Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hurtig isolering og oprensning af mitokondrier til transplantation Ved Tissue Dissociation og differentieret Filtrering

Published: September 6, 2014 doi: 10.3791/51682
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 2, 1
1Division of Cardiothoracic Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Boston Children's Hospital and Department of Anesthesia, Harvard Medical School

ERRATUM NOTICE

Summary

En metode til hurtig isolering af mitokondrier fra pattedyr vævsbiopsier beskrives. Rotte lever eller skeletmuskulaturen præparater blev homogeniseret med en kommerciel væv dissociator og mitokondrier blev isoleret ved differential filtrering gennem nylon mesh filtre. Mitokondrie isolation tid er <30 min sammenlignet med 60-100 minutter ved hjælp af alternative metoder.

Abstract

Tidligere beskrevne mitokondrielle isoleringsmetoder anvender differentiel centrifugering og / eller Ficoll-gradientcentrifugering kræve 60 til 100 minutter for at fuldføre. Vi beskriver en metode til hurtig isolering af mitokondrier fra pattedyr biopsier ved hjælp af en kommerciel væv dissociator og differentieret filtrering. I denne protokol, er manuel homogenisering erstattet med vævet dissociator standardiserede homogenisering cyklus. Dette giver mulighed for en ensartet og konsekvent homogenisering af væv, der ikke let opnås med manuel homogenisering. Efter væv dissociation er homogenat filtreres gennem nylon mesh filter, som fjerner repetitive centrifugeringstrin. Som et resultat, kan mitokondrie isolering udføres i mindre end 30 min. Denne isolation protokol giver ca. 2 x 10 10 levedygtige og åndedræt kompetente mitokondrier fra 0,18 ± 0,04 g (våd vægt) vævsprøve.

Introduction

Findes mitokondrier i hver celle i kroppen undtagen røde blodlegemer og er involveret i en lang række vigtige cellulære og metaboliske processer 1-4. På grund af disse mange funktioner, kan skade på mitokondrier have skadelige virkninger 3. For at undersøge mitokondriefunktion og dysfunktion flere mitochondriale isoleringsmetoder er blevet beskrevet. De tidligste offentliggjorte regnskaber mitokondrie isolation dato til 1940'erne 5-8. Den første dokumenterede forsøg påvist mitokondrie isolering ved formaling levervæv i en morter efterfulgt af centrifugering i en saltopløsning ved lav hastighed 5,8. Senere andre grupper uddybet den oprindelige procedure og demonstreret væv fraktionering baseret på differentiel centrifugering 6-8. Disse tidlige metoder dannede grundlag af de nuværende teknikker, som ofte inkorporerer homogenisering, og / eller differential centrifugering 9-15. Antallet af homogenizatipå og centrifugering trin varierer mellem protokoller. Disse gentagne trin øg tidsrummet for mitokondrie isolation og i sidste ende reducere levedygtighed. Hertil kommer, kan manuel homogenisering forårsage skade på mitokondrier og uensartede resultater, hvis ikke ordentligt kontrolleret 10,16.

For nylig brugte vi homogenisering og differentialcentrifugering at isolere mitokondrier til transplantation i myokardievæv 17,18. Denne langvarige isolation, der kræves cirka 90 minutter, og den kliniske anvendelighed af denne metode var derfor begrænset. For at give mulighed for akut terapeutisk anvendelse i klinisk og kirurgisk behandling har vi udviklet en hurtig mitokondrie isolation procedure, der kan udføres i mindre end 30 min.

De største fordele ved denne protokol er, at standardiserede væv dissociation tillader ensartet og konsekvent homogenisering af væv, som ikke er nemt at opnå med manuel homogenisering. I Addition, brug af differentieret filtrering i stedet for differentialcentrifugering eliminerer tidskrævende og gentagne centrifugeringstrin giver mulighed for hurtigere isolering af højt oprensede, levedygtige og respiration kompetente mitokondrier.

Evnen til at isolere levedygtige og åndedræt kompetente mitokondrier i mindre end 30 min giver mulighed for klinisk anvendelighed. Denne isolation protokol har potentiale til brug i koronararterie bypass-kirurgi (CABG) og andre terapeutiske procedurer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forberedelse

  1. Forbered 1 M K-HEPES stamopløsningen (justering af pH til 7,2 med KOH).
  2. Forbered 0,5 M K-EGTA stamopløsningen (justering af pH til 8,0 med KOH).
  3. Forbered 1 M KH 2 PO 4 stamopløsning.
  4. Forbered 1 M MgCl2 stamopløsning.
  5. Forbered Homogenisering buffer (pH 7,2) 300 mM saccharose, 10 mM K-HEPES og 1 mM K-EGTA. Opbevares ved 4 ° C.
  6. Forbered respiration buffer 250 mM saccharose, 2 mM KH 2PO 4, 10 mM MgCl2, 20 mM K-HEPES-puffer (pH 7,2) og 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Opbevares ved 4 ° C.
  7. Forbered 10x PBS stamopløsning ved at opløse 80 g NaCl, 2 g KCI, 14,4 g Na 2 HPO 4, og 2,4 g KH 2PO 4 i 1 l dobbelt destilleret H2O (pH 7,4).
  8. Forbered 1x PBS ved pipettering 100 ml 10x PBS i 1 L dobbelt destilleret H 2 O.
  9. Forbered Subtilisin En bestand ved at afveje 4 mg Subtilisin A itil et 1,5 ml mikrofugerør. Opbevares ved -20 ° C indtil brug.
  10. Forbered BSA lager ved at afveje 20 mg BSA i et 1,5 ml mikrofugerør. Opbevares ved -20 ° C indtil brug.

Mitokondrie Isolation (figur 1)

  1. Umiddelbart før isolation opløses Subtilisin A i 1 ml homogeniseringsbuffer.
  2. Umiddelbart før isolation opløse BSA i 1 ml homogeniseringsbuffer.
  3. Saml to friske vævsprøver med en 6 mm biopsi prøve Hulning og butik i 1x PBS i en 50 ml konisk centrifugerør på is.
  4. Overfør to 6 mm punches væv til en dissociation C rør indeholdende 5 ml iskold homogeniseringsbuffer.
  5. Homogeniseres vævet ved montering dissociation C røret på vævet dissociator og vælge den forudindstillede mitokondriel isolation cyklus (60 sek homogenisering).
  6. Fjern dissociation C rør til en ice bucket.
  7. Tilføj 250 ul Subtilisin En stamopløsning tilhomogenat, bland ved inversion og inkuberes homogenatet på is i 10 min.
  8. Anbring en 40 um mesh-filter på en 50 ml konisk centrifugerør på is og præ-vådt filteret med homogeniseringsbuffer og filtrere homogenatet i 50 ml konisk centrifugerør på is.
  9. Tilføj 250 pi frisk fremstillet BSA stamopløsning til filtratet og bland ved inversion.
    Bemærk: Udelad dette trin, hvis mitokondrieprotein beslutsomhed er påkrævet.
  10. Anbring en 40 um filter på en 50 ml konisk centrifugerør på is og præ-vådt filteret med homogeniseringsbuffer og filtrere homogenatet i 50 ml konisk centrifugerør på is.
  11. Anbring en 10 um filter på en 50 ml konisk centrifugerør på is og præ-vådt filteret med homogeniseringsbuffer og filtrere homogenatet i 50 ml konisk centrifugerør på is.
  12. Filtratet overføres til to nedkølede 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifugeres ved 9000 xg i 10 min ved4 * C.
  13. Fjern supernatanten og re-suspendere og kombinere pellets i 1 ml iskold Respiration Buffer.

ATP Assay

Bemærk: For at bestemme den metaboliske aktivitet af isolerede mitokondrier et ATP luminescens assay kan udføres ved hjælp af en ATP assaykit. Protokollen, reagenser og standarder blev leveret i assaykittet. Et resumé af proceduren er beskrevet nedenfor.

  1. Ækvilibrer reagenser til RT.
  2. Forbered 10 mM ATP stamopløsning ved at opløse frysetørret ATP pellet i 1.170 pi dobbelt destilleret vand. Opbevar ATP standard stamopløsning og tilberedte mitokondrie prøver på is.
  3. Der tilsættes 5 ml substratbuffer opløsning til et hætteglas med frysetørret substratopløsning. Bland forsigtigt og anbringes i mørke.
  4. Tilsæt 100 pi af respiration puffer til alle brønde i en sort, uigennemsigtig bund, plade med 96 brønde.
  5. Tilsæt 10 ul af mitokondrier fra de præparerede prøver til hver brønd ofa sort, uigennemsigtig bund, plade med 96 brønde. Bemærk: Prøver udplades i tre eksemplarer. Medtag en række for standarder og tre brønde til den negative kontrol (Respiration Buffer).
  6. Der tilsættes 50 ul pattedyrscelle lyseopløsning til alle brønde, herunder standarder og kontroller.
  7. Inkubér pladen ved 37 ° C i 5 minutter på en orbitalryster ved 125 rpm.
  8. Under inkubationen forberede ATP-standarder i koncentrationer på 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM og 0,0001 mM ATP fra 10 mM ATP stamopløsning. Opbevar standarder på is.
  9. Efter inkubation tilsættes 10 ul ATP standarder til tilsvarende brønde som angivet på pladen kortet. Udføres Standarder i to eksemplarer: Note.
  10. Der tilsættes 50 ul af den rekonstituerede substratopløsning til hver brønd.
  11. Inkubér pladen ved 37 ° C på rysteapparat i 5 minutter ved 125 rpm.
  12. Åbent Gen5 1.11 softwaren på en computer forbundet med spektrofotometer.
  13. Under "Oprette et nyt element ", klik på" Eksperiment ".
  14. Klik på "Standard-protokollen". Klik på "Ok".
  15. I den venstre kolonne, skal du vælge "protokollen", derefter "Procedure".
  16. Vælg "forsinkelse". Indstil til 0:10:00. Klik på "Ok".
  17. Vælg "Læs". Vælg "Luminescence" fra drop-down menuen. Juster andre indstillinger til følgende: Læs typen Endpoint, Integration tid 0: 01.00 MM: ss.ss, Filter sæt 1, Emission Hole, Optik Position Top, Følsomhed 100, Top Probe Vertikal Offset 1,00 mm.
  18. Når pladen er klar til at blive analyseret, skal du klikke på "Læs Plate" ikonet på den øverste række. Klik på "Læs". Når spektrofotometer åbnes, skal du placere pladen i skuffen med godt A1 i øverste venstre hjørne. En boks med temperaturen åbnes. Klik på "Læs". Bemærk: Højere værdier korrelerer med øgede ATP niveauer og højere metabolisk aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En figur skitserer de proceduremæssige skridt i isoleringen af mitokondrier hjælp af væv dissociation og differentieret filtrering er vist i figur 1. Samlet processuelle tid er mindre end 30 min.

Vævsprøver blev opnået ved anvendelse af en 6 mm biopsitang. Tissue vægt var 0,18 ± 0,04 g (våd vægt). Antallet af mitokondrier isoleret som bestemt ved partikelstørrelse optælling var 2,4 x 10 10 ± 0.1 x 10 10 mitokondrier for skeletmuskulatur og 2,75 x 10 10 ± 0.1 x 10 10 mitokondrier til levermateriale (figur 2A). At give mulighed for sammenligning mitokondrie antal blev også bestemt ved hæmocytometer. Mitokondrie nummer blev undervurderet som bestemt ved hemocytometer som 0,11 x 10 10 ± 0,04 x 10 10 mitokondrier til skeletmuskulatur og 0,34 x 10 10 ± 0,09 x 10 10 mitokondrier for levermateriale (FIGUR 2A). Mitokondrie diameter som bestemt ved størrelsen baseret partikeltæller er vist i figur 2B. Den repræsentative sporing viser de isolerede mitokondrier er lokaliseret under en top med en gennemsnitlig diameter på 0,38 ± 0,17 um i aftale med tidligere rapporter 7.

Mitokondrie-protein / g (våd vægt) fra væv som bestemt ved bicinchoninsyre (BCA)-assay var 4,8 ± 2,9 mg / g (våd vægt) og 7,3 ± 3,5 mg / g (våd vægt) for skeletmuskulatur og leverprøver (figur 2C).

Mitokondrie renhed blev bestemt ved transmissionselektronmikroskopi og er vist i figur 2D. Er vist Mitokondrier skal elektron tæt med mindre end 0,01% bliver brækket eller beskadiget. Forurening af ikke-mitokondrie partikler er mindre end 0,001%.

Mitokondrie levedygtighed blev bestemt ved MitoTracker Rød som tidligere devet 17,18. Vores resultater viser, at de isolerede mitokondrier opretholde membranpotentiale (figur 3A - C).

ATP blev bestemt under anvendelse af et luminescerende assaykit. En plade kort for ATP-assayet er vist i figur 4. ATP standarder blev udpladet in duplo. Mitokondrielle prøver og negative kontroller blev udpladet i tre eksemplarer. ATP-indholdet var 10,67 ± 4,38 nmol / mg mitokondrieprotein og 14,83 ± 4,36 nmol / mg mitokondrieprotein til skeletmuskulatur og leverprøver (figur 3D).

Mitokondrie åndedræt blev vurderet ved hjælp af en Clark typen elektrode som tidligere beskrevet 17,18. Mitokondrie iltforbrug sats var 178 ± 17 nM O 2 / min / mg mitokondrieprotein til skeletmuskulatur og 176 ± 23 nM O 2 / min / mg mitokondrieprotein til levermateriale. Respiratory kontrol indeks (RCI) værdier var 2,45 ± 0,34 end 2,67 ± 0,17 til skeletmuskulatur og lever præparater prøve (figur 3E). Disse resultater svarer til dem rapporteret i vores tidligere undersøgelser ved hjælp af manuel homogenisering og differentialcentrifugering at isolere mitokondrier 17-18.

Figur 1
Figur 1. Skema til isolering af mitokondrier hjælp af væv dissociation og differentieret filtrering. (A) Overførsel to 6 mm biopsiprøve slag på 5 ml homogeniseringsbuffer i en dissociation C rør og homogeniseres prøverne ved hjælp af væv dissociator er 1 min homogenisering programmet. (B) Tilsæt 250 pi subtilisin En stamopløsning til homogenatet i dissociationen C rør og inkuberes på is i 10 min. (C) filtreres homogenatet gennem en præ -wetted 40 um mesh filter i et 50 ml konisk centrifugerør på is og derefter tilsættes 250 pi BSA-stamopløsning til filtratet. (D) Ad-filter filtratet gennem et nyt præ-befugtet 40 um mesh-filter i et 50 ml konisk centrifuge på is. (E) Ad-filter filtratet gennem en ny 10 um mesh-filter pre-fugtet i en 50 ml konisk centrifugerør på is. (F) Overfør filtratet til 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifugeres ved 9.000 xg i 10 min ved 4 ° C. (G) Fjern supernatanten og re-suspendere og kombinere mitokondrie pellets i 1 ml Respiration Buffer. Samlet procedure er mindre end 30 minutter. Klik her for at se en større version af dette tal.

d / 51682 / 51682fig2highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 2. mitokondrie udbytte og renhed. (A) hæmocytometer og partikelstørrelse tæller mitokondrier nummer isoleret fra 0,18 ± 0,04 g væv (våd vægt) for skeletmuskulatur og leveren. (B) mitokondrie størrelse (mg / g) fordeling som påvist ved partikelstørrelse tæller. (C) mitokondrie-protein mg / g væv våd vægt for skeletmuskulatur og leveren. (D) Transmissionselektronmikroskopi billede af isolerede mitokondrier. Målestokken er 100 nm. Pile angiver eventuel forurening med ikke-mitokondrie partikler og beskadigede mitokondrier. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 < br /> Figur 3. Mitochondrial levedygtighed. Repræsentative mikrofotografier af isolerede mitokondrier (A) under fasekontrastbelysning og (B og C) under fluorescens, med mitokondrier mærket med MitoTracker Red CMXRos. Skalapanelerne er 25 um (A, B) og 5 um (C). Disse billeder viser, at mitokondrier opretholdt membranpotentiale.   Pile angiver mitokondrier mangler membranpotentialet eller snavs (D) ATP-indhold nmol / mg mitokondrieprotein som bestemt ved ATP-analyse, og (E) RCI (tilstand 3 / stat 4), bestemt ved Clark elektrode. Klik her for at se en større version af dette tal.

belastning / 51682 / 51682fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
. Figur 4. Plade kort for ATP assay Denne plade kort illustrerer, hvordan du oprette standarder (A1 - A12), mitokondrier prøver (B1 - C6), og negative kontroller (C7 - C9) for ATP-analysen. Under assay 100 pi respiration buffer, 50 pi pattedyrcelle lyseopløsning og 50 pi af rekonstitueret substratopløsning sættes til alle brønde (A1 - C9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For med held at isolere mitokondrier ved hjælp af denne protokol er det vigtigt at holde alle løsninger og vævsprøver på is for at bevare mitokondrie levedygtighed. Selv når opretholdes på is, vil isolerede mitokondrier udviser et fald i funktionel aktivitet over tid 19. Vi anbefaler, at alle løsninger og tilføjelser være allerede forberedt. Vi pre-veje og gemme Subtilisin A i 4 mg portioner i 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevare dem ved -20 ° C. Tilsvarende BSA forvejet og opbevares i 20 mg portioner i 1,5 ml mikrocentrifugerør, der kan opbevares ved -20 ° C. Lige før brug rørene fjernet fra -20 ° C og Subtilisin A og BSA opløses i 1 ml homogeniseringsbuffer til brug i mitokondrie isolation procedure.

