Summary
Profilage moléculaire des cellules laser microdissection et le stroma des modèles synthétiques, de l'ingénierie tissulaire du cancer colorectal représente une approche nouvelle et manipulable à caractériser et à disséquer la biologie particulière à l'interface entre les cellules tumorales à la cellules stromales associées au cancer invasif et avant.
Abstract
Envahir le cancer colorectal (CRC), les cellules ont acquis la capacité de se libérer de leurs cellules sœurs, s'infiltrer dans le stroma, et remodeler la matrice extracellulaire (MEC). La caractérisation de la biologie de ce groupe phénotypique distincte de cellules pourrait améliorer considérablement notre compréhension des événements précoces lors de la cascade métastatique.
invasion tumorale est un processus dynamique facilitée par des interactions bidirectionnelles entre épithélium malin et le stroma de cancer associé. Afin d'examiner les réponses spécifiques des cellules au stroma tumoral interface, nous avons combiné organotypique co-culture et des techniques de micro-dissection laser.
Modèles organotypiques, dans lesquels les mandants stromales clés telles que les fibroblastes sont 3 dimentioanally co-cultivées avec des cellules épithéliales cancéreuses, sont des outils expérimentaux très manipulables qui permettent invasion et interactions stroma-cancer à étudier dans un proche-phconditions ysiological.
Microdissection laser (LMD) est une technique qui implique la dissection chirurgicale et l'extraction des différentes couches au sein du tissu tumoral, avec une précision de l'ordre du micron.
En combinant ces techniques avec le profilage génomique, transcriptomique et épigénétique nous visons à développer une compréhension plus profonde des caractéristiques moléculaires des cellules tumorales envahissantes et tissu stromal environnante, et en faisant éventuellement révéler de nouveaux biomarqueurs et des opportunités pour le développement de médicaments dans CRC.
Introduction
Co-cultures organotypiques sont des modèles à partir de tissus qui aide à la reconstruction de la micro-vivo dans la tumeur en trois dimensions en juxtaposant les cellules épithéliales malignes et les cellules stromales dans un gel de collagène contenant des composants de la matrice extracellulaire essentiels 3.1. Principalement conçu comme une méthode de mesure de l'invasion tumorale, organotypics réduire la dépendance in vivo dans des modèles animaux, et d'éviter les défauts des autres techniques in vitro tels que des dosages Transwell, dans lequel les cellules sont forcées artificiellement d'invasion dans un état monodispersé 2-4. L'inclusion de cellules stromales dans ces modèles, telles que les fibroblastes, reflète le rôle fondamental du micro-environnement de la tumeur maligne dans la régulation de l'invasion et la métastase 4.3, cependant l'hétérogénéité phénotypique du stroma est telle que, pour optimiser la pertinence physiologique de organotypique modèles, pour certains organes, anatomiquement exactes ex vivofibroblastes doivent être inclus autant que possible de 3,6.
Organotypics sont une plate-forme polyvalente pour étudier les interactions entre la tumeur et les cellules stromales et sont de plus en plus utilisés dans de nouvelles façons d'examiner l'impact sur l'invasion tumorale des inhibiteurs chimiques et des altérations de gènes ciblés 7,8. L'étude de la marge de la tumeur invasive est une perspective particulièrement intéressante. Dans les modèles organotypiques, le cancer colorectal mis en place (CRC) des lignées cellulaires produisent typiquement une couche épithéliale bien stratifié, et en coupe, les cellules qui ont acquis la capacité d'envahir la matrice extracellulaire (MEC) sont facilement repérables. Compte tenu de l'hétérogénéité des micro-topographique établi de tumeur et associés à une tumeur des cellules stromales in vivo, l'extraction de ces cellules à l'aide de laser microdissection et de les étudier dans l'isolement, peut révéler des indications biologiques importantes concernant l'origine des métastases du cancer colorectal et la façon dont il peut être plus efficace, ciblée. Jen la méthodologie suivante, tous les patients qui ont donné des échantillons de tissus fournis le consentement éclairé, et l'étude a été approuvée par les institutions du comité d'éthique de la recherche au niveau régional.
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Protocol
1. Mise en place des cultures de fibroblastes primaires de coliques explants
- Obtenir des échantillons de tissu de colon humain muqueuse normale directement à partir de la salle d'opération chirurgicale, et suspendre à 7-10 ml de PBS supplémenté avec 100 unités / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, et 0,25 pg / ml de Fungizone.
- Dans le laboratoire, placer les échantillons au centre d'une boîte de culture de tissu de 10 cm et laver 3 fois avec du PBS / Pen-angine / Fungizone. Ne pas aspirer après le lavage final.
- Avec des pinces stériles et scalpel, couper le tissu en petits morceaux (environ 2 mm) et placer chaque pièce au centre d'une croix tracée avec la lame de scalpel dans une plaque de 12 puits. Basculez le scalpel doucement sur le tissu afin de lui permettre d'adhérer.
- Culture des échantillons dans 750 ul de milieu de croissance des fibroblastes primaires (DMEM supplémenté avec 20% de sérum de veau foetal (SVF), 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 292 ug / ml de L-glutamine), ce qui devrait submerge de tissu, sans lui permettre de flotter. Éviter de perturber la plaque au cours des 5 prochains jours sauf réalimentation tous les 2 jours.
- Au cours des 5 prochains jours fibroblastes vont lentement commencer à se développer à partir du bord du tissu. À environ 7 jours, ce sera plus visible. Au bout d'environ 3 à 4 semaines, et si il ya suffisamment de croissance des fibroblastes, ajoutez 750 ul de trypsine à chaque puits. Après que les cellules ont détaché (qui peut prendre 5-10 min), la piscine et le transfert à un flacon de culture tissulaire T-25.
2. Organotypique Préparation
Préparation du gel imprégné fibroblastes organotypique:
- Préparer une suspension de cellules de fibroblaste contenant 5 x 10 5 cellules par organotypique dans du DMEM supplémenté avec 10% de SVF et 292 ug / ml de L-Glutamine.
- Faites les gels organotypiques sur la glace, dans les rapports suivants:
- 7 volumes de collagène de queue de rat: Matrigel mélange (1:1)
- 1 volume de DMEM filtré 10x
- 1 volume de FCS
- 1 volume de suspension cellulaire de fibroblastes contenant 5 x 10 5 fibroblastes
Pour 9 gels (1 ml par gel) préparer 10 ml et mélanger doucement pour éviter les bulles.
- Ajouter 1 ml dans chaque puits d'une plaque à 24 puits et incuber pendant 1 heure à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée pour permettre de fixer des gels. Après 1 h ajouter 1 ml de DMEM (10% de FCS) / Glut sur des gels et revenir à l'incubateur pendant la nuit.
- Le jour suivant, le support d'aspiration à partir de la partie supérieure de la plaque de gels et de 1 ml de milieux contenant 5 x 10 5 cellules epitheliales du CRC.
Préparation des feuilles de nylon enduit de gel:
- Préparer stérile, feuilles de nylon autoclave mesure 1,5 cm x 1,5 cm, à l'avance.
- En utilisant des pinces stériles, placer le nombre requis de feuilles de nylon dans une boîte de culture de 10 cm (généralement 4 feuilles de nylon peuvent être logés par boîte).
- Maquillage gel sur la glace dans l'ordre suivant (250 pi totalevolume est nécessaire par feuille de nylon):
- 7 volumes de collagène de queue de rat
- 1 volume de DMEM filtré 10x
- 1 volume de FCS
- 1 volume de DMEM 10% SVF / Glut
- Si la solution est jaune, neutraliser par addition de NaOH 0,1 M dans des aliquotes de 50 pl jusqu'à ce que la solution vire au rose.
- Ajouter 250 pi de cette solution à chaque feuille de nylon et incuber à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 pendant 30 min pour permettre de mettre en gel.
- Maquillage solution de glutaraldéhyde à 1% dans du PBS. Ajouter 10 ml à chaque boîte de culture de 10 cm, une fois le gel est fixé et incuber à 4 ° C pendant 1 heure.
- Les feuilles de nylon Laver 3x dans du PBS 1x et dans du DMEM (10% de FCS) / Glu, et incuber pendant une nuit dans du DMEM / Glu à 4 ° C.
Augmenter gels organotypiques sur des grilles en acier pour l'invasion:
- Pré-préparer des grilles d'échafaudage par pliage de tôles d'acier inoxydable dans une formation de trépied. Autoclave avant utilisation.
