Statisk feste analysen for Study of inte Activation i T-lymfocytter
Summary
Statisk adhesjon assay er et kraftig verktøy som kan brukes til å modellere interaksjonen mellom T-lymfocytter og andre celletyper. Interaksjoner genereres ved å injisere merkede T-celler i brønner belagt med adhesjonsmolekyler, mens en plate-leser brukes til å kvantifisere antallet adherente celler følgende serievaskinger.
Abstract
T-lymfocytter vedheft er nødvendig for flere T celle funksjoner, inkludert migrering til områder med betennelse og dannelse av immunologiske synapser med antigenpresenterende celler. T-celler oppnå regulert adhesjon ved å styre de adhesive egenskaper av integriner, en klasse av celleadhesjonsmolekyler som består av heterodimere par av transmembrane proteiner som interagerer med målmolekylene på partnerceller eller ekstracellulær matriks. Den mest fremtredende T-celle integrin er lymfocytt-funksjon-assosiert antigen (LFA) -1, sammensatt av underenheter pI og β2, hvis målet er den intracellulære adhesjonsmolekyl (ICAM) -1. Muligheten av en T-celle for å styre heft stammer fra muligheten til å regulere affinitet tilstander av individuelle integriner. Inside-out signale beskriver prosessen hvor signalene inne i en celle føre til eksterne domener av inte å anta påvirket tilstand. Mye av vår kunnskap om disse komplekse fenomener er basert på mekanistiskstudier utført i forenklet in vitro modellsystemer. Den T-lymfocytter vedheft analysen beskrevet her er et utmerket verktøy som lar T-celler til å følge målrette molekyler, under statiske betingelser, og deretter benytter et fluorescerende plate leseren å kvantifisere klebrighet. Denne analysen har vært nyttig å definere adhesjons-stimulerende eller inhiberende substanser som virker på lymfocytter, så vel som karakteriserer de signaleringshendelser som er involvert. Selv beskrevet her for LFA-1 – ICAM-1 mediert vedheft; Dette assay kan lett tilpasses for å muliggjøre studier av andre adhesive interaksjoner (for eksempel VLA-4 – fibronektin).
Introduction
T-lymfocytt adhesjon er en grunnleggende prosess i immunresponsen 1.. Det er nødvendig for T-celle-interaksjon med endotelceller dekorere kapillærveggene, for skanning antigen-presenterende celler (APC) i lymfeknuter, og for dannelse av immunologiske synapser (IS) med målceller 2. Disse kravene er funksjonelt og kinetisk distinkt. Prosessen med lymfocytter bloduttredelse består av chemoattraction, rullende, fast feste, og sjelevandring. Overgangen fra rulle til fast adhesjon krever T-celler til å svare på en G-protein koblet reseptor signal raskt. Dette svaret gir en inte ligand interaksjon som bremser og arrestasjoner den rullende cellen tre. En umiddelbar endring i inte grådighet formidler denne prosessen. Migrasjon krever dynamiske interaksjoner betweenTcells og endotelceller med dannelse av sammenvoksninger på "front end" og brekker av sammenvoksninger på "bakenden"med et intervall på omtrent et minutt mellom forming og bryte fire. IS danner inminutes, men må forbli intakt i timevis seks.
Interessant, en adhesjonsmolekyl, integrinet familiemedlem-lymfocytt-funksjon-assosiert antigen (LFA) – 1, er viktig for alle disse prosessene 5. LFA-1 medierer heft gjennom samhandling med flere medlemmer av immunoglobulin super. Den mest omfattende studert ligand med den høyeste affinitet til LFA-1 er det intercellulære adhesjonsmolekyl (ICAM) -1. Ikke-aktivert sirkulerende lymfocytter uttrykker lav affinitet LFA-1 på celleoverflaten, og derfor er ute av stand til å holde seg til ICAM-1-belagte overflater. LFA-en affinitet er variabel og regulert av flere signal arrangementer som G-protein koblet reseptor aktivering, cytokin stimulering, og signaler mediert av T-celle reseptorer (TCR). Den resulterende høy affinitet form av LFA-en formidler intracellulær aktivering til ekstracellulært through interaksjoner med ICAM-1. Denne veien kalles inside-out signale 7. Likeledes, signaliserer gjennom LFA-en fra den ekstracellulære rom kalles utenfor-i signalering.
Den intracellulære signal kaskader involvert i innside-ut og utside-inn signale er et stort fokus på aktuell forskning. Den lille GTPase Rap1 har nylig dukket opp som en nøkkelkomponent for inside-out signaliserer som er felles for både TCR ligation og cytokin signale åtte. Den kritiske rollen Rap1 i inte aktivering er markert med oppdagelsen av at overekspresjon av Rap1 stimulerer inteavhengig vedheft av T-celler, mens T-celle adhesjon er blokkert av uttrykk for dominerende negative Rap1 ni. Disse fremskritt i vår forståelse av inte regulering av Rap1 har blitt oppnådd ved hjelp av in vitro-verktøy. Blant dem er det statiske adhesjonsanalysen beskrevet her.
Det overordnede målet med denne metoden er å studere Tcelle klebrighet til ICAM-1 malte overflater. Mer spesifikt, er det brukt til å objektivt måle og kvantifisere LFA-en affinitet mot sine mot ligander i levende celler i sanntid, under forskjellige forhold. Denne teknikken anvender polystyren-brønner belagt med ICAM-1 til å etterligne de cellulære overflater som T-cellene kommuniserer med. Mange tidligere beskrevet statisk T celle adhesjon analyser var eksperimentelt kompleks. Disse analyser ofte er nødvendige for T-celler til å være radioaktivt merket, anvendes dyrkede bovine corneale celler til å lage en ekstracellulær matriks som substrat for T-celle-adhesjon, eller kalt for ikke-fysiologiske T-celle stimulering over en forlenget varighet for å fremme T-celle-adhesjon 10. Bruken av fluorometrisk måling for å kvantifisere T-celler etter inkubasjon adhesjon er en mer følsom og nøyaktig metode for mengdebestemmelse i forhold til flow cytometri og mikroskopi, som er utnyttet i mange andre bestemmelsessystemer 11. I tillegg, enkelt celle mikroskopic analyse av integrin lokalisering ikke tillater for den brede, populasjonsbasert analyse på samme måte som den fluorometrisk måling. Mens aktiverings state-spesifikke LFA-1-antistoffer er kommersielt tilgjengelige, er disse antistoffene har lav følsomhet i forhold til fremgangsmåten beskrevet her. Den viktigste fordel i forhold til alternative teknikker er dens enkelhet og evnen til å undersøke flere eksperimentelle betingelser samtidig. Når du vurderer denne metoden for et bestemt program, bør man ta hensyn til at T-cellene skal bli negativt valgt, fersk isolert, og merket med en fluoriserende fargestoff.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er flere analyser for å studere signaler til LFA-1-aktivering og T-celle-adhesjon 12. Strømningscytometri er brukt til å måle LFA-1 affinitet tilstander i levende celler ved hjelp av monoklonale antistoffer som binder seg selektivt til enten bøyd eller utvidet LFA-1. En av begrensningene i denne metoden er at den ikke tar hensyn til de inte 'grådighet. Migrasjon analyser er nyttige verktøy, men de måler migrasjon, og ikke measly vedheft på et bestemt tidspunkt. Musemodeller for å studere T l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hirschil Trust, Michael Saperstein Medisinsk Scholars forskningsmidler, og NYU Whitehead fellesskap støttet dette arbeidet.
Materials
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 mL centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Dustin, M. L. Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses. Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).
- Springer, T. A., Dustin, M. L. Integrin inside-out signaling and the immunological synapse. Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).
- Mor, A., et al. D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane. Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).
- Bivona, T. G., et al. Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion. J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Bhattacharyya, S. P., et al. Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells. Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
