Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rapid isolatie en zuivering van Mitochondriën voor transplantatie Door Tissue Dissociatie en differentiële Filtratie

Published: September 6, 2014 doi: 10.3791/51682
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 2, 1
1Division of Cardiothoracic Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Boston Children's Hospital and Department of Anesthesia, Harvard Medical School

ERRATUM NOTICE

Summary

Werkwijze voor snelle isolatie van mitochondria uit zoogdierweefsel biopsies beschreven. Rat lever of skeletspieren voorbereidingen werden gehomogeniseerd met een commerciële weefsel Dissociator en mitochondriën werden door differentiële filtratie geïsoleerd door nylon mesh filters. Mitochondriale isolatie is <30 min ten opzichte van 60-100 min met behulp van alternatieve methoden.

Abstract

Eerder beschreven mitochondriale isolatiemethoden middels differentiële centrifugatie en / of Ficoll gradiënt centrifugatie vereisen 60 tot 100 minuten in beslag. We beschrijven een werkwijze voor de snelle isolatie van mitochondria van zoogdieren biopten met een commercieel tissue Dissociator en differentiële filtratie. In dit protocol wordt manueel homogenisering vervangen door gestandaardiseerde homogenisering cyclus het weefsel Dissociator's. Dit zorgt voor een uniforme en consistente homogenisering van weefsel dat niet gemakkelijk wordt bereikt met handmatige homogenisering. Na weefsel dissociatie, wordt het homogenaat gefilterd door nylon mesh filters, die repetitieve centrifugeren stappen te elimineren. Hierdoor kan mitochondriale isolatie worden uitgevoerd in minder dan 30 minuten. Deze isolatie protocol levert ongeveer 2 x 10 10 levensvatbare en ademhaling bevoegde mitochondria van 0,18 ± 0,04 g (nat gewicht) weefselmonster.

Introduction

Mitochondriën bestaan ​​in elke cel in het lichaam behalve rode bloedcellen en zijn betrokken bij een groot aantal belangrijke cellulaire en metabole processen 1-4. Door deze vele functies kunnen mitochondriale schade nadelige gevolgen 3 hebben. Om mitochondriale functie en dysfunctie verschillende mitochondriale isolatiemethoden onderzoeken zijn beschreven. De vroegste gepubliceerde rekeningen van mitochondriale isolatie datum om de jaren 1940 5-8. De eerste gedocumenteerde poging aangetoond mitochondriale isolatie door malen leverweefsel in een mortier gevolgd door centrifugatie in een zoutoplossing bij lage snelheid 5,8. Later, andere groepen uitgebreid op de oorspronkelijke procedure en gedemonstreerd weefsel fractionering op basis van differentiële centrifugatie 6-8. Deze vroege methoden vormde de basis van de huidige technieken die vaak nemen homogenisering, en / of differentieel centrifugeren 9-15. Het aantal homogenizatiop en centrifugatiestappen varieert tussen protocollen. Deze repetitieve stappen verhogen de tijd voor mitochondriële isolatie en uiteindelijk levensvatbaarheid verminderen. Daarnaast kunnen handmatige homogenisering mitochondriale schade en inconsistente resultaten veroorzaken als ze niet goed gecontroleerd 10,16.

Onlangs, gebruikten we homogenisering en differentiële centrifugatie om mitochondriën voor transplantatie te isoleren in hartspierweefsel 17,18. Deze langdurige isolatie procedure vereist ongeveer 90 min en de klinische toepasbaarheid van deze methode was dus beperkt. Met het oog op acute therapeutisch gebruik in klinische en chirurgische behandeling hebben we een snelle mitochondriale isolatieprocedure die in minder dan 30 min kan worden uitgevoerd ontwikkeld.

De belangrijkste voordelen van dit protocol is dat gestandaardiseerde weefsel dissociatie zorgt voor een uniforme en consistente homogenisering van weefsel dat niet gemakkelijk wordt bereikt met handmatige homogenisering. In addition, het gebruik van differentiële filtratie in plaats van differentiële centrifugatie elimineert tijdrovend en repetitief centrifugatiestappen waardoor meer snelle isolatie van zeer gezuiverd, levensvatbare en ademhaling bevoegde mitochondria.

Het vermogen om levensvatbare en ademhaling bevoegde mitochondria isoleren in minder dan 30 minuten maakt klinische toepasbaarheid. Deze isolatie protocol heeft potentieel voor gebruik in een coronaire bypass operatie chirurgie (CABG) en andere therapeutische procedures.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Voorbereiding

  1. Bereid 1 M K-HEPES Stock Solution (pas pH op 7,2 met KOH).
  2. Bereid 0,5 M K-EGTA Stock Solution (pas pH op 8,0 met KOH).
  3. Bereid 1 M KH 2 PO 4 Stock Solution.
  4. Bereid 1 M MgCl2 voorraadoplossing.
  5. Bereid Homogenisatie Buffer (pH 7,2) 300 mM sucrose, 10 mM K-HEPES en 1 mM K-EGTA. Bewaren bij 4 ° C.
  6. Bereid Ademhaling buffer 250 mM sucrose, 2 mM KH 2PO 4, 10 mM MgCl2, 20 mM K-HEPES Buffer (pH 7,2) en 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Bewaren bij 4 ° C.
  7. Bereid 10x PBS voorraadoplossing door oplossen 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4 en 2,4 g KH 2PO 4 tot 1 L tweemaal gedestilleerd H2 O (pH 7.4).
  8. Bereid 1x PBS pipetteren 100 ml 10x PBS tot 1 L tweemaal gedestilleerd H2O
  9. Bereid Subtilisine Een Stock door weging van 4 mg Subtilisine A ineen 1,5 ml microcentrifugebuis. Bewaren bij -20 ° C tot gebruik.
  10. Bereid BSA De door weging uit 20 mg BSA in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Bewaren bij -20 ° C tot gebruik.

Mitochondriale Isolatie (figuur 1)

  1. Onmiddellijk voorafgaand aan isolatie lossen Subtilisine A in 1 ml buffer Homogeniseren.
  2. Onmiddellijk voorafgaand aan isolatie, BSA opgelost in 1 ml buffer Homogeniseren.
  3. Verzamel twee verse weefselmonsters met een 6 mm biopsie punch en op te slaan in 1x PBS in een 50 ml conische centrifugebuis op ijs.
  4. Breng de twee 6 mm stempels weefsel een dissociatie C buis met 5 ml ijskoude buffer Homogeniseren.
  5. Homogeniseer het weefsel door het aanbrengen van de dissociatie C buis op het weefsel Dissociator en selecteer de ingestelde mitochondriale isolatie cyclus (60 seconden homogeniseren).
  6. Verwijder de dissociatie C buis om een ​​ijsemmer.
  7. Voeg 250 ul van Subtilisine Een voorraad oplossing voor dehomogenaat, meng door omkeren en incubeer de homogenaat op ijs gedurende 10 minuten.
  8. Plaats een 40 um mesh filter op een 50 ml conische centrifugebuis op ijs en pre-natte het filter met homogenisatie Buffer en filteren het homogenaat in de 50 ml conische centrifugebuis op ijs.
  9. Voeg 250 ul van vers bereide BSA Stock Solution aan het filtraat en meng door omkeren.
    Opmerking: Sla deze stap over als mitochondriaal eiwit bepaling nodig is.
  10. Plaats een 40 um filter op een 50 ml conische centrifugebuis op ijs en pre-natte het filter met homogenisatie Buffer en filteren het homogenaat in de 50 ml conische centrifugebuis op ijs.
  11. Plaats een 10 um filter op een 50 ml conische centrifugebuis op ijs en pre-natte het filter met homogenisatie Buffer en filteren het homogenaat in de 50 ml conische centrifugebuis op ijs.
  12. Breng het filtraat twee voorgekoelde 1,5 ml microfuge buizen en centrifugeer bij 9000 xg gedurende 10 minuten bij4 º C.
  13. Verwijder supernatant en opnieuw op te schorten en te combineren pellets in 1 ml ijskoude Ademhaling Buffer.

