Summary
Molekylær profilering av laser microdissected celler og stroma fra syntetiske, vev-konstruerte kolorektal kreft modellene representerer en ny og påvirkelig tilnærming til karakterisere og dissekere den særegne biologi i skjæringspunktet mellom kreftceller ved invasiv foran og kreft forbundet stromale celler.
Abstract
Invaderende tykktarmskreft (CRC) celler har ervervet kapasitet til å bryte fri fra sine søster celler, infiltrere stroma, og fornye den ekstracellulære matrix (ECM). Karakteriserer biologien til dette fenotypisk distinkt gruppe av celler kunne vesentlig forbedre vår forståelse av tidlige hendelser i løpet av metastatisk kaskade.
Tumor invasjonen er en dynamisk prosess tilrettelagt av toveis interaksjoner mellom ondartet epitel og kreft forbundet stroma. For å undersøke cellespesifikk respons på svulsten stroma-grensesnittet har vi kombinert organotypic ko-kultur og lasermikro disseksjon teknikker.
Organotypic modeller, hvor sentrale stromal bestanddeler som fibroblaster er 3-dimentioanally co-kultivert med kreft epitelceller, er svært påvirkelig eksperimentelle verktøy som gjør det mulig invasjon og kreft-stroma interaksjoner som skal studeres i nær-physiological forhold.
Laser mikrodisseksjon (LMD) er en teknikk som innebærer den kirurgiske disseksjon og utvinning av de forskjellige strata i tumorvevet, med mikrometer-nivå presisjon.
Ved å kombinere disse teknikkene med genomisk, transcriptomic og epigenetisk profilering har vi som mål å utvikle en dypere forståelse av de molekylære egenskapene til invaderende kreftceller og omkringliggende stromal vev, og dermed potensielt avdekke nye biomarkører og muligheter for legemiddelutvikling i CRC.
Introduction
Organotypic co-kulturer er vev-konstruerte modeller som hjelpemiddel i å rekonstruere in vivo tumor mikromiljøet i tre dimensjoner ved å sidestille ondartede epitelceller og stromale celler i en kollagen gel inneholder essensielle ekstracellulære matrikskomponenter 1-3. Prinsipielt oppfattet som en metode for å måle tumorinvasjon, organotypics redusere avhengigheten av in vivo dyremodeller, og unngå ulempene ved andre in vitro-teknikker som Transwell-analyser, hvori invaderende celler blir tvunget inn i en kunstig mono-dispergert tilstand 2-4. Inkludering av stromale celler i disse modellene, slik som fibroblaster, reflekterer den essensielle rolle tumor mikromiljøet i regulering ondartet invasjon og metastase 3-4, men den fenotypiske heterogenitet av stroma er slik at for å maksimere den fysiologiske relevans av organotypic modeller, organspesifikk, anatomisk korrekt ex vivofibroblaster bør inkluderes der det er mulig 3,6.
Organotypics er en allsidig plattform for å studere samspillet mellom tumor og stromale celler og blir stadig mer brukt i romanen måter å undersøke effekten på tumor invasjon av kjemiske hemmere og målrettede genet endringer 7,8. Studerer invasiv svulst margin er en spesielt spennende prospekt. I organotypic modeller, etablert kolorektal kreft (CRC) cellelinjer som produserer vanligvis en brønn stratifisert epitel lag, og i tverrsnitt, celler som har ervervet evnen til å invadere den ekstracellulære matriks (ECM) er lett synlige. I lys av den etablerte mikro topografisk heterogenitet av tumor og tumorassosierte stromale celler in vivo, trekke disse cellene ved hjelp av laser microdissection og studere dem i isolasjon, kan avsløre viktige biologiske innsikt om opprinnelsen til kolorektal kreft metastasering, og hvordan det kan være mer effektivt målrettet. Jegn følgende metodikk, alle pasienter som har donert vevsprøver gitt skriftlig informert samtykke, og studien ble godkjent av institusjonene regionale forskningsetiske komité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Etablering av Primary fibroblastkulturer fra Tykktarms explants
- Få tak i prøver av normal menneskelig kolon slimhinnen vev direkte fra kirurgisk operasjonssalen, og suspendere i 7-10 ml PBS supplert med 100 enheter / ml penicillin, 100 mikrogram / ml streptomycin, og 0,25 mg / ml Fungizone.
- I laboratoriet, plassere prøven i sentrum av en 10-cm vev kultur fatet og vask tre ganger med PBS / Pen-strep / Fungizone. Ikke aspirer etter siste vask.
- Med steril tang og skalpell, skjære vevet i små biter (ca 2mm) og plassere hver brikke på midten av et kors tegnet med skalpell blad i en 12-brønns plate. Rock the skalpell forsiktig over i vevet til å tillate det å følge.
- Kultur prøvestykkene i 750 pl primær fibroblast vekstmedium (DMEM supplert med 20% føtalt kalveserum (FCS), 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 292 pg / ml L-glutamin), som skal submeRGE vevet uten å aktivere det til å flyte. Unngå å forstyrre plate løpet av de neste 5 dager bortsett fra å re-innmat hver 2 dager.
- I løpet av de neste 5 dager fibroblaster blir sakte begynne å vokse ut fra kanten av vevet. På ca 7 dager, vil dette være mer synlig. Etter omtrent 3-4 uker, og hvis det er tilstrekkelig fibroblaster vokser ut, tilsett 750 pl trypsin til hver brønn. Etter at cellene har frittliggende (som kan ta 5 til 10 min), basseng og overføring til en T-25 vevskultur-kolbe.
2. Organotypic Forberedelse
Utarbeidelse av fibroblast impregnert organotypic gel:
- Tilbered en fibroblast cellesuspensjon inneholdende 5 x 10 5 celler pr organotypic i DMEM supplert med 10% FCS og 292 pg / ml L-Glutamine.
- Gjør opp organotypic gels på is, i følgende forhold:
- 7 volumer av Rat-Tail Collagen: Matrigel blanding (1:1)
- 1 volum av filtrert 10x DMEM
- 1 volum av FCS
- 1. volum av fibroblast cellesuspensjon inneholdende 5 x 10 5 fibroblaster
For ni gels (1 ml per gel) forberede 10 ml og bland forsiktig for å unngå bobler.
- Tilsett 1 ml til hver brønn av en 24-brønns plate og inkuberes i 1 time ved 37 ° C i en fuktet atmosfære for å tillate geler for å angi. Etter 1 time tilsett 1 ml DMEM (10% FCS) / Glut på toppen av gelene, og vende tilbake til inkubatoren natten over.
- Den følgende dag, aspireres mediet fra toppen av gelene og plate 1 ml media inneholdende 5 x 10 5 CRC epitelceller.
Utarbeidelse av gel belagt nylon ark:
- Forbered steril, autoklaveres nylon ark som måler 1,5 cm x 1,5 cm, på forhånd.
- Ved hjelp av steril tang, plassere det nødvendige antall nylon ark i en 10 cm kultur fatet (vanligvis fire nylon ark kan innkvarteres per parabol).
- Make up gel på isen i følgende rekkefølge (250 mL totalvolum er nødvendig per nylon ark):
- 7 volumer av Rat-Tail Collagen
- 1 volum av filtrert 10x DMEM
- 1 volum av FCS
- 1. volum av DMEM 10% FCS / Glut
- Hvis løsningen er gul, nøytraliserer ved tilsetning av 0,1 M NaOH i 50 mL alikvoter inntil oppløsningen blir rosa.
- Til 250 pl av denne oppløsningen til hver nylon plater og inkuberes ved 37 ° C i en fuktet atmosfære på 5% CO2 i 30 min for å tillate gelen å angi.
- Utgjør 1% glutaraldehyd løsning i PBS. Tilsett 10 ml til hver 10 cm dyrkningsskål etter at gelen har satt seg, og inkuber ved 4 ° C i 1 time.
- Vask nylon ark 3 x i PBS og 1x i DMEM (10% FCS) / Glu, og inkuberes over natten i DMEM / Glu ved 4 ° C.
Raising organotypic gels på stålnett for invasjonen:
- Pre-forberede stillasnett ved å brette rustfritt stål ark i et stativ formasjon. Autoklav før bruk.
- Bruk tang sterilisert i etanol for å plassere en stålnett i hver brønn av en seks-brønners plate.
- Plasser en gel-belagt nylon ark med kollagen siden opp, på hver rute.
- Nøye overføre organotypic geler fra 24-brønns plate i den hevede nylon arket ved hjelp av en spatel sterilisert i etanol.
- Fylle brønnen med DMEM 10% FCS / Glut supplert med 10% FCS inntil nylon arket er i kontakt med mediet, men ikke under vann. Pass på at mediet ikke berører organotypic gel.
- Inkuber i 14 dager ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO 2, ved å erstatte mediet hver 2 dager.
Tre. Organotypic Fixation
- Fjern hele organotypic inkludert nylon ark fra godt og legg på plastfolie.
- Halvere organotypic og nylon ark med en ren disponibel skalpell og fikse begge omganger i formaldehyd i 24 timer ved romtemperatur.
- Bytt formaldehyd med 70% ethanol etter 24 timer og la over natten før innstøping i parafin, seksjonering, og farging.
4. Laser microdissection av Invasive Margin
- Seksjon til 10 mikrometer tykkelse på membran monterte lysbilder.
- Deparaffinize seksjoner ved å anvende xylen i 1 minutt, og deretter fjerne xylen og rette i 75% etanol i ytterligere 1 min.
- Fjern etanol og beis med 0,125% Cresyl Violet løsning i 1 min. Cresyl Violet høydepunkter epitelceller og tillater enkel diskriminering fra stroma.
- Fjern Cresyl Violet og bruke 100% etanol for en ytterligere 1 min før du skyller med 100% etanol. Tillat lysbilder lufttørke i 30 min.
- Gjennomføre laser microdissection bruker valgte plattformen (f.eks Leica AS system).
- Plasser glass-slide med farget delen som skal microdissected forsiden ned på mikroskopet scenen.
- Monter en 0,5 ml mikrorøret inn i samlingen kassetten og legge 50 mLcellelyseringsbuffer (for eksempel DNA, RNA eller protein lysis buffer) til hetten i hvilke microdissected vev vil samle seg.
- Under direkte visjon, bruker du styrespaken til å identifisere vev av interesse, og ved hjelp av programvaren grensesnittet, kommentere farget organiske delen, fremhever celler til å bli microdissected på tumor invasjon foran.
- Instruere laser til brann, som skal både klippe ut den uthevede delen og drive microdissected vevet inn i lokket på mikrosentrifuge tube.
- Når tilstrekkelig materiale er blitt samlet inn, tar ut samling kassetten, lukker mikrosentrifugerør og spinne forsiktig å trekke lyseringsbuffer til bunnen av røret.
- Plasser prøvene på is inntil mikrodisseksjon er fullført. Prosessprøver ved en passende metode for å utvinne analytten av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har benyttet den ovennevnte fremgangsmåte til flere kombinasjoner av CRC-cellelinjer og stromale celler. Ett eksempel som presenteres her er SW480 epitel CRC cellelinjer med primære humane ex vivo colonic fibroblaster. Tre-dimensjonale ko-kulturer blir konstruert (figur 1), utsettes for mikroskopi og laser-fangst mikrodisseksjon (figur 2), og analysert ved mikroRNA (miRNA) profilering (figur 3) for sammenligning av differensielt uttrykte miRNAs mellom celler ved invasiv tumor foran og de i de stratifiserte (ikke-invaderende) tumorsoner.
Figur 1. Skjematisk og fotografiske fremstillinger av organotypic modellen. CRC-celler sådd ut på et syntetisk stromale lag innehold fibroblaster og essensielle ekstracellulære matrix komponenter. Cellene er co-kultivert på en luft-væske-grensesnittet skapt ved å heve organotypic gel på en steril rustfritt stål rutenett. Klikk her for å se større bilde.
. Figur 2 LMD av SW480 CRC celler invadere organotypic stroma Cresyl Violet brukes til å markere CRC epitelceller (A).; invasive kreft øyene er da definert (B); før disseksjonen laser skjer (C), og den avkappede blir transportert til en oppsamlingsanordning (D). Ikke-invaderende celler og stromale celler er identifisert og isolert ved hjelp av den samme metode.w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. MikroRNA microarray data. Arrays ble skannet ved hjelp av en GenePix Pro 3.0.5 skanner for å oppdage Cy5 med en bølgelengde på 635 nm. Mean fluorescerende intensiteter ble normalisert og uttrykk forholdstall beregnet mellom laser microdissected invasive margin CRC celler og ikke-invasive margin CRC celler i de lagdelte epiteliale lag. Data ble sortert etter ganger endring og dataverdier + / - 2 ganger endring fra et representativt eksperiment presenteres viser differensial miRNA genuttrykk mellom invasive margin celler og ikke-invasive margin celler. Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en fremgangsmåte for spesifikt å isolere og karakterisere tumor-celler som har ervervet evnen til å invadere cancer assosiert stroma i de tidligste stadier av metastatisk progresjon i en 3-dimensjonal ko-kultur konstruksjon av epithelial og stromale celler.
Co-kultur modeller består av CRC epitelceller sidestilt med en syntetisk stroma inneholder ex vivo humane colonic fibroblaster ble brukt til å studere CRC invasjon i tre dimensjoner. Dette fysiologisk relevant system som etterligner in vivo-betingelser kan tilpasses for andre cancer scenarier ved å erstatte celler i epitelet og konstruksjon av stroma ved hjelp av ex vivo-fibroblaster av ulike anatomiske opprinnelse. En begrensning ved denne metoden er overforenkling av stromal rommet ved hjelp av fibroblastceller bare, som in vivo colonic stroma er en sammensatt og dynamisk vev med varierende cell bestanddeler. Et eksempel er den immun-avledede celler, som er til stede i betydelige mengder i primær tumor materiale, men fraværende fra denne modellen. Til tross for dette, pålitelig reproduserbarhet av denne modellen kombinert med den enkle som de cellebestanddeler kan eksperimentelt manipulert (f.eks ved over uttrykk eller knockdown av enkeltgener i epitel og stromal avdelinger), gjør dette til en verdifull og kostnadseffektiv modell sammenlignet med konvensjonelle in vivo eksperimentering.
I dette manuskriptet også vi demonstrert at CRC celler på svulsten invasiv foran i dette modellsystemet uttrykke ulike miRNA uttrykk profiler til identiske celler ikke på invasiv foran og ligger i lagdelte epitel lag. Dette representerer et bevis på konseptet at laser microdissected vev fra organotypic co-kultur modeller er en gyldig tilnærming til å studere tidlige prosessene i metastasering. Fokuset hanre var utelukkende på miRNA uttrykk, siden mirnas er sterkt medvirkende i patogenesen av mange kreftformer og deregulert uttrykk både i epithelial og kreft forbundet stromale celler har viktige konsekvenser i CRC 2,3,5. Videre mirnas er stabile til ekstraksjon og analyse fra konvensjonell arkivformalinfiksert parafin-embedded vev, noe som gjør dem kraftige biomarkører for diagnose og forutsigelse på menneskelig vev utsettes for konvensjonell behandling i rutine histopatologiske laboratorier 9,10. Men, kunne vår metodikk veldig lett tilpasses for genomisk og proteomikk analyser, som også markerer den allsidigheten av denne tilnærmingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne avslører ingen potensielle interessekonflikter.
Acknowledgments
MB er støttet av stipend midler fra en MRC fellesskap. KP og AHM støttes av tilskudd finansiering fra Wessex Medical Research and Cancer Research UK / RCS (England) (C28503/A10013). Vi er takknemlig for støtten fra University of Southampton histokjemi Research Unit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al. miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance. Cancer Res. , (2013).
- Bullock, M. D., et al. Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression. Cell Death Dis. 20 (4), (2013).
- Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. Measuring invasion in an organotypic model. Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).
- De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth. Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).
- Fries, K. M., et al. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).
- Moutasim, K. A., et al. Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis. J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).
- Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).
- Li, J., et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells. BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).
- Szafranska, A. E., et al. Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling. J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).
