Summary
Sentetik, doku mühendisliği kolorektal kanser modelleri, lazer microdissected stroma hücreleri ve moleküler profil invaziv ön ve kanserle ilişkili stromal hücre tümör hücreleri arasındaki ara yüzeyde ayırt edici karakterize biyoloji ve incelemek için bir yeni ve manuel olarak kullanılabilen bir yaklaşımı temsil etmektedir.
Abstract
Kolorektal kanser işgalci (CRC) hücreleri, onların kardeş hücrelerden kurtulma stromayı sızmak ve hücre dışı matris (ECM) bozulmasina kapasitesini elde etmiş. Bu hücre fenotipik ayrı grubun biyolojisini karakterize ölçüde metastatik kaskad sırasında erken olayların anlayışımızı geliştirmek olabilir.
Tümör işgali malign epitel ve kanser bağlantılı stroma arasında çift yönlü etkileşimler tarafından kolaylaştırdı dinamik bir süreçtir. Bu ko-kültür ve lazer mikro-disseksiyon teknikleri Organotipik kombine tümör stroma-arayüzünde hücreye özel tepkileri incelemek amacıyla.
Fibroblastlar gibi önemli stromal bileşenleri 3-dimentioanally kanser epitelyal hücrelere sahip ortak-kültürlenir, olduğu Organik tip modeller, yakın pH incelenecek istila ve kansere stroma etkileşimi sağlayacak yüksek manuel olarak kullanılabilen deneysel araçlardırysiological koşulları.
Lazer mikrodisseksiyon (LMD) mikron düzeyinde hassasiyetle tümör dokusu içinde çeşitli katmanlarının cerrahi diseksiyonu ve çıkarma, gerektiren bir tekniktir.
Genomik Transkriptomik ve epigenetik profilleme ile bu teknikleri birleştirerek biz tümör hücreleri istila ve stromal doku çevresindeki moleküler özelliklerine daha derin bir anlayış geliştirmek ve bunu yaparken de potansiyel yeni biyomarkerler ve CRC ilaç gelişimi için fırsatlar ortaya hedefliyoruz.
Introduction
Organik tip ko-kültürler bu temel hücre-dışı matris bileşenlerini ihtiva eden bir 1-3 kollajen jel habis epitel hücreler ve stromal hücrelerin yan yana 3-boyutlu olarak in vivo tümör mikro-ortam içinde yeniden yardım doku mühendisliği modellerdir. Prensip olarak tümör istilasını ölçülmesi için bir yöntem olarak tasarlanmış, organotypics in vivo hayvan modellerinde bağımlılığı azaltmak ve bu bezine akın eden hücre, bir mono-dağılmış halde 2-4 içine yapay karşıya hareket ettiği Transwell tahlilleri, in vitro olarak, diğer tekniklerin eksikliklerini kaçının. Fibroblastlar gibi, bu modellerde görülen stromal hücreleri dahil, malign yayılma ve metastaz 3-4 düzenlenmesinde tümör mikro-ortamınm rol yansıtır, ancak stroma fenotipik hetero gibi olduğu organotipik fizyolojik önemi maksimize etmek için modeller, hedef organ, anatomik olarak doğru bir ex vivomümkün olan her yerde 3,6 fibroblastlar dahil edilmelidir.
Organotypics tümör ve stromal hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için çok yönlü bir platform vardır ve giderek kimyasal inhibitörlerinin tümör işgali üzerine etkisini ve hedeflenen gen değişiklikleri 7,8 incelemek için yeni yollar kullanılır. Invaziv tümör marjı incelenmesi özellikle heyecan verici bir görünüm sergiliyor. Organotipik modellerinde, kurulan kolorektal kanser (CRC) hücre çizgileri, tipik olarak iyi tabakalı epitel tabakası üretir ve kesit olarak, hücre dışı matris (ECM) işgal kapasitesi kazanmış hücreler kolay bir şekilde görülebilir. Lazer mikrodiseksiyon kullanarak ve izolasyon bunları okuyan bu hücreleri ayıklanması tümör ve in vivo tümör ilişkili stromal hücrelerinin kurulan mikro-topografik düzensizliğin ışığında, kolorektal kanser metastaz kökeniyle ilgili önemli biyolojik anlayışlar ortaya koyabilir ve nasıl daha verimli olabilir hedeflenmiş. Benn aşağıdaki metodoloji, doku yazılı onam sağlanan örnekleri ve çalışma bağışlanan tüm hastalar bölgesel araştırma etik komitesi kurumlar tarafından onaylanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kolon Eksplantlarından Primer Fibroblast Kültürleri 1.. Kurulması
- Doğrudan cerrahi ameliyathanede normal insan kolon mukoza dokusu örnekleri elde edilir ve 7-10 içinde askıya PBS ml 100 birim / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve / ml Fungizone, 0.25 ug ile takviye edilmiştir.
