Summary

Sviluppo di un Varicella-Zoster immunità cellulo-mediata specifica-Virus-IFN γ ELISpot test per valutare seguito cordone ombelicale trapianto di sangue

Published: July 09, 2014
doi:

Summary

Generazioni di nuovi saggi funzionali quali interferone gamma (IFN-γ) ELISpot, che rilevano la produzione di citochine a livello di singola cellula e forniscono sia la caratterizzazione quantitativa e qualitativa delle risposte delle cellule T possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria cellulo-mediata contro varicella zoster virus (VZV).

Abstract

Varicella zoster (VZV) è una causa importante di morbilità e mortalità dopo trapianto di sangue del cordone ombelicale (UCBT). Per questo motivo, la profilassi antierpetico è amministrato sistematicamente ai destinatari UCBT pediatrici per evitare complicazioni associate con infezione VZV, ma non vi è un consenso prove basate forte che definisce la sua durata ottimale. Poiché cellule T mediata è responsabile del controllo di infezione VZV, valutare la ricostituzione di VZV specifiche risposte delle cellule T seguente UCBT potrebbe fornire indicazioni sul fatto profilassi possono essere mantenute o possono essere sospesi. A tal fine, un VZV specifico interferone gamma (IFN-γ) immunospot enzimatico (ELISpot) saggio è stata sviluppata per caratterizzare la produzione di IFN-γ da linfociti T in risposta alla stimolazione in vitro con vaccino vivo attenuato irradiato VZV. Questa analisi fornisce una misurazione rapida, riproducibile e sensibile di VZV specifico cell immunità adatto per monitorare la ricostituzione del VZV dell'immunità specifica in ambito clinico e di valutare la risposta immunitaria agli antigeni VZV mediata.

Introduction

La prima volta nel 1989 UCBT è sempre più utilizzato come parte del trattamento di vari disturbi del sangue neoplastiche e non neoplastiche in bambini 1. VZV è un alphaherpesvirus umana citopatico che provoca due malattie diverse, varicella (dopo l'infezione primaria) e dell'herpes zoster (dopo la riattivazione). Dopo l'infezione primaria, VZV persiste per tutta la vita dell'ospite riparata entro nervi sensoriali del gangli spinali. Una delle complicanze infettive più minacciosi seguenti UCBT è associato con VZV 2-4. Nel nostro centro clinico, in assenza di VZV la profilassi, l'incidenza cumulativa di malattia VZV malattia da VZV a 3 anni postUCBT era del 46% 2. In questi pazienti, de novo infezione con o riattivazione di VZV è spesso associato con diffusione viscerale al sistema nervoso centrale, polmoni e fegato 5-7. Come profilassi conseguenza, aciclovir, valaciclovir e famciclovir viene comunemente somministrato a UBCT destinatari 8,9. Tuttavia, questa strategia di trattamento non tiene conto del potenziale protettivo di VZV linfociti T specifici o la cinetica di ricostituzione del VZV specifiche risposte delle cellule T. Potenziali problemi associati con l'uso crescente di profilassi antierpetico lungo termine includono a) overtreatment paziente; b) lo sviluppo di resistenza ai farmaci antivirali 10,11; c) violazione di VZV specifico ricostituzione immunitaria 12,13. Poiché il rilevamento di VZV funzionali specifici linfociti T è correlata con la presenza di una protezione a lungo termine da VZV e un miglior risultato clinico 4,14,15, monitoraggio delle cellule mediata risposte immunitarie contro VZV nel periodo post-trapianto potrebbe comportare un uso più razionale antivirale trattamento consentendo medici di distinguere i pazienti che potrebbero trarre vantaggio da VZV profilassi da coloro il cui sistema immunitario è in grado di controllare la replicazione VZV 4,13.

Il ELISpot saggio IFN-γ è ampiamente usato per le cellule monitoraggio risposte immunitarie mediate in una varietà di sistemi sperimentali e condizioni cliniche. Macchie sono generate a seguito clivaggio di un substrato cromogenico, generando un precipitato visibile e stabile al sito di reazione. Ogni singolo spot rappresenta quindi l'impronta di una cella producenti citochine individuale. IFN-γ ELISpot non solo misura la capacità delle singole cellule ex vivo per produrre IFN-γ in risposta alla stimolazione in vitro con antigene affine, ma fornisce anche una stima della frequenza di rispondere cellule in una data popolazione cellulare 16,17. Oltre alla sua elevata sensibilità, IFN-γ ELISpot è semplice da eseguire, rendendo possibile il suo impiego nel contesto di protocolli clinici personalizzati volti a guidare l'inizio o cessazione del trattamento antivirale. La procedura di seguito dettagliata descries un saggio ELISpot che è specificamente progettato per rilevare e misurare la produzione di IFN-γ da parte delle cellule mononucleate del sangue periferico dopo stimolazione in vitro con antigeni derivati ​​VZV.

Protocol

Questo protocollo di ricerca è stato approvato dal Consiglio di CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canada, dove è stato condotto lo studio Istituzionale valutazione etica. Il consenso informato è stato chiesto e ottenuto da tutti i partecipanti allo studio, i loro genitori o tutori legali. Tutte le procedure eseguite nei giorni 1 e 2 devono essere eseguite in condizioni sterili (cioè sotto una cappa a flusso laminare). Procedure di sicurezza standard per il trattamento del sangue umano devono essere rigo…

Representative Results

Il protocollo ELISpot IFN-γ sopra descritto è stato sviluppato ed ottimizzato nel nostro laboratorio per misurare l'entità e la qualità delle cellule risposte immunitarie mediate dirette contro VZV 4. Diverse fonti di antigene VZV possono essere utilizzati per la fase di stimolazione. Questi includono: a) disponibile in commercio dei detergenti estratti inattivati ​​da VZV infettate cellule Vero 18; b) le piscine di sovrapposizione peptidi sintetici da specifiche proteine ​​codifica…

Discussion

Modifiche e risoluzione di problemi: saggi IFN-γ ELISpot sono stati utilizzati per esaminare le risposte immunitarie mediate da cellule contro una varietà di patogeni microbici, inclusi tipo virus dell'immunodeficienza umana 1 (HIV-1) 24,25, virus dell'epatite C (HCV) 26, 27, e Mycobacterium tuberculosis 28,29, solo per citarne alcuni. Qui abbiamo descritto lo sviluppo di un ELISpot test IFN-γ per misurare l'immunità cellulare contro, con la speranza di definire …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare i partecipanti allo studio e ai loro genitori. Vorremmo anche ringraziare il Dott. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canada) per l'accesso al suo lettore ELISpot, Dr. Lubo Alexandrov per l'analisi statistica, e Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois e Martine Caty per esperto tecnico assistenza. Sostenuto da finanziamenti le Fonds d'opération pour les projets de recherche clinique et d'evalution des tecnologie (CHU Sainte-Justine) per HS e PO, per la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau, e dal Leukemia & Lymphoma Society of Canada. ISF è stato sostenuto da borse di studio la Fondation CHU Sainte-Justine e le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS). AJG è stato il destinatario di borse di studio dal Dipartimento di Microbiologia, Immunologia e Malattie infettive, Université de Montréal (Gabriel-Marquis borsa di studio), FRQS, e la Canadian Institutes of Health Ricerca (CIHR). NM è stato supportato da la Fondation CHU Sainte-Justine, la Fondazione Cole, e FRQS.

Materials

Leucocep tube VWR 89048-936/89048-932 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. 
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-1440-02 Protect from light.
Benzonase nuclease Novagen 70746-3 Keep at -20 C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate Millipore MSIPS4W10 Sterile with pore size of 0.45 µm. 
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody BD Biosciences 551221 NIB42 clone. 
Pepmix VZV IE63  JPT Peptide Technologies PM-VZV-IE63 Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody BD Biosciences 554550 4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase  Bio-Rad Life Science 170-3554 Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT Bio-Rad Life Science 170-6432 Protect from light.

References

  1. Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
  2. Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
  3. Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
  4. Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
  5. Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
  6. Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
  7. Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients – a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
  8. Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation–a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
  9. Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
  10. Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
  11. Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
  12. Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
  13. Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
  14. Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
  15. Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
  16. Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
  17. Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
  18. De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
  19. Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
  20. Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
  21. Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
  22. Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
  23. Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
  24. Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
  25. Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
  26. Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
  27. Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
  28. Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
  29. Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
  30. Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
  31. Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
  32. Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  33. Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
  34. Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
  35. Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
  36. Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
  37. Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
  38. Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
  39. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  40. Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
  41. Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
  42. Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
  43. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
  44. Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
  45. Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
  46. Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
  47. Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
  48. Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).

Play Video

Cite This Article
Salem Fourati, I., Grenier, A., Jolette, É., Merindol, N., Ovetchkine, P., Soudeyns, H. Development of an IFN-γ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation. J. Vis. Exp. (89), e51643, doi:10.3791/51643 (2014).

View Video