To biopsi slag fra skeletmuskelvæv opnået med en 6 mm biopsitang give tilstrækkelige mitokondrier til anvendelse i kliniske og kirurgiske procedurer til terapeutiske interventioner 17-18. At estimere antallet af mitokondrier, vi har brugt to metoder, hæmocytometer og partikelstørrelse optælling. Det anbefales at bruge af partikelstørrelse optælling. Tælleren partikelstørrelse anvender elektriske impedans til at måle mængden af ​​partikler, der passerer gennem en åbning af en defineret størrelse. Tælleren partikelstørrelse er dyrt, men giver præcise og pålidelige skøn og er brugeren uafhængig. Estimeres ved hæmocytometriske mitokondriel tal er mere økonomisk. Vores undersøgelser har vist, at denne metode giver variable skøn, som er omtrent en størrelsesorden mindre end den, der opnås ved en partikelstørrelse tæller. Vi har også bemærket, at tællinger opnået ved hæmocytometer er stærkt afhængige af brugeren. Vi foreslår, at for at sikre konsistente estimater alle tæller ved hjælp af et hæmocytometer skal udføres af én person.

Vi har fundet ATP assay kits til at være nyttige til bestemmelse af mitochondrial funktion. Sættet leverer alle nødvendige Feagents og giver en enkel og hurtig metode til at bestemme den metaboliske aktivitet af isolerede mitokondrier. ATP assay tilvejebringer tilsvarende resultater som dem, der opnås ved hjælp af en Clark-typen elektrode og derfor er kompatibel med tidligere dataanalyse 20-21.

En stor fordel af vores mitokondrie isolation er, at den giver mulighed for isolering af et højt udbytte af levedygtige åndedræt kompetente mitokondrier fri for forurening i mindre end 30 min. Differential filtrering i stedet for differentialcentrifugering reducerer procedure tid betydeligt. Andre protokoller indarbejde flere centrifugeringstrin med samlet isolation tiden 60 min til 100 min 13-17. En anden fordel ved denne protokol er, at vævs homogenisering er standardiseret. Den kommercielle væv dissociator giver en standardiseret cyklus og giver konsistente og reproducerbare resultater. Dette er i modsætning til manuel homogenisering, der er underlagt bruger variabilitet oginkonsekvens. Vores metode til hurtig isolering af mitokondrier hjælp væv dissociation og differentieret filtrering giver en isolation tidsramme kompatibel til klinisk og kirurgisk terapeutisk intervention 17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle dyr blev behandlet i overensstemmelse med de gældende institutionelle retningslinjer. Vi har ingen konkurrerende økonomiske interesser at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af National Heart, Lung, og Blood Institute Grant HL 103542, og The BCH Anæstesi Forskningsfonds Distinguished Trailblazer Award til den fælles landbrugspolitik.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Sigma Aldrich 84100
HEPES Sigma Aldrich H4034
EGTA Sigma Aldrich E4378
Substilsin A Sigma Aldrich P5380
BSA Sigma Aldrich A7906
KH2PO4 Sigma Aldrich P5379
MgCl2 Sigma Aldrich M8266
NaCl Sigma Aldrich S6191
KCl Fisher Scientific P2173
Na2HPO4 Fisher Scientific S374
ATPlite Luminescence Assay System,
1,000 Assay Kit		 Perkin Elmer 6016941
50 ml Conical Tubes BD 352098
40 μm Nylon Filters BD  352340
GentleMACS C tube Miltenyl Biotech 120-005-331
1.5 ml Eppendorf tube Fisher Scientific 05-408-129
6 mm biopsy punch Miltex 33-36
10 μm Pluristrainer Pluriselect 43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C Marshall Scientific EP-5415C 
GentleMACS Dissociator  Miltenyl Biotech 130-093-235
96-well plates, tissue culture treated VWR 82050-732
Rotomax 120 orbital shaker Heidolph 544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode
 Microplate Reader		 BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076
Oxytherm System Hansatech Instruments
Hemacytometer Fisher Scientific 267110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
  2. Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
  3. Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
  4. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317 (2011).
  5. Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
  6. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  7. Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  8. Ernster, L., Schtaz, G. Mitochondria: a historical Review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  9. Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
  10. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
  11. Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
  12. Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
  13. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
  16. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
  17. Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
  18. McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
  19. Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
  20. Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
  21. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).

Tags

Cellebiologi kirurgiske procedurer operative efterforskningsteknikker mitokondrier isolering filtrering homogenatet væv dissociation transplantation

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 01/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:

1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

Hurtig isolering og oprensning af mitokondrier til transplantation Ved Tissue Dissociation og differentieret Filtrering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Preble, J. M., Pacak, C. A., Kondo,… More

Preble, J. M., Pacak, C. A., Kondo, H., MacKay, A. A., Cowan, D. B., McCully, J. D. Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. J. Vis. Exp. (91), e51682, doi:10.3791/51682 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter