Summary

Desenvolvimento de uma varicela-zoster imunidade mediada por células específicas do vírus ELISpot Ensaio para Avaliar-γ IFN Após Cordão Umbilical Transplante de Sangue

Published: July 09, 2014
doi:

Summary

Novel gerações de ensaios funcionais, tais como o interferão gama (IFN-γ) ELISpot, que detectam a produção de citoquinas ao nível de células individuais e fornecer tanto a caracterização quantitativa e qualitativa das respostas das células T pode ser utilizado para avaliar as respostas imunes mediadas por células contra a varicela zoster vírus (VZV).

Abstract

A varicela zoster (VZV) é uma importante causa de morbidade e mortalidade após um transplante de sangue do cordão umbilical (UCBT). Por esta razão, a profilaxia anti-herpética é administrado sistematicamente aos destinatários UCBT pediátricas para prevenir as complicações associadas à infecção por VZV, mas não há evidência com base consenso forte, que define a sua duração óptima. Porque a imunidade mediada por células T é responsável pelo controlo de infecção VZV, avaliando a reconstituição de VZV respostas de células T específicas a seguir UCBT poderia fornecer indicações quanto ao facto de a profilaxia deve ser mantido ou pode ser descontinuado. Para este fim, um interferão gama específica de VZV (IFN-γ) enzyme-linked immunospot (ELISPOT) foi desenvolvido para caracterizar a produção de IFN-γ por linfócitos T em resposta à estimulação in vitro com uma vacina de VZV vivo atenuado irradiado. Este ensaio proporciona uma medição rápida, reprodutível e sensível de VZV c específicaell imunidade mediada adequado para o monitoramento da reconstituição da imunidade específica VZV em um ambiente clínico e avaliar a capacidade de resposta imunitária a antigénios VZV.

Introduction

Primeiro realizada em 1989, UCBT é cada vez mais utilizado como parte do tratamento de várias doenças do sangue neoplásicas e não-neoplásicas em crianças 1. VZV é um alphaherpesvirus humano citopático que causa duas doenças diferentes, varicela (após a infecção primária) e herpes zoster (após reativação). Após a infecção primária, VZV persiste durante toda a vida do hospedeiro abrigada dentro de nervos sensoriais dos gânglios da raiz dorsal. Uma das complicações infecciosas mais ameaçadores seguintes UCBT está associada com VZV 2-4. No nosso centro clínico, na ausência de VZV profilaxia, a incidência cumulativa de doença VZV VZV doença em 3 anos foi de 46% postUCBT 2. Nesses pacientes, a infecção de novo com ou reativação do VZV é freqüentemente associada com a disseminação visceral para o sistema nervoso central, pulmões e fígado 5-7. Como resultado, o aciclovir, o valaciclovir ou famciclovir profilaxia é vulgarmente administrada em UBDestinatários CT 8,9. No entanto, esta estratégia de tratamento não ter em conta o potencial protector dos linfócitos T específicos de VZV ou a cinética de reconstituição de VZV respostas de células T específicas. Os problemas potenciais associados com o uso crescente de profilaxia anti-herpéticas longo prazo incluem a) overtreatment paciente; b) o desenvolvimento de resistência ao medicamento antiviral 10,11; e c) diminuição da VZV reconstituição imune específica 12,13. Como a detecção de VZV linfócitos T específicos funcionais correlaciona-se com a presença de proteção a longo prazo contra a infecção VZV e melhor evolução clínica 4,14,15, monitoramento mediadas por células respostas imunes dirigidas contra VZV durante o período pós-transplante pode resultar em um uso mais racional de antiviral tratamento, permitindo que os médicos a distinguir os pacientes que se beneficiariam de VZV profilaxia daqueles cujo sistema imunológico é capaz de controlar a replicação VZV 4,13.