- Laboratuarda, 10 cm'lik bir doku kültürü çanağı merkezinde numune yerleştirin ve PBS / Pen-strep / fungizon ile 3 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra aspire etmeyin.
- Steril forseps ve neşter ile (yaklaşık 2mm) küçük parçalar halinde doku kesilir ve 12 plaka olarak neşter ile çizilmiş bir haç merkezine her bir parçayı yerleştirin. Yapışması sağlamak için doku üzerinde hafifçe neşter sallayın.
- Kültür 750 ul numuneler birinci fibroblast büyüme ortamı subme gerekir, (DMEM,% 20 fetal buzağı serumu (FCS), 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 292 ug / ml L-glutamin ile takviye edilmiş)float etkinleştirme olmadan doku RGE. 2 günde yeniden besleme dışında önümüzdeki 5 gün içinde plaka rahatsız kaçının.
- Sonraki 5 gün boyunca yavaş yavaş fibroblastlar doku kenarından dışarı büyümeye başlar. Yaklaşık 7 gün, bu daha görünür olacak. Dışarı büyüyen yeterli fibroblastlar varsa Yaklaşık 3-4 hafta sonra, ve, her bir oyuğa 750 ul tripsin eklemek. Hücreler T-25 doku kültürü şişesi, havuz ve transfer (5-10 dk sürebilir) müstakil sonra.
2.. Organotipik Hazırlık
Fibroblast emprenye organotipik jelin hazırlanması:
- % 10 FCS ve 292 ug / ml L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM içinde Organotipik başına 5 x 10 5 hücre ihtiva eden bir fibroblast hücre süspansiyonu hazırlayın.
- Aşağıdaki oranlarda, buz üzerinde organotipik jeller Makyaj:
- Rat-Kuyruk Kollajen 7 hacim: Matrıgel karışımı (1:1)
- Süzüldü 10x DMEM 1 hacim
- FCS 1 hacim
- 5 x 10 5 fibroblastlar içeren fibroblast hücre süspansiyonu, 1 hacim
9 jeller (jel başına 1 mi) 10 ml hazırlamak ve kabarcıklarını önlemek için yavaşça karıştırın.
- , 24 oyuklu plakanın her oyuğuna 1 ml ilave edilir ve 37 ° C'de 1 saat boyunca kuluçkaya bırakınız Jeller ayarlaması için nemli bir atmosferde C °. 1 saat sonra, jellerin üzerine 1 ml DMEM (% 10 FCS) / Glut ekleyin ve gece boyunca inkübatör dönün.
- Ertesi gün, jeller ve 5 x 10 5 CRC epitel hücreleri ihtiva eden ortam plaka 1 ml üst aspirat ortamı.
Jel kaplı naylon Formlarının hazırlanması:
- , 1.5 cm boyutlarında otoklavlanmalıdır naylon sayfaları peşin, 1.5 cm x steril hazırlayın.
- Steril forseps kullanarak, 10 cm kültür çanak (genellikle 4 naylon yaprak çanak başına kalabilirler) naylon yaprak gerekli sayıda koyun.
- Aşağıdaki sırayla, buz üzerinde jel Makyaj (250 ul toplamhacim) naylon tabaka başına gereklidir:
- Rat-Kuyruk Kollajen 7 hacimleri
- Süzüldü 10x DMEM 1 hacim
- FCS 1 hacim
- 1 DMEM hacmi,% 10 FCS / Glut
- Çözelti, sarı ise, çözelti donene kadar 50 ul alikolar içinde 0.1 M NaOH ilave edilerek etkisiz hale getirir.
- Her bir naylon tabaka için, bu çözeltinin 250 ul ilave edin ve 37 ° C'de inkübe ° C jel ayarlaması için 30 dakika boyunca% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde.
- PBS içinde% 1 glutaraldehid çözelti hazırlayın. Jel belirledi bir kez, her 10 cm kültür tabağına 10 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Yıkama naylon levhalar PBS ve DMEM içinde 1x (% 10 FCS) / Glu içinde 3 kat ve 4 ° C de DMEM / Glu içinde gece boyunca inkübe
Işgali için çelik ızgaralar üzerine organotipik jeller Raising:
- Tripod oluşum içine paslanmaz çelik levhalar katlayarak iskele ızgaralarını hazırlıyor. Kullanmadan önce otoklav.
- Altı çukurlu bir levhanın her bir kuyuya bir çelik ızgara yerleştirmek için, etanol içinde sterilize forseps kullanın.
