Summary
激光显微切割细胞和基质由合成的，组织工程肠癌模型的分子分析代表了一种新的和可操作的方法在肿瘤细胞之间的界面来表征和解剖的独特生物学在浸润前沿和癌症相关的基质细胞。
Abstract
入侵结直肠癌（CRC）细胞已获得挣脱他们的姐姐细胞，浸润间质，和重塑细胞外基质（ECM）的能力。这个特征明显的表型组细胞的生物学转移级联过程中可以大大提高我们的早期事件的理解。
肿瘤侵袭是一个动态过程由恶性上皮和相关肿瘤间质之间的双向相互作用促进。为了检查细胞特异性应答在我们结合器官共培养和激光显微解剖技术在肿瘤基质界面。
器官模型，其中关键的基质成分，如成纤维细胞是3 - dimentioanally共培养与癌症上皮细胞，是高度可操作的实验工具，使浸润和肿瘤 - 基质的相互作用在近pH值加以研究ysiological条件。
激光显微切割（LMD）是这需要手术剥离和提取肿瘤组织内的各阶层，以微米级精度的技术。
通过结合这些技术与基因组，转录组和表观遗传分析，我们的目标是发展的入侵肿瘤细胞和周围间质组织的分子特性有更深的了解，并在这样做可能揭示新的生物标志物，并在CRC的药物的发展机遇。
Introduction
器官型共培养物是组织工程化的模型，其帮助在含有必需的细胞外基质组分1-3的胶原凝胶并列恶性上皮细胞和基质细胞重建体内肿瘤微环境中3维。主要设想为测量肿瘤侵袭的方法，organotypics减少依赖于体内动物模型，并避免其它的体外技术如Transwell小室测定法，其中侵入细胞是人工强制进入单分散状态2-4的缺点。包含基质细胞在这些模型中，如成纤维细胞，反映了肿瘤微环境中调节恶性肿瘤的侵袭和转移3-4中的重要作用，然而基质的表型异质性是这样的，为了最大限度地提高器官的生理相关性模型，器官特异性，准确的解剖体外成纤维细胞应该包括尽可能3,6。
Organotypics是一个通用平台，研究肿瘤和基质细胞之间的相互作用，并越来越多地以新颖的方式来检查对肿瘤侵袭化学抑制剂的影响，以及靶基因的改变7,8使用。研究侵袭性肿瘤边缘是一个特别令人兴奋的前景。在器官模型，建立结肠直肠癌（CRC）细胞系中通常会产生一个很好的分层上皮细胞层，并在截面中，已经获得侵入细胞外基质（ECM）的能力的细胞是容易辨别的。鉴于肿瘤和肿瘤相关间质细胞在体内的既定微地形异质性，采用激光显微切割和学习他们孤立地提取这些细胞，可以揭示有关大肠癌转移的来历重要的生物学见解以及它会如何更有效地有针对性的。我n以下的方法，谁捐赠签署知情同意书的组织样本，并研究的所有患者被批准为机构区域研究伦理委员会。
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Protocol
从结肠外植初级成纤维细胞培养1。建立
- 获得正常人结肠黏膜组织样本直接从外科手术室，并暂停在7-10毫升的PBS中补充有100单位/ ml青霉素，100微克/毫升链霉素和0.25微克/毫升两性霉素。
- 在实验室中，将样品在一个10厘米的组织培养皿的中心，洗3次，用PBS /笔，链球菌/两性霉素。最后一次洗涤后不要吸。
- 用无菌镊子和手术刀，切割组织切成小块（约2毫米），并把每个块上绘制在一个12孔板的手术刀刀片交叉的中心。轻轻摇动手术刀在组织，使其能够坚持。
- 培养在750微升的试样初级成纤维细胞生长培养基（DMEM补充有20％胎牛血清（FCS），100 U / ml青霉素，100微克/毫升链霉素和292微克/毫升L-谷氨酰胺），这应该次亚RGE组织而不使其浮动。避免打扰板块未来5天，惟重新饲料每2天。
- 在未来5天的成纤维细胞会慢慢开始从组织的边缘长出来。在大约7天，这将更加明显。经过约3-4周，如果有足够的成纤维细胞生长出来，加750μL胰蛋白酶，每孔。经过细胞脱离（这可能需要5-10分钟），游泳池和转移到T-25组织培养瓶。
2，器官准备
编制成纤维浸渍胶器官的：
- 制备含每器官型5×10 5细胞在DMEM补充有10％FCS和292微克/毫升L-谷氨酰胺成纤维细胞悬浮液。
- 弥补在冰上的器官型凝胶，以以下比率：
- 7卷的鼠尾胶原蛋白：基质胶混合（1:1）
- 1体积的过滤DMEM 10倍
- 1体积的FCS
- 1体积的含有5×10 5的成纤维细胞的成纤维细胞的细胞悬浮液
9凝胶（凝胶每1ml）的准备好10毫升，轻轻混匀，避免气泡。
- 加入1 ml至24孔板的各孔中并孵育1小时，在37 °C在一个潮湿气氛中，使凝胶进行设置。 1小时后，加入1 ml DMEM（10％FCS）/过剩的凝胶的顶部，并返回到培养箱中过夜。
- 翌日，从凝胶板和含有5×10 5个CRC上皮细胞介质1毫升的顶部吸出培养基。
制备凝胶涂层尼龙片：
- 准备灭菌，高压灭菌尼龙布测量1.5厘米×1.5厘米，在前进。
- 用无菌镊子，将尼龙片材的所需数量在10厘米的培养皿（通常4尼龙片可以每皿容纳）。
- 弥补冰凝胶下列顺序（250μl总音量每尼龙板必填项）：
- 7卷的鼠尾胶原蛋白
- 1体积的过滤DMEM 10倍
- 1体积的FCS
- 1体积的DMEM 10％FCS /过剩
- 如果溶液是黄色的，通过添加0.1M的NaOH在50微升等分试样，直至溶液变成粉红色中和。
- 加入250μl该解决方案的每个尼龙板，并在37 ℃，5％CO 2中30分钟，使凝胶来设置的潮湿气氛。
- 补1％戊二醛的PBS溶液中。加入10 ml每10 6cm培养皿一旦凝胶已经设置并孵育在4℃下1小时。
- 洗涤尼龙片3倍的PBS中和1x的DMEM（10％FCS）/谷氨酸和在DMEM /谷氨酸孵育过夜，在4°C。
养器官凝胶上钢格栅的入侵：
- 通过折叠不锈钢板成三脚架形成预做准备脚手架网格。高压灭菌后才能使用。
- 使用镊子灭菌的乙醇放置一个钢格到6孔板的各孔中。
- 将凝胶涂层尼龙板与胶原侧至上，到每个网格。
- 小心地从24孔板转移的器官型凝胶用无菌乙醇刮刀凸起尼龙片。
- 填充井用DMEM 10％FCS /过剩补充有10％FCS，直到尼龙片是在与介质接触，但不被水淹没。确保介质不接触的器官凝胶。
- 孵育14天，在37℃下在5％CO 2的潮湿气氛中，更换媒体，每2天。
3。器官枷
- 从很好地去除整个器官，包括尼龙板，并放置在保鲜膜。
- 平分器官并用洁净的一次性手术刀尼龙板和甲醛固定两半24小时在室温下。
- 用70％乙代替甲醛醇后24小时，石蜡包埋，切片，染色和前离开过夜。
4，激光的入侵保证金显微切割
- 第10微米厚的膜上安装滑轨。
- Deparaffinize部分通过应用二甲苯，持续1分钟，然后除去二甲苯和75％乙醇固定进行1分钟。
- 除去乙醇并用染色1分钟0.125％甲酚紫溶液。甲酚紫突出上皮细胞，并允许从基质容易受到歧视。
- 除去甲酚紫和用100％乙醇漂洗之前申请的100％乙醇进行1分钟。让载玻片在空气中干燥30分钟。
- 使用选择的平台（ 如徕卡的AS系统）进行激光显微切割。
- 将载玻片与染色部分进行显微切割面朝下放在显微镜载物台。
- 安装0.5 ml离心管放入回收盒，并加入50微升细胞裂解缓冲液（ 例如，DNA，RNA或蛋白质的裂解缓冲液）到帽成显微组织将收集。
- 在直视下，用摇杆来确定感兴趣的组织，并使用该软件的界面，注释染色的有机部分，突出细胞在肿瘤侵犯前进行显微切割。
- 指示激光射击，这都应该切出的突出部分和推动显微组织到微量离心管的盖子。
- 一旦有足够的材料被收集，弹出收集盒，关闭离心管中，轻轻旋转绘制裂解缓冲液到管的底部。
- 将样品置于冰上，直到显微切割完成。过程中样品通过适当的方法来提取目标分析物。
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Representative Results
本公司已申请上述方法的CRC细胞系和间质细胞的多种组合。其中一个例子这里介绍的是SW480上皮CRC细胞系与原代人类体外结肠成纤维细胞。三维共培养物对细胞之间差异表达的miRNA在侵袭性肿瘤前比较，构造（ 图1），进行显微镜和激光捕获显微切割（ 图2），并通过微RNA（miRNA）的谱（ 图3）分析以及在该分层（非侵入）的肿瘤区域。
图1原理图和器官模型的摄影表现，CRC细胞接种到含有一种人工合成的基质层成纤维细胞和必需的细胞外基质成分。细胞共同培养时通过提高器官凝胶到一个无菌的不锈钢网格创建的气-液界面， 点击此处查看大图。
。图2 LMD SW480大肠癌细胞侵及器官间质甲酚紫是用来突出CRC的上皮细胞（A）;浸润性肿瘤的岛屿，然后定义（B）;激光剥离发生时（C）之前和切割片被输送到收集装置（D）。非侵入细胞和基质细胞识别并使用相同的方法分离出来。w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
图3。微小RNA微阵列数据。阵列被使用GenePix Pro的3.0.5扫描器检测到的Cy5在635nm的波长扫描。平均荧光强度进行归一化和激光之间的计算表达比显微切割侵入余量CRC细胞和非侵入性的余量的CRC细胞中的分层上皮层。数据是由倍数变化和数据值+ /分类-从有代表性的实验2倍的变化都显示了有创缘细胞和非侵入性的边际细胞之间的差异miRNA基因的表达。 点击这里查看大图。
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Discussion
这里我们描述了一种方法，特别是分离和表征已购入时转移进程在上皮细胞和基质细胞的三维共培养物的最初阶段侵入癌症相关间质的能力的肿瘤细胞。
由并列含有离体人结肠癌成纤维细胞的合成基质的CRC上皮细胞共培养模型被用于研究CRC侵袭3 -维。这其中在体内条件模拟可以通过在上皮代细胞，以及使用各种解剖起源的体外成纤维细胞构成的基质适用于其他癌症情景生理学相关的系统。这种方法的一个限制是仅使用成纤维细胞的间质隔室的简单化，作为体内结肠基质是一个复杂和动态的组织具有不同的大公升成分。一个例子是免疫源性细胞，这是目前在显著数量的原发肿瘤的材料，但此模型不存在。尽管如此，这种模式再加上轻松的可靠重复性与该细胞成分可以通过实验操作（ 例如，通过多年来在上皮细胞和基质车厢单个基因的表达或敲除），使之成为一个有价值的和符合成本效益的模式相比传统的体内实验。
在这个手稿，我们也证明了CRC细胞在肿瘤浸润前沿在这个模型系统，以相同的细胞表达不同的miRNA表达谱不是在浸润前沿和位于分层上皮细胞层。这代表了一个概念证明，从器官共培养模型激光显微切割组织，是研究早期过程中转移的一种有效的方法。的焦点，他再是完全以miRNA的表达，因为miRNA的强烈牵连的许多恶性肿瘤的发病机制及二者在上皮细胞和肿瘤相关的基质细胞有否在CRC 2,3,5重要后果放松管制的表达。此外miRNA是稳定的，以提取和分析来自常规归档福尔马林固定的石蜡包埋的组织，使得它们强大的生物标志物用于诊断和预测对人体组织进行常规加工在常规组织病理学实验室9,10。然而，我们的方法可以很容易地适应用于基因组和蛋白组学分析，进一步强调了这种方法的通用性。
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Disclosures
作者没有披露潜在的利益冲突。
Acknowledgments
MB是由来自MRC奖学金补助资金支持。 KP和AHM是由威塞克斯医学研究和英国癌症研究中心/ RCS（英格兰）（C28503/A10013）补助资金支持。我们感谢南安普敦组织化学研究单位大学的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
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