O ensaio ELISPOT de IFN-γ é amplamente utilizado para a monitorização de células de respostas imunes mediadas por uma variedade de sistemas experimentais e condições clínicas. Pontos são gerados após a clivagem de um substrato cromogénico, gerando um precipitado visível e estável no local da reacção. Cada foco individual representa, assim, a presença de uma célula produtora de citoquina indivíduo. IFN-γ ELISpot não só mede a capacidade das células individuais ex vivo para a produção de IFN-γ em resposta à estimulação in vitro com antigénio relacionado, mas também fornece uma estimativa da frequência de resposta de células numa determinada população celular 16,17. Para além da sua elevada sensibilidade, o IFN-γ ELISpot é simples de realizar, tornando possível a sua utilização no âmbito dos protocolos clínicos personalizados destinados a orientar a iniciação ou paragem do tratamento anti-viral. O procedimento detalhado abaixo descrevendoes um ensaio ELISPOT que é projetado especificamente para detectar e medir a produção de IFN-γ pelas células mononucleares do sangue periférico após estimulação in vitro com antígenos VZV derivados.

Protocol

Este protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética Ética em Pesquisa do CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, no Canadá, onde o estudo foi realizado. O consentimento informado foi procurado e obtido de todos os participantes do estudo, seus pais ou responsáveis ​​legais. Todos os procedimentos realizados nos dias 1 e 2 deve ser realizado sob condições estéreis (isto é, sob uma câmara de fluxo laminar). Procedimentos de segurança padrão para o manuseio de sangue humano devem ser estrita…

Representative Results

O protocolo de ELISpot de IFN-γ detalhado acima, foi desenvolvido e optimizado no nosso laboratório para medir a magnitude e a qualidade das respostas celulares imunes mediadas dirigidos contra VZV 4. Várias fontes de antigénio VZV pode ser utilizado para o passo de estimulação. Estes incluem: a) detergentes comercialmente disponíveis extratos inativadas de VZV infectadas células Vero 18; b) piscinas de sobreposição de peptídeos sintéticos a partir de proteínas codificadas VZV específ…

Discussion

Modificações e resolução de problemas: ensaios de IFN-γ ELISpot têm sido usados ​​para avaliar as respostas imunes mediadas por células dirigidas contra uma variedade de agentes patogénicos microbianos, incluindo o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) 24,25, vírus da hepatite C (HCV), 26, 27, e Mycobacterium tuberculosis 28,29, só para citar alguns. Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de um ensaio ELISPOT IFN-γ para medir a imunidade celular contr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer os participantes do estudo e seus pais. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canadá) para o acesso ao seu leitor ELISpot, Dr. Lubo Alexandrov para análise estatística, e Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois e Martine Caty para especialista técnico assistência. Apoiada por doações de le Fonds d'opération pour les Projets de Recherche et d'Clinique des evalution tecnologias (CHU Sainte-Justine) para HS e PO, por la Fondation Centre de Cancerologie Charles-Bruneau, e pelo Leukemia & Lymphoma Society of Canadá. ISF foi apoiado por bolsas de estudo de la Fondation CHU Sainte-Justine e le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS). AJG foi o destinatário de bolsas de estudo do Departamento de Microbiologia, Imunologia & Infecciologia, Université de Montréal (Gabriel-Marquês de Bolsas de Estudo), FRQS, e do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). NM foi apoiado por la Fondation CHU Sainte-Justine, a Fundação Cole, e FRQS.

Materials

Leucocep tube VWR 89048-936/89048-932 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. 
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-1440-02 Protect from light.
Benzonase nuclease Novagen 70746-3 Keep at -20 C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate Millipore MSIPS4W10 Sterile with pore size of 0.45 µm. 
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody BD Biosciences 551221 NIB42 clone. 
Pepmix VZV IE63  JPT Peptide Technologies PM-VZV-IE63 Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody BD Biosciences 554550 4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase  Bio-Rad Life Science 170-3554 Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT Bio-Rad Life Science 170-6432 Protect from light.

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Cite This Article
Salem Fourati, I., Grenier, A., Jolette, É., Merindol, N., Ovetchkine, P., Soudeyns, H. Development of an IFN-γ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation. J. Vis. Exp. (89), e51643, doi:10.3791/51643 (2014).

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