ATP Assay

Opmerking: Om de metabole activiteit van geïsoleerde mitochondria een ATP-luminescentie test kan worden uitgevoerd met behulp van een ATP testkit bepalen. Het protocol, reagentia en standaarden werden geleverd in de testkit. Een samenvatting van de procedure wordt hieronder beschreven.

  1. Equilibreer kitreagentia tot kamertemperatuur.
  2. Bereid 10 mM ATP voorraadoplossing door de oplossing gelyofiliseerd ATP pellet in 1170 ui dubbel gedestilleerd water. Slaan ATP standaard Stock Solution en bereid mitochondriale monsters op ijs.
  3. Voeg 5 ml Substraat Bufferoplossing een flesje met gevriesdroogd substraatoplossing. Meng voorzichtig en plaats in het donker.
  4. Voeg 100 ul van buffer Ademhaling alle putjes van een zwarte, ondoorzichtige bodem, 96 wells plaat.
  5. Voeg 10 ul van mitochondria van de bereide monsters in elk putje ofa zwart, ondoorzichtige bodem, 96 wells plaat. Opmerking: De monsters worden in drievoud uitgeplaat. Omvatten een rij voor normen en drie putten voor de negatieve controle (Ademhaling Buffer).
  6. Voeg 50 ul van zoogdiercellen lysisoplossing alle putjes, inclusief standaarden en controles.
  7. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 5 min op een orbitale schudder bij 125 rpm.
  8. Tijdens de incubatie bereiden ATP normen in concentraties van 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM en 0,0001 mM ATP van 10 mM ATP voorraadoplossing. Store normen op het ijs.
  9. Na de incubatie, voeg 10 pl ATP normen overeenkomstige putjes zoals aangegeven op de plaat kaart. Opmerking: Normen worden in duplo uitgevoerd.
  10. Voeg 50 ul van de bereide substraatoplossing aan elke well.
  11. Incubeer de plaat bij 37 ° C op de orbitale schudder gedurende 5 minuten bij 125 rpm.
  12. Open Gen5 1.11 software op een computer die verbonden zijn met de spectrofotometer.
  13. Onder "Create a New Item ", klik op" Experiment ".
  14. Klik op "Default Protocol". Klik op "Ok".
  15. In de linker kolom, selecteert u "Protocol", dan "Procedure".
  16. Selecteer "Delay". Ingesteld op 00:10:00. Klik op "Ok".
  17. Selecteer "Lees". Selecteer "luminescentie" van drop-down menu. Pas de overige instellingen om de volgende: Lees het type Endpoint, Integratie tijd 0: 01.00 MM: ss.ss, Filter Stelt 1, Emissie Hole, Optics Positie Top, Gevoeligheid 100, Top Probe Verticale offset 1,00 mm.
  18. Als de plaat klaar is om te worden geanalyseerd, klikt u op het pictogram "Lees Plate" op de bovenste rij. Klik op "Read". Als de spectrofotometer wordt geopend, plaatst u de plaat in de lade met goed A1 in de linker bovenhoek. Een doos met de temperatuur zal openen. Klik op "Read". Opmerking: Hogere waarden correleren met een verhoogde ATP-niveaus en een hogere metabolische activiteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een figuur waarin de procedurele stappen in de isolatie van mitochondriën met weefsel dissociatie en differentiële filtratie wordt getoond in figuur 1. Totale procedure is minder dan 30 minuten.