- Utiliser des pinces stérilisées dans de l'éthanol afin de placer une grille d'acier dans chaque puits d'une plaque à six puits.
- Placer une feuille de nylon enduit de gel avec le côté le plus élevé du collagène, sur chaque grille.
- Soigneusement transférer les gels organotypiques de la plaque de 24 puits à la feuille de nylon soulevé à l'aide d'une spatule stérilisé dans de l'éthanol.
- Remplir le puits avec du DMEM 10% SVF / Glut supplémenté avec 10% de FCS jusqu'à ce que la feuille de nylon est en contact avec le milieu, mais non immergée. Assurez-vous que le support ne touche pas le gel organotypique.
- Incuber pendant 14 jours à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2, en remplacement de support tous les 2 jours.
3. Organotypique fixation
- Retirer organotypique ensemble, y compris la feuille de nylon de bien et placer sur une pellicule de plastique.
- Bissecter organotypique et la feuille de nylon à l'aide d'un scalpel jetable propre et fixer les deux moitiés dans du formol pendant 24 heures à température ambiante.
- Remplacer formaldéhyde avec 70% ethanol après 24 h et laisser une nuit avant l'enrobage dans de la paraffine, la coupe et la coloration.
4. Laser microdissection de la marge envahissantes
- Section monté à 10 um d'épaisseur sur une membrane diapositives.
- Déparaffiner sections en appliquant xylène pendant 1 min, puis retirez le xylène et fixer à 75% d'éthanol pendant 1 min.
- Éliminer l'éthanol et tache avec une solution de 0,125% de crésyl violet pendant 1 min. Le violet de crésyl souligne cellules épithéliales et permet la discrimination facile du stroma.
- Retirer le violet de crésyl et appliquer 100% d'éthanol pendant 1 min avant de rincer à 100% d'éthanol. Laisser les lames sécher à l'air pendant 30 minutes.
- Effectuer microdissection laser en utilisant la plate-forme choisie (par exemple, le système Leica AS).
- Placez la lame de verre avec la section teinté à microdissection face vers le bas sur la platine du microscope.
- Monter un tube de 0,5 ml à centrifuger dans la cassette de collecte et ajouter 50 ul deun tampon de lyse cellulaire (par exemple, ADN, ARN ou un tampon de lyse protéique) à la coiffe en tissu qui permettra de recueillir microdissection.
- Sous vision directe, utilisez le joystick pour identifier un tissu d'intérêt, et l'utilisation de l'interface du logiciel, d'annoter la section organique souillé, soulignant cellules à microdissection à l'avant de l'invasion tumorale.
- Demandez le laser à feu, ce qui devrait réduire à la fois la section en surbrillance et propulser tissu microdissection dans le bouchon du tube à centrifuger.
- Une fois suffisamment de matériel a été recueilli, éjecter la cassette de collecte, fermer le tube à centrifuger et tourner doucement pour l'extraire de la mémoire tampon de lyse au fond du tube.
- Placer les échantillons sur la glace jusqu'à ce que la microdissection est terminée. Traiter les échantillons par une méthode appropriée pour extraire l'analyte d'intérêt.
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Representative Results
Nous avons appliqué le procédé ci-dessus pour de multiples combinaisons de lignées cellulaires de CRC et des cellules stromales. Un exemple présenté ici est des lignées de cellules épithéliales SW480 CRC ex vivo avec des fibroblastes humains primaires du côlon. Co-cultures en 3 dimensions sont construits (figure 1), soumis à la microscopie et la microdissection par capture laser (figure 2), et analysés par microARN (miARN) profilage (figure 3) pour la comparaison des miARN exprimés de manière différentielle entre les cellules à l'avant de la tumeur invasive et ceux dans les zones tumorales stratifiées (non-invasif).
Figure 1. Schéma et représentations photographiques du modèle organotypique. CRC cellules sont ensemencées sur une couche de matière plastique contenant du stroma les fibroblastes et les composants de la matrice extracellulaire essentiels. Les cellules sont co-cultivées à l'interface air-liquide créé en élevant le gel organotypique sur une grille en acier inoxydable stérile. Cliquez ici pour agrandir l'image.
.. Figure 2 LMD des cellules SW480 CRC envahissent le stroma organotypique violet de crésyl est utilisé pour mettre en évidence CRC cellules épithéliales (A); îles tumorales envahissantes sont alors définis (B); avant la dissection laser se produit (C) et la pièce découpée est transportée vers un dispositif de collecte (D). Les cellules non envahissants et les cellules stromales sont identifiés et isolés en utilisant la même méthodologie.w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 3. Données de puces à ADN de microARN. Tableaux ont été numérisés à l'aide d'un scanner Pro 3.0.5 GenePix pour détecter Cy5 à une longueur d'onde de 635 nm. Intensités de fluorescence moyennes ont été normalisées et les ratios d'expression calculées entre laser micro-disséquées cellules invasives de CRC de marge et des cellules de CRC marge non-invasifs dans les couches épithéliales stratifiées. Les données ont été triés par facteur de variation et les valeurs de données + / - 2 fois le changement d'une expérience représentative sont présentés montrant écart miRNA expression des gènes entre les cellules de marge envahissantes et les cellules de la marge non-invasives. Cliquez ici pour agrandir l'image.
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Discussion
Nous décrivons ici un procédé pour isoler et caractériser spécifiquement les cellules tumorales qui ont acquis la capacité d'envahir le stroma associé au cancer au cours des premiers stades de la progression métastatique dans un produit d'assemblage en 3 dimensions de co-culture de cellules épithéliales et stromales.
Modèles de co-culture comprenant des cellules épithéliales CRC juxtaposés avec un stroma synthétique contenant ex vivo des fibroblastes du côlon humain ont été utilisés pour étudier l'invasion CRC en 3 dimensions. Ce système physiologiquement pertinent qui imite des conditions in vivo peuvent être adaptées pour d'autres scénarios de cancer en substituant des cellules dans l'épithélium et le stroma à l'aide la construction ex vivo des fibroblastes de diverses origines anatomiques. Une des limites de cette approche est la simplification du compartiment stromal utilisant uniquement des cellules de fibroblastes, le stroma du côlon in vivo est un tissu complexe et dynamique avec cel variablel électeurs. Un exemple en est les cellules immunitaires dérivées, qui sont présents en quantités importantes dans le matériau de la tumeur primaire, mais absent de ce modèle. Malgré cela, la reproductibilité fiable de ce modèle couplé avec la facilité avec laquelle les constituants cellulaires peut être expérimentalement manipulé (par exemple par surexpression ou inactivation de gènes individuels dans les épithéliales et stromales compartiments), font de ce rapport un modèle précieux et rentable à classique dans l'expérimentation in vivo.
Dans ce manuscrit, nous avons également démontré que les cellules du CRC à la tumeur invasive avant dans ce système modèle expriment des profils d'expression de miARN différents de cellules identiques non invasive à l'avant et qui sont situés dans les couches épithéliales stratifiées. Cela représente une preuve de concept que le laser tissu microdissection des modèles de co-culture organotypique est une approche valable pour étudier les processus précoces dans les métastases. L'accent qu'ilre était exclusivement sur l'expression des miARN, depuis miARN sont fortement impliqués dans la pathogenèse de nombreuses tumeurs malignes et déréglementé expression à la fois dans les cellules épithéliales et stromales associées au cancer ont des conséquences importantes dans CRC 2,3,5. En outre miARN sont stables à l'extraction et l'analyse de tissus d'archives classiques fixés au formol et inclus en paraffine, les biomarqueurs puissants pour le diagnostic et le pronostic sur les tissus humains soumis à un traitement classique dans les laboratoires de routine histopathologiques 9,10 faire. Cependant, notre méthode pourrait très facilement être adapté pour l'analyse génomique et protéomique, soulignant en outre la polyvalence de cette approche.
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Disclosures
Les auteurs décrivent pas de conflits d'intérêts potentiels.
Acknowledgments
MB est soutenu par des subventions d'une bourse de la MRC. KP et AHM sont pris en charge par des subventions de recherche médicale Wessex et Cancer Research UK / RCS (Angleterre) (C28503/A10013). Nous sommes reconnaissants pour le soutien de l'Université de Southampton Unité de recherche histochimie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
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