- Her ızgara üzerine, üst kollajen tarafı ile bir jel kaplı naylon yaprak yerleştirin.
- Dikkatlice etanol steril bir spatula kullanılarak yükseltilmiş naylon tabaka için 24 oyuklu plaka Organotipik jeller aktarın.
- Naylon tabaka ortamı ile temas halinde olduğu, ancak daldırılmamaktadır kadar% 10 FCS ile takviye edilmiş DMEM,% 10 FCS / Glut ile kuyu doldurun. Orta organotipik jel dokunmayın olmadığından emin olun.
- Her 2 günde bir ortam değiştirme,% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde 37 ° C'de 14 gün boyunca inkübe edin.
3.. Organotipik Fixation
- Kuyudan naylon tabaka dahil tüm organotipik çıkarın ve sarılmak film yerleştirin.
- Organotipik ve temiz bir tek neşter kullanılarak naylon sayfasını ikiye bölmek ve oda sıcaklığında 24 saat formaldehit içinde iki yarıyı düzeltmek.
- % 70 Ethan ile formaldehit değiştirinol, 24 saat sonra ve öncesinde, parafine gömme, kesme, boyama ve bir gece bekletin.
İnvaziv Margin 4. Lazer Diseksiyon
- Zarı üzerine 10 um-kalınlıkta Bölüm slaytlar.
- 1 dakika boyunca Ksilen uygulayarak Deparaffinize bölümleri, daha sonra, ilave 1 dakika boyunca iksilenin çıkması ve% 75 etanol içinde çözmek.
- 1 dakika boyunca% 0.125 kresil menekşe çözeltisi ile etanol ve leke çıkarın. Kresil Violet epitel hücreleri vurgular ve stromadan kolay ayrımcılığına izin verir.
- Kresil menekşesi çıkarın ve% 100 etanol ile yıkamadan önce, ilave 1 dakika boyunca% 100 etanol geçerlidir. 30 dakika boyunca kuru hava slaytlar izin verin.
- Seçilen platformu (örneğin Leica AS sistemi) kullanılarak lazer mikrodiseksiyon Davranış.
- Mikroskop sahnede yüzü aşağı microdissected gereken lekeli bölümü ile cam slayt yerleştirin.
- Toplama kaseti bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü monte edin ve 50 ul ilave edinmicrodissected doku toplayacak içine kapağa hücre liziz tamponu (örn., DNA, RNA ya da protein lizis tamponu).
- Direkt görüş altında, ilgi doku tespit joystick'i kullanın ve yazılım arayüzü kullanarak, tümör yayılması önünde microdissected edilecek hücreleri vurgulayarak, lekeli organik bölümü açıklama.
- Vurgulanan bir bölümünü kesmek gerekir hem de yangın lazer, talimat ve mikrosantrifüj tüp kap içine microdissected doku itmek.
- Bir kez yeterli malzeme elde edilmiştir, toplama kaseti çıkarmak mikrosantrifüj tüpü kapatmak ve tüpün altına lizis tamponu çekmek için yavaşça dönerler.
- Mikrodisseksiyon tamamlanana kadar buz üzerinde örnekleri yerleştirin. Uygun bir yöntem ile işlem örnekleri ilgilenilen analit çıkarmak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz CRC hücre hatları ve stromal hücrelerin çoklu kombinasyonlar için yukarıdaki yöntemi uyguladık. Burada sunulan bir örnek, primer insan ex vivo kolon fibroblastlar ile SW480 epitelyal hücre hatları olduğu, CRC. 3-boyutlu ko-kültürler istilacı tümör ön hücreler arasında farklı şekilde eksprese miRNAs karşılaştırılmasında mikroskopisi ve lazer yakalama mikro-kesim (Şekil 2) tabi tutuldu (Şekil 1), inşa edilmiş ve microRNA (miRNA) profil (Şekil 3) ile analiz edilir ve tabakalı (non-işgalci) tümör bölgelerinde bu.
Şekil 1. Şematik ve organotipik model fotografik temsilleri. CRC hücreleri içeren sentetik stromal tabaka üzerine ekilir fibroblastlar ve temel hücre dışı matris bileşenleri. Hücreler bir steril paslanmaz çelik ızgara üzerine organotipik jel yükseltmek tarafından oluşturulan bir hava-sıvı arayüzü ko-kültür. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
.. Organotipik stromayı işgalci SW480 CRC hücreleri Şekil 2 LMD Cresil Violet CRC epitel hücreleri (A) vurgulamak için kullanılır; invaziv tümör adaları daha sonra (B) tanımlanmıştır; Lazer diseksiyon (C) oluşur ve kesik parça bir toplama cihazı (D) 'ne önce. Olmayan istila hücreler ve stromal hücrelerin tespit edilmesi ve aynı metodoloji kullanılarak izole edilir.w.jove.com/files/ftp_upload/51475/51475fig2highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. MicroRNA mikrodizi verileri. Diziler 635 nm bir dalga boyunda tespit etmek için, bir Cy5 GenePix Pro 3.0.5 tarayıcısı kullanılarak tarandı. Ortalama floresan yoğunlukları normalize edilmiş ve lazer arasındaki hesaplanan anlatım oranları tabakalı epitel tabakalarında invaziv marjı CRC hücreleri ve non-invaziv marjı CRC hücreleri microdissected. Invaziv marjı hücreleri ve non-invaziv marjı hücreleri arasındaki fark miRNA gen ifadesini gösteren sunulmaktadır temsili bir deney 2 kat değişim - Veri kat değişimi ve veri değerleri + / olanlar oldu. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada spesifik olarak izole edilmesi ve epitel hücreler ve stromal hücrelerin bir 3 boyutlu ko-kültür yapı metastatik ilerlemesi en erken aşamaları sırasında kanser bağlantılı stroma işgal etme kapasitesine kazanmış tümör hücrelerini karakterize etmek için bir yöntem tarif eder.
Ex vivo insan kolonik fibroblastlar ihtiva eden bir sentetik stroma ile yan yana CRC epitel hücrelerinin oluşan Co-kültür modelleri 3-boyutlu olarak CRC işgali yapısını incelemek için kullanılmıştır. In vivo koşullarında taklit epitel hücreleri ve çeşitli anatomik ikame kökenlerden ex vivo fibroblastlar kullanılarak stroma yapımında diğer kanser senaryoları için uyarlanabilir Bu fizyolojik olarak uygun sistem. In vivo kolon stroma değişen cel ile karmaşık ve dinamik bir doku olarak bu yaklaşımın bir sınırlama sadece fibroblast hücreleri kullanılarak stromal bölmesinin oversimplificationl bileşenler. Bir örnek, primer tümör malzeme içinde önemli miktarlarda mevcut, ancak bu modelden bulunmadığına bağışıklık türetilmiş hücreler vardır. Buna rağmen, kolaylığı ile birlikte, bu modelin güvenilir tekrarlanabilirliği hangi hücre bileşenleri deneysel (epiteliyal ve stromal bölmelerde ayrı ayrı genlerin ekspresyonu ya da devirme ile üzerinde örneğin) manipüle edilebilir, bu değerli ve düşük maliyetli bir modeli karşılaştırıldığında yapmak in vivo deney, geleneksel için.
Bu yazıda da bu model sistemde tümör invaziv ön CRC hücreler invaziv ön aynı hücrelere farklı MiRNA ekspresyon profillerini değildir ifade tabakalı epitelyum katmanlarda yer gösterdi. Bu organotipik ko-kültür modelleri lazer microdissected doku metastaz erken süreçleri incelemek için geçerli bir yaklaşım olduğunu konseptinin bir kanıtı temsil eder. Odak oYeniden miRNA'ların kuvvetle sayıda kanserlerin patogenezinde beri, miRNA ifade münhasıran ve epitel ve kanser ilişkili stromal hücreler CRC 2,3,5 önemli sonuçları var hem ifade kuralsız. Ayrıca miRNAs onları laboratuarlarda rutin histopatolojik 9,10 geleneksel işleme tabi insan dokusu üzerinde teşhis ve prognoz için güçlü biyolojik yapım geleneksel arşiv formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ekstraksiyonu ve analizi için stabildir. Ancak, bizim metodoloji çok kolay ayrıca bu yaklaşımın çok yönlülüğü vurgulayan, genomik ve proteomik analizi için adapte olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışmaları anlatmaktadır.
Acknowledgments
MB, MRC dostluk hibe finansmanı ile desteklenmektedir. KP ve AHM Wessex Tıbbi Araştırma ve Birleşik Krallık Kanser Araştırma / RCS (İngiltere) (C28503/A10013) hibe finansmanı ile desteklenmektedir. Biz Southampton Histokimyas Araştırma Birimi Üniversitesi'nin destek için müteşekkiriz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colorectal cancer cell lines - example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
References
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al. miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance. Cancer Res. , (2013).
- Bullock, M. D., et al. Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression. Cell Death Dis. 20 (4), (2013).
- Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. Measuring invasion in an organotypic model. Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).
- De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth. Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).
- Fries, K. M., et al. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).
- Moutasim, K. A., et al. Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis. J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).
- Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).
- Li, J., et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells. BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).
- Szafranska, A. E., et al. Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling. J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).
