Summary
Nya generationer av funktionella analysmetoder såsom gamma-interferon (IFN-γ) ELISpot, som upptäcker cytokinproduktion på enskild cellnivå och ger både kvantitativ och kvalitativ karakterisering av T-cellsvar kan användas för att bedöma cellmedierade immunsvar mot varicella zoster virus (VZV).
Abstract
Varicella zoster-virus (VZV) är en betydande orsak till morbiditet och mortalitet efter navelsträngsblod transplantation (UCBT). Därför är antiherpetic profylax administreras systematiskt till pediatriska UCBT mottagare för att undvika komplikationer i samband med VZV-infektion, men det finns inga starka, evidensbaserad samsyn som definierar dess optimala behandlingstiden. Eftersom T-cellmedierad immunitet är ansvarig för kontroll av VZV-infektion, bedöma beredning av VZV specifika T-cellsvar efter UCBT skulle kunna ge indikationer om huruvida profylax bör behållas eller kan avbrytas. För detta ändamål har en VZV-specifik gammainterferon (IFN-γ) enzymkopplad immunospot (ELISpot)-analys utvecklades för att karakterisera IFN-γ-produktion genom T-lymfocyter som svar på stimulering in vitro med bestrålade levande försvagat VZV-vaccin. Denna analys ger en snabb, reproducerbar och känslig mätning av VZV specifik cell medierad immunitet lämplig för övervakning av beredning av VZV specifik immunitet i en klinisk miljö och bedöma immunförsvar till VZV-antigen.
Introduction
Först utfördes 1989 och är UCBT alltmer används som en del i behandling av olika neoplastiska och icke-neoplastisk blodsjukdomar hos barn 1. VZV är ett cytopatiskt mänsklig alfaherpesvirus som orsakar två olika sjukdomar, varicella (efter primärinfektion) och herpes zoster (efter reaktivering). Efter primärinfektionen, kvarstår VZV under hela livet i värd skyddad inom sensoriska nerver av dorsala rotganglier. En av de mest hotande infektiösa komplikationer efter UCBT förknippas med VZV 2-4. I vår kliniska center, i avsaknad av VZV profylax, den kumulativa incidensen av VZV sjukdom VZV sjukdomen på 3 år postUCBT var 46% 2. Hos dessa patienter är de novo infektion eller reaktivering av VZV ofta förknippade med visceral spridning till centrala nervsystemet, lungor och lever 5-7. Som ett resultat, aciklovir, valacyclovir eller famciklovir profylax är allmänt administreras till UBCT mottagare 8,9. Men denna behandlingsstrategi inte hänsyn till den skyddande potentialen hos VZV-specifika T-lymfocyter eller kinetiken för upplösning av VZV-specifika T-cellsvar. Potentiella problem i samband med den ökade användningen av långsiktiga antiherpetic profylax inkluderar a) patienten överbehandling; b) utveckling av antiviral resistens 10,11; och c) nedskrivningar av VZV specifikt immun beredning 12,13. Eftersom detektering av funktionella VZV specifika T-lymfocyter korrelerar med förekomsten av långsiktigt skydd mot VZV infektion och förbättrat kliniskt resultat 4,14,15, övervaka cellmedierade immunsvar mot VZV under perioden efter kan leda till en mer rationell användning av antivirala behandling genom att möjliggöra läkare för att skilja patienter som skulle ha nytta av VZV profylax från dem vars immunsystem kan styra VZV replikering 4,13.
I IFN-γ ELISpot analysen används ofta för övervakning cellmedierade immunsvar i olika experimentella system och kliniska tillstånd. Ställen genereras vid klyvning av ett kromogent substrat, vilket genererar en synlig och stabil fällning vid platsen för reaktionen. Varje enskild plats representerar därmed fotavtryck av en individuell cytokin-producerande celler. IFN-γ ELISpot mäter inte enbart förmågan hos individuella celler ex vivo för att producera IFN-γ som svar på stimulering in vitro med motsvarande antigen, men det ger också en uppskattning av frekvensen för svarande celler i en given cellpopulation 16,17. Förutom sin höga känslighet, är IFN-γ ELISpot enkelt att utföra, vilket gör dess användning möjlig i samband med personlig kliniska protokoll som syftar till att styra initiering eller upphörande av antiviral behandling. Det förfarande som beskrivs nedan som beskriveres en ELISpot analys som är särskilt utformad för att upptäcka och mäta produktionen av IFN-γ från perifera mononukleära blodceller efter in vitro stimulering med VZV härledda antigener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna forskning protokoll godkändes av Institutional etikprövningsnämnden i CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Kanada, där studien genomfördes. Informerat samtycke söktes och erhölls från alla studiedeltagare, deras föräldrar eller vårdnadshavare. Alla procedurer utförs på dag 1 och 2 skall utföras under sterila förhållanden (dvs. under ett laminärt flöde huva). Standard säkerhetsrutiner för hantering av mänskligt blod bör följas noga.
1. Beläggning av plattor
- Permeabilize polyvinylidendifluorid (PVDF)-membran på botten av 96-brunnars Multiscreen IP vit ELISpot plattorna genom tillsats till varje brunn 20 | il av 35% etanol under 1 min. Membran bör bli något genomskinligt.
- Tvätta brunnarna tre gånger med 200 | il av 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) med användning av en multichannel pipett eller liknande anordning. Detta steg är viktigt med tanke på att etanolrester kan påverka cellernas livskraft och bindning av infångningsantikropp. ELISpot plattor är ömtåliga och bör hanteras varsamt: rekommenderas inte användning av en automatiserad plattbricka.
- Coat brunnarna med 10 pl av renad mus-anti-human IFN-γ infångningsantikropp utspädd i 1 x PBS till en slutlig koncentration av 10 | ig / ml. Täck plattorna med vanlig plastfolie och inkubera över natten vid 4 ° C.
2. Blockering Plates
- Töm brunnarna, peka på dem torra, och tvätta plattorna fem gånger med 200 l av 1 x PBS.
- Fyll brunnarna med 200 | il fullständigt RPMI 1640-medium och inkubera plattorna under 2 h vid 37 ° C (blockeringssteg).
- Tvätta plattorna 5 gånger med 200 ^ il 1 x PBS och hålla brunnarna full av 1 x PBS tills cellerna är klara att pläteras.
3. Cell Plating och stimulering
- Förbered peripheral mononukleära blodceller (PBMC) från venösa blodprov humana genom centrifugering på Ficoll-Paque-gradienter med användning av standardförfaranden. Alternativt, med hjälp av standardmetoder, tina portioner av PBMC fryst i flytande kväve. Efter det sista centrifugerings, återsuspendera cellerna i en slutlig koncentration av 2 x 10 6 celler / ml och inkubera över natten vid 37 ° C under en 5% CO2 atmosfär i en vattenmantlad inkubator.
- Avlägsna PBMC från inkubatorn och återsuspendera dem i en slutlig volym av 5 ml av komplett RPMI-1640-medium.
- Inkubera PBMC i närvaro av 10 | il av gentekniskt endonukleas från Serratia marcescens under 5 min vid rumstemperatur.
- Ta en 50 ul alikvot av PBMC och blanda med 50 pl trypanblått. Räkna celler och uppskatta% viabilitet med användning av en hemocytometer och mikroskopisk undersökning (färgexklusion metod). Olika automatiserade metoder för cellräkning och bedömning av cellernas livskraft kan alså användas. PBMC bör vara> 95% livskraftiga. Kassera prov när lönsamheten är lägre än 95%.
- Centrifugera PBMC vid 700 xg under 5 minuter, kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i AIM-V-medium kompletterat med 2% (vol / vol) inaktiverat humant serum (HIS) vid en slutlig koncentration av 2 x 10 6 celler / ml. Förvaras vid 37 ° C tills stimuleringsblandningar läggs till plattan.
- Lägg till brunnarna, en droppe i taget, 100 pl av lämplig stimulans blandningen. Tre stimuleringsblandningar bör användas enligt nedan:
- Använd AIM-V-medium kompletterat med 2% (vol / vol) inaktiverat humant serum (IHS) som negativ kontroll.
- Använd anti-CD3 monoklonal antikropp (klon OKT3) utspätt i AIM-V-medium kompletterat med 2% (vol / vol) IHS till en slutlig koncentration av 0,5 | ig / ml som positiv kontroll).
- Använd VZV-antigen, i form av antingen γ-bestrålade (10.000 Gy, 30 min exponeringstid) levande försvagat VZV-vaccin (1,350 plackbildande enheter [PFU] / ml) spädted 1:200 i AIM-V-medium kompletterat med 2% (vol / vol) IHS) eller 1 ug av en ekvimolär blandning av 67 peptider (15 aminosyrarester) syntetiserade baserat på sekvensen av den VZV omedelbart tidigt (IE63) fosfoprotein . Styr bestrålning effekt genom att övervaka frånvaron av synliga cytopatiska effekter efter 4 dagar i PBMC kulturer.
- Förbered alla brunnar i duplikat.
- Lägg till brunnarna, en droppe i taget, 100 | il av celler som framställts i steg 5,4 till de lämpliga brunnarna. Två brunnar bör lämnas utan celler (negativ kontroll). Inkubera under 20 h vid 37 ° C under en 5% CO2 atmosfär i en vattenmantlad inkubator. Inte skaka, flytta, eller stapla plattorna ovanpå varandra under inkubation.
4. Spot Utveckling och Detection
- Kasta de celler och tvätta plattorna 10x med 1x PBS kompletterad med 0,05% (v / v) Tween 20 (PBST). Tween 20 hjälper till att lösgöra celler som har anslutit sig till PVDF migmbrane efter inkubation över natten.
- Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 100 pl av 0,5 mg / ml biotin-konjugerat anti-IFN-γ-monoklonal antikropp (4S.B3 klon) utspätt i 1 x PBS innehållande 0,5% (vikt / volym) bovint serumalbumin (BSA). Inkubera plattorna under 2 h vid rumstemperatur.
- Tvätta brunnarna 6x med PBST, och lägga till varje brunn 100 | il av streptavidin conjugatd med alkaliskt fosfatas spädd 1:1000 i 1 x PBS innehållande 0,5% (vikt / volym) BSA. Täck plattorna och inkubera under en timme vid rumstemperatur.
- Tvätta plattorna 3 gånger med PBST och 3 gånger med 1 x PBS. Addera 100 pl av en 5-brom-4-klor-3-indolyl-fosfat (BCIP) / nitroblått-tetrazoliumklorid (NBT)-substratlösning och inkubera 5 min vid rumstemperatur.
- Tvätta plattorna under rinnande destillerat vatten. Ta bort den undre sektionen av ELISpot plattan och tvätta båda sidorna av membranet med destillerat vatten. Lufttorka plattorna.
- Undersök brunnarna och räkna fläckarna med hjälp av en stereoskopisk dissection mikroskop eller skanna plattorna med hjälp av en automatiserad plats motverka. Förvara plattorna mörkt om de inte kan undersökas på samma dag.
- Medelvärdet för antalet fläckar inräknade i motsvarande duplikatbrunnar och subtrahera antalet fläckar räknades i de negativa kontrollbrunnarna (inga celler) från antalet fläckar räknades i testbrunnarna.
- Uttryck av IFN-γ produktion som antalet fläck-bildande enheter (SFU) per 10 6 PBMC.
- Betrakta att testprover är positiva om antalet SFU är> 50 per 10 6 PBMC och två standardavvikelser (SD) över den negativa kontrollen (celler + AIM-V-medium kompletterat med 2% (vol / vol) IHS).
- Använd ett värde på 400 SFU per brunn när fläckarna är för många för att räknas.
- Testa om ELISpot uppgifter är normalfördelade eller inte med hjälp av Kolmogorov-Smirnov test. När data är normalfördelade, utföra statistiska jämförelser med hjälp av Students t test (2 grupper) eller ANOVA och Bonferroni-post-test (multipla jämförelser). Om data inte är normalfördelade, använda Mann-Whitney U-test (två grupper) eller Kruskal-Wallis test och Dunns post-test (multipla jämförelser).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den IFN-γ ELISpot protokoll i detalj ovan har utvecklats och optimerats i vårt laboratorium för att mäta storleken och kvaliteten av cellmedierade immunsvar riktade mot VZV 4. Olika källor av VZV-antigen kan användas för stimulering steget. Dessa inkluderar: a) kommersiellt tillgängliga rengöringsmedel inaktiverade utdrag från VZV infekterade Vero-celler 18; b) pooler av överlappande syntetiska peptider från specifika VZV kodade proteinerna, inklusive IE63 15 och ORF4 19; c) levande försvagat varicella zoster-vaccin 20; och d) UV-inaktiverade beredningar av VZV-antigener från supernatanten av störd VZV infekterade MRC celler 14. I vårt fall, föredrog utspädningar av levande försvagat VZV-vaccin var över cellodling härrör VZV för att försäkra enhetlighet i antigenkälla och förberedelse och för att begränsa kulturen och manipulation av levande vildtyp VZV-stammar i en klinisk miljö där nosokomial transmission är ett allvarligt problem 10. Dessutom var γ bestrålning föredra framför UV-inaktivering 21 på grund av den jämförande precision med vilken doser av γ-strålning kan levereras och därför, till skillnad från UV, γ-strålar tränger effektivt förseglade VZV innehåller flaskor. Bestrålning av virala förråd ledde till genomgående högre uppskattning av frekvensen av VZV-specifika IFN-γ-producerande celler i PBMC-prover erhållna från en frisk donator vid alla utspädningar av VZV-antigen testades (figur 1). Detta är möjligen en följd av den begränsning av cytopatiska effekter inducerade av levande försvagat VZV i cellodling.
För att avgöra vilken utspädning VZV-antigen gav maximal avläsning i termer av antalet SFU per 10 6 PBMC var IFN-γ ELISpot utförs med hjälp av tvåfaldiga utspädningar av γ bestrålat levande försvagat VZV-vaccin och PBMC prover som erhållits från en grupp av immunkompetenta barn i åldern mellan 9 månader och 12 niars som hade en dokumenterad historia av vattkoppor och / eller en positiv serologi för VZV (n = 50). . Försökspersoner rekryterades vid Smittskydds Clinic och Special immunologi Clinic för CHU Sainte-Justine mellan juni 2007 och september 2009 Statistiskt signifikanta skillnader observerades mellan median frekvenser av IFN-γ producerande celler som erhölls med hjälp av 1:200, 1: 400 och 1:800 spädningar av VZV-antigen (p <0,0001, Kruskal-Wallis test) (Figur 2). Dessa skillnader utgjordes av skillnaden mellan 1:200 utspädning (median = 115,0 SFU per 10 6 PBMC, kvartilavståndet [IQR] = 75,0-232,5 SFU per 10 6 PBMC) och 1:800 utspädning (median = 50,0 SFU per 10 6 PBMC; IQR = 20,0-105,0 SFU per 10 6 PBMC) och mellan 1:400 utspädning (median = 92,5 SFU per 10 6 PBMC; IQR = 52,5-177,5 SFU per 10 6 PBMC) och 1:800 utspädning (p <0,001 och p (Figur 2). Av denna anledning, bestrålas den 1:200 utspädning av γ levande försvagat VZV-vaccin som väljs för användning i rutinmässiga mätningar av VZV-specifik cell-medierade immunsvar.
För att bestämma om IFN-γ produktion består i CD4 + och / eller CD8 + T-lymfocytundergrupper PBMC prover erhållna från en frisk donator utsattes för utarmning av CD4 + eller CD8 +-celler med användning av anti-CD4 eller anti-CD8-antikroppar kopplade magnetiska pärlor i enlighet med tillverkarens instruktioner. I samstämmighet med tidigare publicerade rapporter 22,23, utarmning av CD4 +-celler resulterade i en slående minskning av frekvenserna av IFN-γ-producerande celler som erhölls med användning av 1:100, 1:200 och 1:400 spädningar av VZV-antigen, medan utarmning av CD8 + celler inte ledde till en sådan nedsättning och positiv kontrolls (stimulering med anti-CD3 monoklonal antikropp) inte påverkas på samma sätt (figur 3). Dessa resultat tyder på att huvuddelen av celler som producerar IFN-γ som svar på stimulering med VZV-antigener är CD4 +-T-celler. Alternativt skulle dessa resultat härrör från utarmning av CD4 +-antigenpresenterande celler (dvs monocyter, dendritiska celler) från PBMC-poolen, vilket leder till minskade nivåer av presentation av VZV-antigener till-svaret CD8 + T-lymfocyter. Användningen av bestrålat VZV är osannolikt att ha bidragit till skevning av svaret mot CD4 dominans, var så liknande resultat som erhållits av andra grupper som använder olika tekniker och antigenkällor 14,21,22. En låg förstoring mikroskop av representativa ELISpot brunnar presenteras i Figur 4.
| Problem / fråga | Möjliga orsaker | Åtgärd / lösning </ Td> |
| Hög bakgrunds / dåligt definierade eller sammanflytande fläckar | Höga antal döda celler. | Bedöma cellviabiliteten före kultur set-up och stimulans. |
| Otillräcklig membran förvätning steg. | Se till att respektera förvätning tid och att membran tur till grått efter 1 min. 35% etanol skall beredas omedelbart före användning. | |
| Plattorna förflyttas under inkubationsperioden. | Flytta inte plåtar för att undvika dåligt definierade snigel trail fläckar. | |
| Tvätta steg. | Manuell tvätt är effektivare än plåtbrickor. | |
| Bildningen av proteinaggregat. | Filter både fånga och detektionsantikroppar för att minska bakgrunden och falska positiva fläckar. | |
| Sekundär och detektering antikroppskoncentrationen. | Justera biotinylerad SEcondary / upptäckt antikroppskoncentration för att minska bakgrunden. | |
| Kalla utvecklings reagenser. | Bring substratet till rumstemperatur för att undvika underexponering. | |
| Inga fläckar / Tomma brunnar | Dåligt definierade fläckar. | Stapla inte plattorna under inkubationstiden för att ha en homogen temperatur i de olika brunnarna. |
| Stimulering substrat inte väl förberedd. | Bring peptidblandningen alikvot till rumstemperatur under 15 min för att undvika kristallbildning. | |
| Cell hopklumpning. | Resuspendera celler till enkelcellsuspension för att undvika underskattning av fläckbildande enheter. | |
| Celler som inte stimuleras på lämpligt sätt. | Använd en polyklonal aktivator som positiv kontroll. | |
| Inhibition av enzymreaktion genom tween-20. | Varh plattor med PBS före tillsats av BCIP / NBT substratlösning. | |
| Felaktiga paren antikroppar. | Se till att fånga och detektionsantikroppar reagerar med olika antigena epitoper. |
Tabell 1. Ytterligare felsökning.
Figur 1. Effekt av γ-bestrålning av levande inaktiverat VZV-vaccin på frekvensen av IFN-γ-producerande celler som bestämts med hjälp av IFN-γ ELISpot. VZV specifik IFN-γ ELISpot utfördes som beskrivs under protokoll text med hjälp av PBMC från en kontroll volontär och serieutspädningar av γ bestrålade (10.000 Gy) levande försvagat VZV-vaccin som antigen. Data representerar medelvärdet av två exemplar MeasureMents och felstaplar representerar standardfel av medelvärdet. PBMC: perifera mononukleära blodceller; SFU: spot bildande enheter; VZV: varicella zoster-virus.
Figur 2. Kvantifiering av VZV-specifik cellmedierade immunsvar hos barn med dokumenterade belägg för tidigare infektion med VZV. VZV specifik IFN-γ ELISpot utfördes som beskrivs under protokoll text med hjälp av PBMC isoleras från patienter med en historia av varicella (n = 50) och seriespädningar av γ bestrålade (10.000 Gy) levande försvagat VZV-vaccin som antigen. Horisontella linjer representerar medianen, lådor representerar kvartilavståndet (IQR), och morrhår representerar olika värden. PBMC: perifera mononukleära blodceller; SFU: spot bildande enheter; VZV: varicella zoster-virus .
Figur 3. Effekt av utarmning av CD4 + eller CD8 +-celler på frekvensen av IFN-γ-producerande celler såsom mätt med användning av IFN-γ ELISpot. Utarmning av CD4 + eller CD8 +-celler och VZV-specifik IFN-γ ELISpot utfördes såsom beskrivits under Protokoll text med hjälp av PBMC från en kontroll volontär och seriespädningar av γ bestrålas (10000 Gy) levande försvagat VZV-vaccin som antigen. Data representerar medelvärdet av dubbla mätningar och felstaplar representerar standardfelet av medelvärdet. PBMC: perifera mononukleära blodceller; SFU: spot bildande enheter; VZV: varicella zoster-virus.
load/51643/51643fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51643/51643fig4.jpg "/>
Figur 4. Representant ELISpot brunnar. VZV specifik IFN-γ ELISpot utfördes som beskrivs under protokoll text med PBMC från fem kontroll frivilliga och seriespädningar av γ bestrålade (10.000 Gy) levande försvagat VZV-vaccin som antigen. Första raden: negativa kontroller (AIM-V-medium kompletterat med 2% (vol / vol) IHS); andra raden: positiva kontroller (anti-CD3-monoklonal antikropp); tredje raden: VZV-antigen. Siffror i de övre hörnen representerar SFU per brunn, mätt med hjälp av en automatiserad plats motverka. PBMC: perifera mononukleära blodceller; SFU: spot bildande enheter; VZV: varicella zoster-virus; IHS: inaktiverat humant serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modifikationer och felsökning: IFN-γ ELISPOT-analyser har använts för att undersöka cellförmedlade immunsvar som riktas mot en mångfald patogena mikroorganismer, däribland humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) 24,25, hepatit C-virus (HCV) 26, 27, och Mycobacterium tuberculosis 28,29, bara för att nämna några. Här beskrev vi utvecklingen av en IFN-γ ELISpot analys för att mäta cellulär immunitet mot, med hopp om att definiera korrelat av VZV specifikt immun beredning i återuppbyggnads pediatriska UCBT mottagare.
Nyckelegenskaper hos denna analys är fyra gånger. För det första behöver den inte tidigare in vitro expansion av T-celler, vilket är tidskrävande. För det andra kan det ske med hjälp av frysförvarade PBMC prover, vilket är bäst för att minimera interassay variabilitet. Dessutom är kryokonservering och parallellbehandling väl anpassade till longitudinellainterna undersökningar, som kräver att prover behandlas i omgångar. För det tredje, för att förhindra cellklumpning påträffas under upptining av PBMC, behandling med ett ultrarent genmanipulerade endonukleas från Serratia marcescens användes. Cell hopklumpning vid upptining PBMC förekommer oftare vid användning av blodprover som är kvar över natten i rumstemperatur före behandling. Införlivandet av genetiskt manipulerade endonukleas från Serratia marcescens är känd för att inte påverka cellernas livskraft, uttryck för cellytemarkörer och svar på stimulering med motsvarande antigen i form av SFU sedan låg nukleas används och exponeringstiden är kort 22. För det fjärde, γ bestrålas levande försvagat VZV-vaccin användes för att stimulera PBMC. Det föredrogs framför cellodling härrör VZV för att försäkra enhetlighet i antigendos och förberedelse och för att övervinna behovet av att manipulera levande VZV i en klinisk miljö där patientsäkerheten ochlaboratoriepersonal är ett stort problem. Sammantaget var de ändringar som infördes i VZV-ELISpot analysen syftar till att göra den bättre anpassad för att användas i en klinisk miljö.
Begränsningar av tekniken betydelse med avseende på befintliga metoder: Enkla, känsliga och reproducerbara metoder krävs för att mäta värdcellmedierade immunsvar mot mikrobiella antigener i samband med klinisk uppföljning. IFN-γ ELISpot är en robust, reproducerbar och informativ analys som kan utföras på venösa blodprov med hjälp av relativt låg tech utrustning (centrifuger, kuvöser, dissektion mikroskop). Detta innebär emellertid inte med lätthet medge samtidig detektion av flera cytokiner och cellytemarkörer. Traditionella in vitro-T-cellproliferationsanalyser, vilka klassiskt använts för räkning av CD4 + och CD8 +-antigen specific T-cellssvar, är arbetsintensiv, saknar känslighet och tenderar att lida av en hög grad av interassay variabilitet 30,31. Å andra sidan, cytotoxisk T-lymfocyt-analyser (CTL) baserat på lys av autologa mål laddade med 51 Cr och begränsande utspädningsanalys tenderar att vara beroende av tidskrävande för in vitro-expansionssteg för att kvantifiera antigenspecifika CD8 + T-celler som är närvarande vid en låg prekursor Frekvenser 32,33. Flödescytometri baserade analyser som mäter cytokinutsöndring efter antigen stimulering (intracellulär cytokin färgning [ICS]) 34,35 kan även användas för att karakterisera antigen-specifika immunsvar. ICS tillåter samtidig detektion av cytokinproduktion och cellyteexpression av fenotypiska markörer i enstaka celler. Känsligheten hos ICS jämförs med den för ELISpot, men det kräver ett större antal celler 36,37. Metoder som utnyttjar fluorescerande klass I eller klass II-peptid-maJor histokompatibilitetskomplexet (pMHC) oligomerer (pMHC tetramerer) 38-40 är precisa och möjliggör multiparameter karakterisering av lymfocytundergrupper baserat på uttryck av markörer på cellytan. Dock kräver pMHC tetramer färgning förkunskap om patienternas humant leukocyt antigen (HLA) typ, vilket kan vara besvärligt och begränsa patientregistrering i en viss studie. En annan begränsning hos denna teknik är att pMHC tetramer-färgning tillåter primärt detektion av T-celler som uttrycker medelhög till hög affinitets T-cellreceptorer (TCR) 41. Å andra sidan, kan CD8 +-T-celler som uttrycker låga affinitets TCR som inte är färgade med pMHC tetramerer lätt detekteras med användning av IFN-γ ELISpot 41. Dessutom kan pMHC tetramerer binda till s.k. förbrukade CD8 + T-lymfocyter som är vanliga i kroniska virusinfektioner, 42,43, varigenom skev den funktionella bedömningen av antigenspecifika cellmedierade immunsvar. Finally, pMHC tetramer färgning och ICS kräver oftast högt utbildad personal, jämförelsevis dyra reagenser, sofistikerade instrument och särskilda anläggningar, vilket gör dessa tekniker notoriskt svåra att genomföra i en klinisk uppföljning inställning.
Framtida applikationer: Dubbla färg ELISPOT-analyser kan samtidigt upptäcka produktion av både IFN-γ och IL-2 44 och dubbel-och trippelfärg fluorospot metoder 45 har genererat stort intresse, eftersom de gör en bedömning av polyfunctionality av antigenspecifika T lymfocyter, som är ett viktigt särdrag hos en effektiv cellmedierade immunsvar 46.
Kritiska steg i protokollet: Ytterligare tekniska frågor måste noga övervägt. Eftersom många variabler kan påverka spot kvalitet (dvs. storlek och densitet) och steler, är nödvändig anslutning till protokollet för att nå känsliga och reproducerbara resultat. Den konsekventa användningen av specifika märken av monoklonala antikroppar (avskiljning och upptäckt), ELISpot plattor med PVDF-membran, och 35% etanol för membranbehandling före beläggning är av stor betydelse. Till exempel kan överbehandling med etanol påverka prestanda hos analysen och punktkvalitet. För att undvika att få uninformative brunnar (dvs.> 300 fläckar), rekommenderar vi att du använder högst 2 x 10 5 PBMC per brunn. När man står inför låga frekvenser av antigenspecifika T-celler, kan analyskänsligheten förbättras genom prestimulating celler in vitro med motsvarande antigen eller utöka dem med polyklonala aktivatorer såsom fytohemagglutinin (PHA) under en viss tid (vanligtvis 3-7 dagar) 38 . Emellertid inte den slutliga optimerade förfarandet för VZV ELISpot assay presenteras häri inte inkludera in vitro prestimulering och / eller expansionssteg. Antal och kvalitet äry av fläckar var liknande över en inkubation intervallet 16-21 timmar. Bortom 21 timmar av inkubation, fläckar var ofta mer diffus och ibland överlappande, vilket gör deras uppräkning svårare. Dessutom kan flytta plattorna medan cellerna inkubera leda till dåligt definierade snigel trail fläckar som är på samma sätt svårare att räkna. Ytterligare felsöknings ledtrådar ges i Tabell 1.
Vid användning av en automatiserad plats motverka, känslighet och strålpunkt grind ställs in med positiv kontroll (anti-CD3-monoklonal antikropp) och den negativa kontrollen (AIM-V-medium kompletterat med 2% (vol / vol) IHS). De viktigaste egenskaperna för att tänka på under spot uppräkning är storlek och form (Figur 4). Den förstnämnda gör att man kan särskilja T-cell som härrör cytokin fläckar från bakgrundsfläckar som ska ignoreras. Ställe antal ger en uppskattning av frekvensen av VZV-specifika T-celler närvarande i en given PBMC prov, medan spotstorlek speglar hur mycket IFN-γ produceras av varje enskilda celler.
Såvitt vi vet är detta den enda IFN-γ ELISpot metod som använder sig av γ bestrålas levande försvagat VZV-vaccin som antigen 4. Paneler med överlappande syntetiska peptider (15-merer) har också använts som antigen, inklusive blandning av peptider baserade på aminosyrasekvensen för VZV IE63 fosfoprotein. IE63 är mycket immunogent 47 och verkar vara avgörande för viral smittsamhet och etablering av latens 48. IE63 specifika T-celler har påvisats hos friska VZV seropositiva donatorer 15, vilket tyder på att IE63 är ett viktigt mål för cellmedierad immunitet riktad mot VZV. Emellertid var reaktiva celler befunnits vara till stor del av CD4 + T-celler 15.
VZV-IFN-γ ELISPOT-analys har tidigare använts av our grupp att bedöma VZV specifika T-cellsvar på 28 barn som genomgick UCBT att behandla neoplastiska eller ärftliga blodsjukdomar 4. Resultat som erhölls under loppet av denna studie tyder på att både CD4 + och CD8 + T-cellundergrupper var inblandade i IFN-γ produktion och att rekonstitution av naiva CD8 + T-cellavdelningen ledde till mer robust VZV-specifik cell-medierade immunsvar hos termer av IFN-γ-produktion. Viktigt är att dessa resultat visade också att detektering av mer än 150 SFU per 10 6 PBMC var i överensstämmelse med T-cellmedierat skydd mot VZV-infektion eller reaktivering 4. Men detta tröskelvärde för VZV specifik cellmedierad immunitet i samband med UCBT och efterföljande immun beredning eller brist därav måste valideras i större prospektiva multicenterstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka studiedeltagarna och deras föräldrar. Vi vill också tacka Dr Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Kanada) för att få tillgång till sin ELISpot läsare, Dr Lubo Alexandrov för statistisk analys, och Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois och Martine Caty för sakkunnig teknisk hjälp. Finansierats med bidrag från le Fonds d'opération pour les Projets de Recherche Clinique et d'Evalution des teknik (CHU Sainte-Justine) till HS och PO, av la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau, och av leukemi och lymfom Society of Kanada. ISF stöddes av stipendier från la Fondation CHU Sainte-Justine och le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS). AJG var mottagare av stipendier från institutionen för mikrobiologi, Infectiology & Immunology, Université de Montréal (Gabriel-Marquis stipendium), FRQS, och den kanadensiska Institutes of Health RORSKNING (CIHR). NM stöddes av la Fondation CHU Sainte-Justine, Cole stiftelsen, och FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 °C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μl of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
References
- Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
- Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
- Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
- Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
- Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
- Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
- Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients - a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
- Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation--a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
- Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
- Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
- Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
- Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
- Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
- Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
- Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
- De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
- Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
- Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
- Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
- Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
- Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
- Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
- Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
- Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
- Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
- Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
- Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
- Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
- Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
- Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
- Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
- Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
- Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
- Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
- Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
- Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
- Wherry, E. J.
- Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
- Ahlborg, N., Axelsson, B.
- Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
- Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
- Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).
