Utveckling av en IFN-γ ELISpot analys för att bedöma varicella zoster-cellmedierad immunitet virusspecifika Efter navelsträngsblod Transplantation

Summary

Nya generationer av funktionella analysmetoder såsom gamma-interferon (IFN-γ) ELISpot, som upptäcker cytokinproduktion på enskild cellnivå och ger både kvantitativ och kvalitativ karakterisering av T-cellsvar kan användas för att bedöma cellmedierade immunsvar mot varicella zoster virus (VZV).

Abstract

Varicella zoster-virus (VZV) är en betydande orsak till morbiditet och mortalitet efter navelsträngsblod transplantation (UCBT). Därför är antiherpetic profylax administreras systematiskt till pediatriska UCBT mottagare för att undvika komplikationer i samband med VZV-infektion, men det finns inga starka, evidensbaserad samsyn som definierar dess optimala behandlingstiden. Eftersom T-cellmedierad immunitet är ansvarig för kontroll av VZV-infektion, bedöma beredning av VZV specifika T-cellsvar efter UCBT skulle kunna ge indikationer om huruvida profylax bör behållas eller kan avbrytas. För detta ändamål har en VZV-specifik gammainterferon (IFN-γ) enzymkopplad immunospot (ELISpot)-analys utvecklades för att karakterisera IFN-γ-produktion genom T-lymfocyter som svar på stimulering in vitro med bestrålade levande försvagat VZV-vaccin. Denna analys ger en snabb, reproducerbar och känslig mätning av VZV specifik cell medierad immunitet lämplig för övervakning av beredning av VZV specifik immunitet i en klinisk miljö och bedöma immunförsvar till VZV-antigen.

Introduction

Först utfördes 1989 och är UCBT alltmer används som en del i behandling av olika neoplastiska och icke-neoplastisk blodsjukdomar hos barn ^1. VZV är ett cytopatiskt mänsklig alfaherpesvirus som orsakar två olika sjukdomar, varicella (efter primärinfektion) och herpes zoster (efter reaktivering). Efter primärinfektionen, kvarstår VZV under hela livet i värd skyddad inom sensoriska nerver av dorsala rotganglier. En av de mest hotande infektiösa komplikationer efter UCBT förknippas med VZV ^2-4. I vår kliniska center, i avsaknad av VZV profylax, den kumulativa incidensen av VZV sjukdom VZV sjukdomen på 3 år postUCBT var 46% ^2. Hos dessa patienter är de novo infektion eller reaktivering av VZV ofta förknippade med visceral spridning till centrala nervsystemet, lungor och lever ^5-7. Som ett resultat, aciklovir, valacyclovir eller famciklovir profylax är allmänt administreras till UBCT mottagare ^8,9. Men denna behandlingsstrategi inte hänsyn till den skyddande potentialen hos VZV-specifika T-lymfocyter eller kinetiken för upplösning av VZV-specifika T-cellsvar. Potentiella problem i samband med den ökade användningen av långsiktiga antiherpetic profylax inkluderar a) patienten överbehandling; b) utveckling av antiviral resistens ^10,11; och c) nedskrivningar av VZV specifikt immun beredning ^12,13. Eftersom detektering av funktionella VZV specifika T-lymfocyter korrelerar med förekomsten av långsiktigt skydd mot VZV infektion och förbättrat kliniskt resultat ^4,14,15, övervaka cellmedierade immunsvar mot VZV under perioden efter kan leda till en mer rationell användning av antivirala behandling genom att möjliggöra läkare för att skilja patienter som skulle ha nytta av VZV profylax från dem vars immunsystem kan styra VZV replikering ^4,13.

I IFN-γ ELISpot analysen används ofta för övervakning cellmedierade immunsvar i olika experimentella system och kliniska tillstånd. Ställen genereras vid klyvning av ett kromogent substrat, vilket genererar en synlig och stabil fällning vid platsen för reaktionen. Varje enskild plats representerar därmed fotavtryck av en individuell cytokin-producerande celler. IFN-γ ELISpot mäter inte enbart förmågan hos individuella celler ex vivo för att producera IFN-γ som svar på stimulering in vitro med motsvarande antigen, men det ger också en uppskattning av frekvensen för svarande celler i en given cellpopulation ^16,17. Förutom sin höga känslighet, är IFN-γ ELISpot enkelt att utföra, vilket gör dess användning möjlig i samband med personlig kliniska protokoll som syftar till att styra initiering eller upphörande av antiviral behandling. Det förfarande som beskrivs nedan som beskriveres en ELISpot analys som är särskilt utformad för att upptäcka och mäta produktionen av IFN-γ från perifera mononukleära blodceller efter in vitro stimulering med VZV härledda antigener.

Protocol

Denna forskning protokoll godkändes av Institutional etikprövningsnämnden i CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Kanada, där studien genomfördes. Informerat samtycke söktes och erhölls från alla studiedeltagare, deras föräldrar eller vårdnadshavare. Alla procedurer utförs på dag 1 och 2 skall utföras under sterila förhållanden (dvs. under ett laminärt flöde huva). Standard säkerhetsrutiner för hantering av mänskligt blod bör följas noga. 1. Beläggning av platt…

Representative Results

Den IFN-γ ELISpot protokoll i detalj ovan har utvecklats och optimerats i vårt laboratorium för att mäta storleken och kvaliteten av cellmedierade immunsvar riktade mot VZV 4. Olika källor av VZV-antigen kan användas för stimulering steget. Dessa inkluderar: a) kommersiellt tillgängliga rengöringsmedel inaktiverade utdrag från VZV infekterade Vero-celler 18; b) pooler av överlappande syntetiska peptider från specifika VZV kodade proteinerna, inklusive IE63 15 och ORF4 19…

Discussion

Modifikationer och felsökning: IFN-γ ELISPOT-analyser har använts för att undersöka cellförmedlade immunsvar som riktas mot en mångfald patogena mikroorganismer, däribland humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) ^24,25, hepatit C-virus (HCV) ^{26, 27,} och Mycobacterium tuberculosis ^28,29, bara för att nämna några. Här beskrev vi utvecklingen av en IFN-γ ELISpot analys för att mäta cellulär immunitet mot, med hopp om att definiera korrelat av VZV specifikt immun beredni…

Materials

Leucocep tube	VWR	89048-936/89048-932	12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Protect from light.
Benzonase nuclease	Novagen	70746-3	Keep at -20 C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate	Millipore	MSIPS4W10	Sterile with pore size of 0.45 µm.
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody	BD Biosciences	551221	NIB42 clone.
Pepmix VZV IE63	JPT Peptide Technologies	PM-VZV-IE63	Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody	BD Biosciences	554550	4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase	Bio-Rad Life Science	170-3554	Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT	Bio-Rad Life Science	170-6432	Protect from light.