Weefsel monsters werden verkregen met een 6 mm punch biopsie. Tissue gewicht bedroeg 0,18 ± 0,04 g (nat gewicht). Het aantal mitochondria geïsoleerd zoals bepaald door deeltjesgrootte telling bedroeg 2,4 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitochondria voor skeletspieren en 2,75 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitochondria voor leverpreparaten (Figuur 2A). Om te kunnen vergelijken mitochondriale nummer werd ook bepaald door hemocytometer. Mitochondriale nummer werd onderschat, zoals bepaald door hemocytometer als 0,11 x 10 10 ± 0.04 x 10 10 mitochondriën voor de skeletspieren en 0,34 x 10 10 ± 0.09 x 10 10 mitochondriën voor leverpreparaten (Figure 2A). Mitochondriale diameter zoals bepaald door afmeting gebaseerd deeltjesteller is getoond in figuur 2B. De vertegenwoordiger tracing toont de geïsoleerde mitochondriën zijn gelokaliseerd onder een piek met een gemiddelde diameter van 0,38 ± 0,17 micrometer in overeenstemming met eerdere rapporten 7.

Mitochondriale eiwit / g (nat gewicht) uitgangsweefsel zoals bepaald met bicinchoninezuur (BCA) assay was 4,8 ± 2,9 mg / g (nat gewicht) en 7,3 ± 3,5 mg / g (nat gewicht) van de skeletspieren en de lever monsters toe (figuur 2C).

Mitochondriale zuiverheid werd bepaald met transmissie-elektronenmicroscopie en wordt getoond in Figuur 2D. Mitochondria zijn vertegenwoordigd dichte worden elektronen met minder dan 0,01% wordt gebroken of beschadigd. Verontreiniging door niet-mitochondriale deeltjes kleiner is dan 0,001%.

Mitochondriale levensvatbaarheid werd bepaald door Mitotracker Rode zoals eerder DEschreven 17,18. Onze resultaten tonen aan dat de geïsoleerde mitochondria handhaven membraanpotentiaal (Figuren 3A - C).

ATP werd bepaald met een luminescerende assay kit. Een plaat kaart voor de ATP assay wordt getoond in figuur 4. ATP standaarden werden uitgeplaat in duplo. Mitochondriale monsters en negatieve controles werden in drievoud uitgeplaat. ATP gehalte bedroeg 10,67 ± 4,38 nmol / mg mitochondriaal eiwit en 14,83 ± 4,36 nmol / mg mitochondriaal eiwit skeletspieren en lever monsters respectievelijk (Figuur 3D).

Mitochondriale ademhaling werd gemeten met een Clark elektrode zoals eerder beschreven 17,18. Mitochondriale zuurstof verbruik bedroeg 178 ± 17 nM O 2 / min / mg mitochondriaal eiwit voor skeletspieren en 176 ± 23 nM O 2 / min / mg mitochondriaal eiwit voor leverpreparaten. Respiratoire controle index (RCI) waarden waren 2,45 ± 0,34 eend 2,67 ± 0,17 voor de skeletspieren en de lever monster voorbereidingen respectievelijk (figuur 3E). Deze resultaten zijn vergelijkbaar met die in onze eerdere studies handmatig homogenisatie en differentiële centrifugatie om mitochondria 17-18 isoleren.

Figuur 1
Figuur 1 Schema voor het isoleren van mitochondriën met weefsel dissociatie en differentiële filtratie. (A) Transfer twee 6 mm biopt slagen op 5 ml van homogenisatie Buffer in een dissociatie C buis en homogeniseren van de monsters met behulp van 1 min homogenisering programma het weefsel Dissociator's. (B) Voeg 250 ul Subtilisine Een stockoplossing aan het homogenaat in de dissociatie C buis en incubeer op ijs gedurende 10 minuten. (C) Filter het homogenaat door een pre -wetted 40 urn zeef in een 50 ml conische centrifugebuis op ijs en voeg 250 ul BSA voorraadoplossing aan het filtraat. (D) Re-filter het filtraat door een nieuwe vooraf bevochtigd 40 urn zeef in een 50 ml conische centrifuge op ijs. (E) Re-filter het filtraat door middel van een nieuwe pre-bevochtigd 10 um zeef in een 50 ml conische centrifugebuis op ijs. (F) Breng het filtraat en 1,5 ml microfugebuizen en centrifugeer bij 9000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. (G) Verwijder het supernatant en resuspendeer en combineren de mitochondriale pellets in 1 ml buffer ademhaling. Totale procedure is minder dan 30 minuten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

d / 51682 / 51682fig2highres.jpg "width =" 600 "/>
Figuur 2 Mitochondriale opbrengst en zuiverheid. (A) hemocytometer en deeltjesgrootte teller aantal mitochondriën geïsoleerd uit 0,18 ± 0,04 g weefsel (nat gewicht) van de skeletspieren en de lever. (B) Mitochondrial size (mg / g) zoals gedetecteerd door de deeltjesgrootte teller. (C) Mitochondrial proteïne mg / g nat gewicht weefsel voor skeletspieren en de lever. (D) Transmissie elektronenmicroscopie beeld van geïsoleerde mitochondria. Schaal bar is 100 nm. Pijlen geven een mogelijke verontreiniging met niet-mitochondriale deeltjes en beschadigde mitochondriën. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3 < br /> Figuur 3 Mitochondriale levensvatbaarheid. Vertegenwoordiger microfoto van geïsoleerde mitochondria (A) onder fase contrast verlichting en (B en C) onder fluorescentie, met mitochondria gelabeld met Mitotracker Red CMXRos. Schaalbalken zijn 25 urn (A, B) en 5 urn (C). Deze beelden geven aan dat mitochondria gehandhaafd membraanpotentiaal.   Pijlen geven mitochondriën ontbreekt membraanpotentiaal of puin (D) ATP-gehalte nmol / mg mitochondriaal eiwit, zoals bepaald door de ATP-test en (E) RCI (toestand 3 / toestand 4), zoals bepaald door Clark elektrode. Klik hier om een grotere versie van de foto dit cijfer.

belasting / 51682 / 51682fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
. Figuur 4 Plate kaart voor ATP-test Deze plaat kaart illustreert hoe het opzetten van standaarden (A1 - A12), mitochondria monsters (B1 - C6) en negatieve controles (C7 - C9) voor de ATP-test. Tijdens de test werd 100 ui van ademhaling buffer, 50 ui zoogdiercel lysis-oplossing en 50 pi gereconstitueerde substraatoplossing toegevoegd aan alle putjes (A1 - C9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Met succes isoleren mitochondria met dit protocol is het essentieel om alle oplossingen en weefselmonsters op ijs houden mitochondriale levensvatbaarheid behouden. Zelfs wanneer op ijs wordt geïsoleerde mitochondria een afname van functionele activiteit vertonen in de tijd 19. We raden aan dat alle oplossingen en aanvullingen vooraf worden voorbereid. We vooraf wegen en te bewaren Subtilisine A in 4 mg aliquots in 1,5 ml microfuge buizen en opgeslagen bij -20 ° C. Evenzo BSA is pre-gewogen en opgeslagen in aliquots 20 mg in 1,5 ml microfuge buizen die bij -20 ° C worden bewaard. Vlak voor de buizen gebruikt worden verwijderd uit -20 ° C en subtilisine A en BSA opgelost in 1 ml Homogeniseren buffer voor gebruik in de mitochondriale isolatieprocedure.

Twee biopsie ponsen van skeletspierweefsel verkregen met een 6 mm punch biopsie voldoende mitochondria voor gebruik in klinische en chirurgische procedures voor therapeutische interventies 17-18. Om het aantal mitochondriën hebben we twee methodes, hemocytometer en deeltjesgrootte tellen gebruikt te schatten. Het gebruik van deeltjesgrootte tellen aanbevolen. De deeltjesgrootte teller gebruikt elektrische impedantie aan de hoeveelheid deeltjes die door een opening met een gedefinieerde afmeting te meten. De deeltjesgrootte teller is kostbaar, maar levert nauwkeurige en betrouwbare schattingen en kan door de gebruiker zelfstandig. Mitochondriale aantal geschat door hemocytometry is zuiniger. Onze studies hebben aangetoond dat deze methode variabele schat dat ongeveer een orde van grootte lager dan die verkregen met een deeltjesgrootte teller zijn. We hebben ook opgemerkt dat tellingen verkregen door hemocytometer zijn sterk afhankelijk van de gebruiker. Wij raden u aan een consistente schattingen alle punten met behulp van een hemocytometer dient te worden uitgevoerd door een persoon.

We hebben gevonden ATP testkits nuttig voor het bepalen mitochondriale functie te zijn. De kit voorziet in alle noodzakelijke reagents en een eenvoudige en snelle methode voor het bepalen van de metabolische activiteit van geïsoleerde mitochondria. De ATP-bepaling geeft dezelfde resultaten als die verkregen met een Clark-elektrode en dus verenigbaar met eerdere gegevensanalyse 20-21.

Een groot voordeel van onze mitochondriale isolatie protocol is dat het voor de isolatie van een hoge opbrengst van levensvatbare, ademhaling bevoegde mitochondria vrij van verontreinigingen in minder dan 30 minuten. Differentiële filtratie in plaats van differentiële centrifugatie vermindert proceduretijd. Andere protocollen op te nemen verschillende centrifugeren stappen met totale isolatie voorlopig 60 min tot 100 min 13-17. Een ander voordeel van dit protocol is dat weefsel homogenisatie wordt gestandaardiseerd. De commerciële weefsel Dissociator een gestandaardiseerde cyclus levert consistente en reproduceerbare resultaten. Dit in tegenstelling tot handmatige homogenisering die onder user variabiliteit eninconsistentie. Onze methode voor de snelle isolatie van de mitochondriën met behulp van weefsel dissociatie en differentieel filtratie zorgt voor een isolatie tijdsbestek compatibel voor klinische en chirurgische therapeutische interventie 17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de huidige institutionele richtlijnen. We hebben geen concurrerende financiële belangen bekend te maken.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door de National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL 103542, en de BCH Anesthesia Research Foundation Distinguished Trailblazer Award voor CAP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Sigma Aldrich 84100
HEPES Sigma Aldrich H4034
EGTA Sigma Aldrich E4378
Substilsin A Sigma Aldrich P5380
BSA Sigma Aldrich A7906
KH2PO4 Sigma Aldrich P5379
MgCl2 Sigma Aldrich M8266
NaCl Sigma Aldrich S6191
KCl Fisher Scientific P2173
Na2HPO4 Fisher Scientific S374
ATPlite Luminescence Assay System,
1,000 Assay Kit		 Perkin Elmer 6016941
50 ml Conical Tubes BD 352098
40 μm Nylon Filters BD  352340
GentleMACS C tube Miltenyl Biotech 120-005-331
1.5 ml Eppendorf tube Fisher Scientific 05-408-129
6 mm biopsy punch Miltex 33-36
10 μm Pluristrainer Pluriselect 43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C Marshall Scientific EP-5415C 
GentleMACS Dissociator  Miltenyl Biotech 130-093-235
96-well plates, tissue culture treated VWR 82050-732
Rotomax 120 orbital shaker Heidolph 544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode
 Microplate Reader		 BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076
Oxytherm System Hansatech Instruments
Hemacytometer Fisher Scientific 267110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
  2. Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
  3. Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
  4. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317 (2011).
  5. Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
  6. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  7. Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  8. Ernster, L., Schtaz, G. Mitochondria: a historical Review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  9. Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
  10. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
  11. Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
  12. Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
  13. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
  16. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
  17. Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
  18. McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
  19. Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
  20. Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
  21. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).

Tags

Cellular Biology chirurgische procedures operatieve onderzoekstechnieken mitochondria isolatie filtratie homogenaat weefsel dissociatie transplantatie

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 01/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:

1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

Rapid isolatie en zuivering van Mitochondriën voor transplantatie Door Tissue Dissociatie en differentiële Filtratie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Preble, J. M., Pacak, C. A., Kondo,… More

Preble, J. M., Pacak, C. A., Kondo, H., MacKay, A. A., Cowan, D. B., McCully, J. D. Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. J. Vis. Exp. (91), e51682, doi:10.3791/51682 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter