정적 점착 분석은 T 림프구 및 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 모델링하는 데 사용될 수있는 강력한 도구이다. 상호 작용 플레이트 판독기가 직렬 세척 다음 부착 세포의 수를 정량화하는 데 사용되는 반면, 부착 분자로 코팅 된 웰에 표지 된 T 세포를 주입함으로써 생성된다.
T 림프구의 접착 염증과 항원 제시 세포와 면역 시냅스의 형성 사이트로 이동을 포함하여 다수의 T 세포 기능이 필요합니다. T 세포는 인테그린, 파트너 세포 나 세포 외 매트릭스에서 표적 분자와 상호 작용하는 막 횡단 단백질의 이종이 쌍으로 이루어지는 세포 접착 분자의 수준의 접착 성을 제어함으로써 조절 된 접착을 달성. 가장 눈에 띄는 T 세포 인테는 그 대상 세포 접착 분자 (ICAM) -1 소단위 αL 및 β2, 구성, 림프구 기능 관련 항원 (LFA) -1이다. 접착 성을 제어하는 T 세포의 능력은 각각의 인테그린의 궁합 상태를 조절하는 능력에서 유래. 인사이드 아웃 신호는 세포 내부 신호가 인테그린의 외부 도메인이 활성화 된 상태를 가정하는 원인이된다 과정에 대해 설명합니다. 이러한 복잡한 현상에 대한 우리의 지식의 대부분은 기계 론적 기반으로연구는 체외 모델 시스템의 단순화에서 수행. 여기에 설명 된 T 림프구 접착 분석은 T 세포가 정적 조건 하에서, 표적 분자에 부착 허용하고 점착성을 정량화하는 형광 플레이트 판독기를 이용하여 우수한 공구이다. 이 분석은 림프구에 작용 접착 자극 또는 억제 물질을 정의뿐만 아니라 관련된 시그널링 이벤트 특성화에 유용왔다. LFA-1에 여기에서 설명하지만 – ICAM-1 매개 접착; 이 분석은 용이하게 다른 접착제 상호 작용 (- 피브로넥틴 예 VLA-4)의 조사를 허용하도록 구성 될 수있다.
T 림프구의 접착은 면역 반응 1에 근본적인 과정이다. 그것은 주사 항원 표적 세포 (2)와 림프절 내의 세포 (APC)를 제시하고, 면역 시냅스 형성 (IS)에 대한 내피 세포가 모세관 벽 장식과 T 세포 상호 작용을 위해 요구된다. 이러한 요구 사항은 기능과 역학적으로 구별된다. 림프구의 혈관 외 유출의 과정은 chemoattraction, 압연, 밀착성, 그리고 윤회로 구성되어 있습니다. 접착 성을 굳게하기 위해 롤링의 전환이 빠르게 G 단백질 결합 수용체의 신호에 응답하는 T 세포를 필요로합니다. 이 응답은 롤링 셀 3을 느리게하고 체포 인테 리간드 상호 작용을 얻을 수 있습니다. 인테 욕망의 즉각적인 변화는이 과정을 매개한다. 마이그레이션은 '프론트 엔드'에서 유착의 형성과 '후부'에서 유착의 파손 동적 상호 작용의 betweenTcells과 내피 세포가 필요합니다성형 및 4를 깨는 사이의 분 정도의 간격으로. IS는 inminutes를 형성하지만, 시간 6에 그대로 유지해야합니다.
흥미롭게도, 하나의 접착 분자는 인테그린 회원 림프구 기능 관련 항원 (LFA) – 1,이 모든 과정 5 필수적이다. LFA-1가 면역 글로불린 수퍼 패밀리의 다양한 구성원과의 상호 작용을 통해 부착을 매개한다. LFA-1로 가장 높은 선호도가 가장 광범위하게 연구 리간드는 세포 간 접착 분자 (ICAM) -1입니다. 비 활성화 순환 림프구 따라서 세포 표면에 LFA-1 및 ICAM-1-코팅 된 표면에 부착 할 수없는 낮은 선호도를 표현한다. LFA-1 궁합 변수와 같은 G 단백질 결합 수용체 활성화, 사이토킨 자극 및 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 매개되는 신호와 같은 여러 시그널링 이벤트에 의해 조절된다. LFA-1은 세포 외 공간에 세포 내 활성을 전달의 결과 선호도가 높은 포름 티ICAM-1의 hrough의 상호 작용. 이 통로는 7 신호 내부 아웃이라고한다. 마찬가지로, 세포 외 공간에서 LFA-1을 통해 신호는 외부에서 신호라고합니다.
인사이드 – 아웃 및 신호 외부 -에 참여 폭포 신호 세포는 현재의 연구의 주요 초점이다. 작은 GTPase의 RAP1는 최근 그 TCR 내고 8 신호 사이토 카인의 공통 신호 내부 아웃의 핵심 구성 요소로 떠오르고있다. T 세포 접착이 지배적 부정적인 RAP1 9의 발현에 의해 차단되는 반면 인테 활성화에 RAP1의 중요한 역할은, RAP1의 과발현은 T 세포의 인테 의존 접착을 자극 발견에 의해 강조 표시됩니다. RAP1으로 인테 규제에 대한 우리의 이해의 이러한 발전은 체외 도구로 사용하여 수행되었다. 그 중 여기에 설명 된 정적 접착 분석이다.
이 방법의 전반적인 목표는 T를 연구하는 것입니다ICAM-1 코팅 표면에 세포 접착. 구체적으로는 객관적으로 측정하고 다른 조건에서 실시간으로 살아있는 세포에서의 카운터 리간드쪽으로 LFA-1 친화력을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 기술은 T 세포와 상호 작용하는 세포 표면을 모방하는 ICAM-1로 코팅 폴리스티렌 웰을 사용한다. 많은 전술 정적 T 세포 부착 분석법 실험적 복잡한되었습니다. 주로 T 세포에 필요한 이러한 분석은 방사성 레이블 T 세포 접착 용 기판 등의 세포 외 기질 (extracellular matrix)을 만들 배양 소 각막 세포를 이용, 또는 T 세포 접착 (10)을 촉진하기 위해 확장 된 기간 동안 비 생리적 인 T 세포 자극을 요구한다. 많은 다른 분석 시스템 (11)에서 이용되는 것처럼, 계측법 및 현미경 흐르게 비해 접착 배양 다음 T 세포를 정량화하는 형광 측정의 사용은 정량보다 민감하고 정확한 방법이다. 또한, 단일 세포 microscop인테그린 지역화 IC 분석은 형광 측정과 동일한 방식으로 광범위한 인구 기반 분석을 허용하지 않는다. 활성화 상태 별 LFA-1 항체가 상업적으로 사용할 수 있지만,이 항체는 여기에 설명 된 방법에 상대적으로 낮은 감도를 제공합니다. 대체 기술을 통해 가장 큰 장점은 단순하고 동시에 여러 실험 조건을 검사 할 수있는 기능입니다. 특정 응용 프로그램에 대해이 방법을 고려할 때, 하나는 T 세포가 부정적으로 선택한 갓 격리 및 형광 마커로 표시되어야 함을 고려한다.
LFA-1의 활성화 및 T 세포 접착 (12)에 신호를 연구하는 몇 가지 분석이있다. 유동 세포 계측법은 절곡 또는 LFA-1 확장 하나에 선택적으로 결합 모노클로 날 항체를 사용하여 살아있는 세포에 LFA-1의 궁합 상태를 측정하는 데 사용된다. 이 방법의 한계 중 하나는 계정에 인테그린 '갈망을하지 않는다는 것입니다. 마이그레이션 분석은 유용한 도구입니다 있지만 특정 시점에서 순대 접착을?…
The authors have nothing to disclose.
Hirschil 신뢰, 마이클 Saperstein 의료 학자 연구 자금 및 NYU 화이트 헤드의 교제는이 작업을 지원했다.
Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
RPMI | Gibco | 11875-093 | |
DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
15 and 50 mL centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |