3-4 veckor, och om det finns tillräckliga fibroblaster växer ut, tillsätt 750 l trypsin till varje brunn. När cellerna har fristående (vilket kan ta 5-10 min), pool och överföring till en T-25 vävnadskultur kolv.
2. Organotypiska Framställning
Beredning av fibroblast impregnerade organotypisk gel:
- Bered en fibroblast-cellsuspension innehållande 5 x 10 5 celler per organotypic i DMEM kompletterat med 10% FCS och 292 ug / ml L-glutamin.
- Gör upp organotypiska geler på is, i följande förhållanden:
- 7 volymer av Rat-Tail Collagen: Matrigel mix (01:01)
- 1 volym filtrerad 10x DMEM
- En volym av FCS
- En volym av fibroblast-cellsuspension innehållande 5 x 10 5 fibroblaster
För 9 geler (1 ml per gel) bereda 10 ml och blanda försiktigt för att undvika bubblor.
- Tillsätt 1 ml till varje brunn i en 24-brunnars platta och inkubera under 1 timme vid 37 ° C i en fuktig atmosfär för att medge geler att ställa in. Efter 1 timme tillsätt 1 ml DMEM (10% FCS) / Glut på toppen av gelerna och återgå till inkubatorn över natt.
- Följande dag aspirera mediet från toppen av gelerna och plattan 1 ml av medium innehållande 5 x 10 5 CRC-epitelceller.
Beredning av gel belagd nylon blad:
- Förbered sterila, autoklave nylon blad som mäter 1,5 cm x 1,5 cm, i förväg.
- Med hjälp av steril pincett, placera det nödvändiga antalet nylon blad i en 10 cm odlingsskål (vanligtvis 4 nylon blad kan rymmas per fat).
- Make up gel på is i följande ordning (250 pl totalvolym krävs per nylonblad):
- 7 volymer av Rat-Tail Collagen
- 1 volym filtrerad 10x DMEM
- En volym av FCS
- 1 volym av DMEM 10% FCS / Glut
- Om lösningen är gul, neutraliserar genom tillsats av 0,1 M NaOH i 50 | il alikvoter tills lösningen blir rosa.
- Addera 250 pl av denna lösning till varje nylonarket och inkubera vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2 under 30 min för att tillåta gelén att ställa in.
- Fyll 1% glutaraldehyd lösning i PBS. Tillsätt 10 ml till varje 10 cm odlingsskål när gelen har stelnat och inkubera vid 4 ° C under 1 timme.
- Tvätta nylon blad 3x i PBS och 1x i DMEM (10% FCS) / Glu och inkubera över natten i DMEM / Glu vid 4 ° C.
Att höja organotypiska geler på galler stål för invasion:
- Pre-bereda ställnings galler genom att vika ark av rostfritt stål i ett stativ formation. Autoklavera före användning.
- Använd pincett steriliserade i etanol för att placera ett galler stål i varje brunn i en sex brunnar.
- Placera en gel-belagt nylonblad med kollagen sidan uppåt, på varje galler.
- Försiktigt överföra organotypiska geler från 24-brunnar till den upphöjda nylonblad med hjälp av en spatel steriliserad i etanol.
- Fyll väl med DMEM 10% FCS / Glut kompletterat med 10% FCS tills nylonarket är i kontakt med mediet men inte nedsänkt. Kontrollera att mediet inte vidrör organotypisk gelen.
- Inkubera under 14 dagar vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2 och ersätter medium var 2 dagar.
3. Organotypiska Fixering
- Ta bort hela organotypisk inklusive nylonblad från väl och lägg på plastfolie.
- Bisect organotypic och nylonarket med användning av en ren engångs skalpell och fixera båda halvorna i formaldehyd under 24 timmar vid rumstemperatur.
- Byt formaldehyd med 70% ethanol efter 24 timmar och lämna över natten innan inbäddning i paraffin, snittning och färgning.
4. Laser Microdissection av Invasive Marginal
- § till 10 um-tjocklek på membran monterade diabilder.
- Avparaffinera avsnitt genom att tillämpa Xylen under 1 minut, ta sedan bort Xylen och fixa i 75% etanol i ytterligare 1 minut.
- Avlägsna etanol och fläcken med 0,125% kresylviolett lösning i 1 min. Kresylviolett belyser epitelceller och tillåter enkel diskriminering från stroma.
- Ta kresylviolett och tillämpa 100% etanol i ytterligare 1 minut innan du sköljer med 100% etanol. Låt objektglasen lufttorka i 30 min.
- Genomför laser microdissection använda vald plattform (t.ex. Leica AS-systemet).
- Placera glasskiva med den färgade delen som ska microdissected sidan nedåt på mikroskop scenen.
- Montera en 0,5 ml mikrocentrifugrör i uppsamlingskassetten och tillsätt 50 plcellysbuffert (t.ex. DNA, RNA eller protein lysbuffert) till locket i vilket microdissected vävnad kommer att samla in.
- Under direkt vision, använda joysticken för att identifiera vävnaden av intresse, och använda programvaran gränssnitt, kommentera den färgade organiska delen, belyser celler som skall microdissected vid tumörinvasion fronten.
- Instruera laser för att skjuta, vilket både skulle klippa ut det markerade avsnittet och driva microdissected vävnad in i locket på mikrocentrifugrör.
- När tillräckligt med material har samlats in, mata ut uppsamlingskassetten stänger mikrocentrifugrör och snurra försiktigt för att rita lysbuffert till botten av röret.
- Placera proverna på is tills microdissection är klar. Process prover genom en lämplig metod för att extrahera analyten av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tillämpat ovanstående metod till flera kombinationer av CRC-cellinjer och stromaceller. Ett exempel som presenteras här är SW480 epitelceller CRC cellinjer med primära humana ex vivo colonic fibroblaster. 3-dimension samkulturer konstrueras (figur 1), underkastades mikroskopi och laser capture mikrodissektion (Figur 2), och analyserades genom mikro-RNA (miRNA) profilering (figur 3) för jämförelse av differentiellt uttryckta miRNA mellan celler på den invasiva tumör främre och de i de skiktade (icke-invaderande) tumörzoner.
Figur 1. Schematisk och fotografiska representationer av organotypisk modellen. CRC celler ympas på en syntetisk stromalskiktet innehåller fibroblaster och väsentliga extracellulära matriskomponenter. Celler är co-odlade med en luft-vätska gränssnitt skapas genom att höja organotypisk gelen på ett sterilt galler i rostfritt stål. Klicka här för att visa en större bild.
.. Figur 2 LMD av SW480 CRC celler invaderar organotypisk stroma kresylviolett används för att markera CRC epitelceller (A); invasiva tumör öar definieras sedan (B); innan laser dissektion uppstår (C) och den skurna stycket transporteras till en uppsamlingsanordning (D). Icke-invaderande celler och stromala celler identifieras och isoleras med användning av samma metod.w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. MikroRNA microarray-data. Matriser scannades med hjälp av en GenePix Pro 3.0.5 scanner för att upptäcka Cy5 vid en våglängd av 635 nm. Mean fluorescensintensiteter normaliserades och uttrycks nyckeltal som beräknas mellan laser microdissected invasiva marginal CRC celler och icke-invasiva marginal CRC celler i de skiktade epiteliala lagren. Data sorterade efter faldig förändring och datavärden + / - 2-faldig förändring från ett representativt experiment presenteras visar differentiell miRNA genuttryck mellan de invasiva marginalcellerna och icke-invasiva marginalceller. Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna avslöjar inga potentiella intressekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al. miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance. Cancer Res. , (2013).
- Bullock, M. D., et al. Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression. Cell Death Dis. 20 (4), (2013).
- Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. Measuring invasion in an organotypic model. Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).
- De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth. Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).
- Fries, K. M., et al. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).
- Moutasim, K. A., et al. Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis. J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).
- Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).
- Li, J., et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells. BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).
- Szafranska, A. E., et al. Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling. J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).
