Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Ekspression af rekombinant Cellulase Cel5A fra Published: June 13, 2014 doi: 10.3791/51711
Automatic Translation
1, *1, *1, 2, 1
1Institute for Molecular Biotechnology, Bio7, RWTH Aachen University, 2Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology
* These authors contributed equally

Summary

Tobaksplanter blev anvendt til at fremstille en fungal cellulase, TrCel5A via et transient ekspressionssystem. Udtrykket kan overvåges ved hjælp af et fluorescerende fusionsprotein, og proteinet aktivitet blev karakteriseret efter ekspression.

Abstract

Cellulose nedbrydende enzymer, cellulaser, er mål for både forskning og industrielle interesser. Overvægten af ​​disse enzymer i vanskelige-til-kultur organismer, såsom hyfer-building svampe og anaerobe bakterier, har fremskyndet brug af rekombinante teknologi på dette område. Plant ekspressionsmetoder er en ønskelig for stor-skala produktion af enzymer og andre industrielt anvendelige proteiner. Heri er fremgangsmåder til transient ekspression af en svampeinfektion endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A i Nicotiana tabacum påvist. Vellykket proteinekspression vist overvåges ved fluorescens under anvendelse af et mCherry-enzym-fusionsprotein. Derudover er et sæt af grundlæggende test bruges til at undersøge aktiviteten af forbigående udtrykt T. reesei Cel5A, herunder SDS-PAGE, Western blotting, zymografi, samt fluorescens og farvestofbaserede substrat nedbrydnings assays. Det her beskrevne system kan anvendes til at fremstille en aktiv celleulase i en kort periode, for at vurdere potentialet for yderligere produktion i planter gennem konstitutive eller inducerbare ekspressionssystemer.

Introduction

Nedbrydning af lignocellulose biomasse og dets omdannelse til flydende brændstof er blevet planlagt som en metode til at mindske afhængigheden af ​​fossile brændstoffer. En væsentlig forhindring i at etablere økonomisk gennemførlige biomasse systemer er i den enzymatiske nedbrydning af cellulose og hemicellulose 1. Plant ekspressionssystemer stort potentiale til fremstilling af enzymer i industriel skala. Landbrugssystemer til at høste planter økonomisk og volumen er allerede etableret, da de har været i tusinder af år. Produktionen af cellulaser i planter er ønskeligt på grund af faktorer som den lethed autohydrolysis 2, og potentialet for at maksimere brugen af lavere enzym niveau ved at øge fordøjeligheden af plante cellevægge 1. Endelig tillader plantesystemer målretning af rekombinante proteiner til specifikke områder af planteceller og er i stand til at posttranslationelt ændre enzymer, hvor det er påkrævet 3.

ve_content ">

Nicotiana tabacum (tobak) er meget almindeligt anvendt som en model organisme til heterologe protein udtryk studier i planter, på grund af sin hurtige vækst og biomasse akkumulerende har 4. Transient ekspression af rekombinante proteiner er en teknik, som giver proteinproduktion i korte perioder 5, samtidig med at fleksibilitet med hensyn til lokalisering og dermed posttranslationelle modifikationer af de udvalgte proteiner, dvs cellulaser. Dette muliggør produktionen af ​​cellulase (r) til grundlæggende analyse, mens også om grundlaget for yderligere strategier ekspression i planter. Ved hjælp af en sådan forbigående udtryk strategi, er en endoglucanase fra glycosylhydrolase familie 5, Cel5A, der stammer fra svampeværten Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6. produceres (i det følgende benævnt TrCel5A). TrCel5A er et 42 kDa protein, som er indbygget glycosyleret og er yderst aktive i hydroylzing cellulose kæder 7.

Transient ekspression her beskrevne teknik er baseret på et relativt almindeligt anvendte system, infiltrere planternes blade med Agrobacterium, der bærer genet af interesse i en passende ekspressionsvektor. At give mulighed for hurtig analyse af succes i planta udtryk, kan TrCel5A også udtrykkes som et fusionsprotein med mCherry, en monomer fluorescerende protein oprindeligt stammer fra Discosoma sp. Protein dsRed 8, med yderligere seks histidinrester (His-tag) fusioneret til C-terminalen (TrCel5A-mCherry). Kan således monitoreres ekspression af det heterologe fusionsprotein TrCel5A-mCherry inden for den voksende plante ved hjælp af grønt lys at undersøge mCherry spredning. Hvis det ønskes, kan tynde snit af plantematerialet undersøges i grønt lys mikroskopisk at indføre den specifikke lokalisering af proteinet. For dette arbejde, signal-og transidde peptider blev indarbejdet i konstruktionen, at lokalisere det heterologe protein eksport til det endoplasmatiske reticulum 9.

For at analysere aktiviteten af ​​planteprodukter udtrykt cellulaser, herunder TrCel5A en række af cellulase aktivitet test kan køres. Efter ekstraktion af de samlede opløselige vegetabilske proteiner kan TrCel5A delvist oprenset under anvendelse af en termisk inkubation teknik. Protein størrelse er etableret ved hjælp af SDS-PAGE efterfulgt af Western blotting. Zymografi kan anvendes til at analysere aktivitet mod substrater, fx cellulose, som har været carboxy-methylerede (hvilket carboxymethylcellulose: CMC) opløselighed 10. Cellulase og glucosidase-aktivitet kan overvåges ved hjælp af fluoroforen 4-methylumbelliferyl-(4-MU) i forbindelse med β-D-cellobiosid (kombineret: 4-MUC). En anden metode til at vurdere endoglucanaseaktivitet involverer spektrometriske analyse af CMC, som er blevet forbundet med et azo-dI (Remazolbrilliant Blue R) 11.. Derudover kan protein-aktivitet i begge endoglucanaser og en række cellulaser overvåges ved anvendelse af en sukker-analyse test, såsom p-hydroxy-benzoesyre-hydrazid (PAHBAH)-assay 12. Disse teknikker kan anvendes til at belyse og kvantificere aktiviteten af ​​det udtrykte cellulase af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Vækst af vildtype N. tabacum Planter

  1. At vokse N. tabacum L. cv. Petit Havana SR1 planter på jorden, skal du placere tobak frø på passende krukker fyldt med normal pottemuld for spiring. Efter 2 uger, overføre kimplanter til individuelle potter. Inkubér planter i et drivhus med konstant 22 ° C (mørk periode), eller 25 ° C (lys periode) og 70% relativ luftfugtighed. Giv belysning i en 16/8 timers lys / mørke-cyklus (f.eks Philips IP65 400 W lamper, 180 pmol · sek -1 · m -2; λ = 400-700 nm) og vand dagligt.

2.. Transient ekspression af TrCel5A og TrCel5A-mCherry Proteiner

  1. Under sterile forhold, plukke enkelte kolonier af Agarobacterium tumefaciens (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RifR) indeholdende enten pTRAkc-ER-TrCel5A eller pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry og overførsel til en Erlenmeyerkolbe, som indeholder 10 ml gærekstraktbouillon (YEB, fremstillet som pr fabrikantens specifikationer) medium og kanamycin (50 mg / ml), rifampicin (50 mg / ml) og carbenicillin (100 mg / ml) til selektion. Der inkuberes i 36-40 timer ved 26 ° C og 180 rpm. Bemærk: Konstruktionen af egnede konstruktioner for protein-ekspression er uden for rammerne af dette papir, men for vejledning, kan de metoder Maclean et al 13 og Munro og Pellham 14 skal følges for konstruktion design..
  2. Tag 200 pi hver kultur til at pode 20 ml YEB med antibiotiske koncentrationer nævnt ovenfor, og inkuberes under samme betingelser som før.
  3. Efter 36 til 40 timer, preinduce kulturerne ved tilsætning af 2 pi acetosyringon (200 uM slutkoncentration), 100 pi 40% (w / v) glukose og 200 pi 1 M MES-puffer pH 5,6. Der inkuberes natten over.
  4. Forbered 100 ml af en 2x infiltration buffer (100 g / l saccharose, 3,6 g / L glucose, 8,6 g / l Murashige og Skoog basale salte, Justere pH til 5,6 ved anvendelse af kaliumhydroxid).
  5. Måle OD600 af kulturerne med en 1:5 fortynding, indtil den når en OD600 på 5-6. Beregn kultur nødvendige volumen til 30 ml infiltration medium ved OD600. Tilsættes 15 ml 2x infiltration buffer, derefter tilføje deioniseret H 2 O for at gøre buffer op til 30 ml.
  6. Tag planter fra drivhuset og bruge en pipettespidsen nick abaxial side af 3. til 5. blad fra toppen for at lette infiltration.
  7. Brug en pipette spids til nick den abaxial side af bladene for at lette infiltration.
  8. Fyld en sprøjte med infiltration medium og sætte det (uden nål) på en af ​​de tidligere foretagne nicks. Støt sprøjte med en finger på adaxial blad side. Tryk mediet forsigtigt ind i vævet af interveinal blad zoner. Bemærk: Efter infiltration, dyrke planter i et drivhus under de samme betingelser som beskrevet ovenfor. Også opretholde en lige andel af untreated, ikke-forbigående udtryk planter (NTEPs) som kontrol, under de samme betingelser som infiltrerede planter.

3.. Vurdering af TrCel5A-mCherry Expression i planternes blade

  1. Efter 4-6 dage, tage planter infiltreret med A. tumefaciens indeholdende pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry fra drivhuset og placere dem i et mørkt rum til fluorescens analyse.
  2. At visualisere fluorescens i blad sektioner udtrykker TrCel5A-mCherry, lys planter bruger en bærbar lyskilde udsender grønt lys ved 515 nm med et rødt filter (620-750 nm). Bemærk: I dybden kan opnås karakterisering af protein udtryk i bladene plante med tynde sektionering blade med en vibratome og eksamen under lys og fluorescens mikroskopi. Til dette skal du følge nedenstående trin:
    1. Skær små sektioner af ca 5 x 5 mm størrelse fra et infiltreret blade og indlejre dem i 4% agarose opløst i 50 mM phosphatbuffer (pH 5,7).
    2. Cutsektion af 80-90 um størrelse fra indlejrede blade ved hjælp af en vibratom. Læg dem på et objektglas, dække med buffer eller et dækglas og undersøge dem ved hjælp af et mikroskop ved 10X forstørrelse med en fluorescens-detektor, ved hjælp af den samme bølgelængde og filter anført ovenfor.

4.. TrCel5A Udtræk fra tobaksblade

  1. Klip stykker fra tobaksblade til en omtrentlig vægt på 1 g fra planter inficeret med A. tumefaciens indeholdende pTRAkc-ER-TrCel5A og sted i en morter precooled med flydende kvælstof. Tilsæt en passende mængde af flydende kvælstof til prøverne. Grind blade til pulver ved hjælp af en precooled pistil.
  2. Tilsæt 2 ml phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid til jorden blad sagen og bland indtil størstedelen af ​​blade sagen er i suspension. Centrifuge ekstrakt ved 15.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C og tage protein supernatant.
  3. CentriFuge ekstraktet ved 15.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C og tage protein-holdige supernatant være omhyggelig med ikke at forstyrre bundfaldet. Kassér pelleten.
  4. Delvist oprense TrCel5A ved at inkubere protein-indeholdende supernatant ved 55 ° C i 10 min. Lov til at stå ved stuetemperatur i yderligere 10 minutter, hvorefter der centrifugeres ved 15.000 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Gentag delvis oprensning fremgangsmåde til ikke-infiltreret planter til opnåelse kontrolprøver. Brug disse prøver til alle følgende forsøg. Bemærk: Protein løsninger kan opbevares ved 4 ° C i op til 1 uge eller ved -20 ° C i op til 3 måneder.
  5. Gentag delvis oprensning fremgangsmåde til ikke-infiltreret planter til opnåelse kontrolprøver. Brug disse prøver til alle følgende forsøg. Bemærk: Protein løsninger kan opbevares ved 4 ° C i op til 1 uge eller ved -20 ° C i op til 3 måneder.

5.. SDS-PAGE, Western blotting, og Azo-CMC Zymografi af TrCel5A-mCherry </ P>

  1. Køb eller forberede 12% (w / v) SDS-PAGE-geler som pr etablerede metoder 15.
  2. Opløs CMC i vand til opnåelse af en 1,5% (w / v) opløsning. For at gøre CMC-SDS-PAGE-geler, erstatte 1 ml 1,5% CMC 1 ml vand i en 10 ml SDS-PAGE-gel mix opløsning, hvilket resulterer i en 0,1% (w / v) CMC + 12% (w / v ) SDS-PAGE-gel mix. Hæld gelen normalt. Bemærk: Sørg for, at CMC i den oprindelige opløsning er fuldstændig opløst ved en kombination af omrøring og opvarmning til 40 ° C (gentag direkte forud for udarbejdelsen af ​​gelen opløsning).
  3. Denaturere prøver ved kogning i tilstedeværelse af SDS, som pr etablerede metoder 12. Som en positiv kontrol, kan du bruge en 1:500 fortynding af en kommercielt tilgængelig cellulaseblanding fra T. reesei, såsom T. reesei ATCC 26921. Som en negativ kontrol skal fremstilles tilsvarende proteinopløsning fra ikke-infiltreret blade (NTEPs).
  4. Udføre elektroforese som pr normale protokoller 15,fx bruge 200 V for ~ 50 min med elektroforesen standset, når farvefronten nåede bunden af gelen.
  5. Farv en SDS-PAGE-gel under anvendelse af 0,1% (w / v) Coomassie brilliant blå og affarvning under anvendelse af en methanol / iseddike blanding. Bemærk: Hurtig farvning og affarvning kan udføres ved forsigtigt at opvarme farvning og affarvning løsninger, dvs ved hjælp af en mikrobølgeovn for ~ 15 sec at varme (men ikke koge) først farvningen og derefter Affarvningstrinnet løsninger, ændre Affarvningsopløsningen efter 10 min eller når den afkøles, og gentag med nye Affarvningsopløsningen.
  6. Udfør Western blotting af en SDS-PAGE-gel ved anvendelse af etablerede protokoller 16,17. Brug følgende antistoffer: et polyklonalt kanin-antistof mod et His-tag (primær) og et polyklonalt gede-anti-kanin-antistof-Fc-region, som er blevet konjugeret til alkalisk phosphatase (sekundær). Bemærk: Der bør vælges sekundære antistoffer for at muliggøre visualisering ved hjælp nitroblue tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 '-indolyphosphate p-toluidin salt (NBT / BCIP) som beskrevet 18.
  7. Udføre i-gel Proteingenfoldningstrin på 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-gel ved at inkubere gelen i 1,5% (w / v) β-cyclodextrin, 20 mM phosphat-citrat-buffer, pH 6,5, ved stuetemperatur med forsigtig omrystning i 15 min 19.
  8. Kassér β-cyclodextrin-opløsning og vaskes hurtigt gelen med H 2 O. Inkuber ved stuetemperatur i 50 mM natriumacetatpuffer (pH 4,8) til en yderligere 15 minutter. Udfør CMC zymografi under anvendelse af genfoldet 0,15% CMC SDS-PAGE-gel ved at inkubere gelen i 30 mM natriumacetat-puffer pH 4,8 i 20 minutter ved 50 ° C.
  9. Udfør CMC zymografi under anvendelse af genfoldet 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-gel ved at inkubere gelen i 30 mM natriumacetat-puffer (pH 4,8) i 20 minutter ved 50 ° C.
  10. Farv gelen i 10 minutter ved hjælp af en 0,1% w / v Congo røde opløsning og affarvning i 30 minutter eller indtil klare bånd observeret ved anvendelse af 1 M Na-Cl. Vask af gelen med 0,3% (v / v) eddikesyre for klarere billeddannelse.

6.. 4-MUC Activity Assay af TrCel5A

  1. Forbered en stamopløsning på 10 mM 4-MUC i 50% (v / v) methanol, og opbevar den i mørke ved RT
  2. Umiddelbart før assayet udarbejde en 4-MUC 2x brugsopløsning, sammensat af 1 mM 4-MUC og 60 mM natriumacetat, pH 4,8.
  3. Udfør denne test på prøver indeholdende 100 ul blad protein (med eller uden TrCel5A inducerbart udtrykte), 100 pi en kommercielt tilgængelig cellulaseblanding fra T. reesei 1:1000 og ren H 2 O, hhv. Kør hver prøve i tre eksemplarer.
  4. Afpipetteres 100 ul af 4-MUC brugsopløsning i separate brønde i en 96-brønds plade, derefter tilsættes 100 pi af hver prøve.
  5. Bestem 0 min tidspunkterne 4-MU-fluorescens via fluorescerende spektroskopi ved anvendelse af en excitationsbølgelængde på 360 nm og en emissionsbølgelængde på 465 nm.
  6. Pladerne inkuberes i 20min ved 50 ° C, dækket med selvklæbende låg for at forhindre fordampning. Reaktionen standses ved frysning (eller ved at kombinere 100 ul 0,15 M glycin, pH 10,0, og 100 pi af prøven i en separat plade).
  7. Bestem endpoint af 4-MU fluorescens gennem fluorescerende spektroskopi, ved hjælp af en excitationsbølgelængde på 360 nm og en emission bølgelængde på 465 nm. Fratræk 0 min fra endepunkt (20 min) tidspunkterne for at opnå ændringen i fluorescens værdier.

7. Azo-carboxymethyl cellulose Activity Assay af TrCel5A

  1. Forbered en bestand på 1,5% (w / v) Azo-CMC, der er lagret ved stuetemperatur, og en udfældning opløsning indeholdende 18 mM zinkacetat, 0,5 M natriumacetat, pH 5 og 80% ethanol (v / v), gem ved stuetemperatur temperatur.
  2. Umiddelbart før assayet udarbejde en Azo-CMC 2x brugsopløsning, der består af 1% (w / v) Azo-CMC (i H2O) og 60 mM natriumacetat, pH 4,8.
  3. Kombiner 50 pi af prøven og 50 pi af det arbejde,ning opløsning i 1,5 ml rør.
  4. Test prøver indeholdende 50 pi blad protein (med eller uden TrCel5A udtrykt transient); 100 pi af en kommercielt tilgængelig cellulaseblanding fra T. reesei fortyndet 1:1000; og ren H 2 O. Kør prøver og standarder i tre eksemplarer.
  5. Inkuber prøver i 20 min ved 50 ° C. Reaktionen standses ved tilsætning af 250 pi af nedbør løsning. Vortex hver prøve kraftigt i 10 sekunder for at sikre opløsninger blev fuldstændigt kombineres.
  6. Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 10 minutter og derefter vortex igen. Centrifugér prøver ved 1.000 xg i 10 min. Fjern 200 pi hver prøve supernatanten til en 96-brønds plade, pas på ikke at forstyrre bundfaldet.
  7. Assay under anvendelse af absorbans-spektroskopi ved en bølgelængde på 590 nm.

8.. PAHBAH Assay af TrCel5A

  1. Brug en hulning til at skære en cirkel (~ diameter 5,5 mm) filtrerpapir. Tilsæt 100 ul 60 mM NaAc, pH 4,8, og 100 pi af prøver, der enten indeholder blad-protein (med eller uden TrCel5A inducerbart udtrykte) eller en kommerciel T. reesei cellulaseblanding, fortyndet 1:1000, og inkuberes med filtrerpapir cirkler i 20 timer ved 50 ° C med 300 rpm rystning. For hver prøve inkuberes med filtrerpapir, også udruge en kopi løsning uden filter papir som individuelle prøve-kontrol.
  2. Forbered en 330 mM p-hydroxy benzoesyre hydrazide (PAHBAH) opløsning A ved at opløse PAHBAH i H 2 O med tilsætning af 5 ml koncentreret HCI for i alt 100 ml opløsning, og opbevares ved stuetemperatur. Bemærk: De bedste resultater opnås ved at tilsætte HCI til en mindre mængde PAHBAH gylle, dvs 30 ml, som omrøres under temperatur til at hjælpe opløsning før volumen til 100 ml med H 2 O.
  3. Forbered PAHBAH opløsning B, der indeholder 50 mM natriumcitrat, 10 mM calciumchlorid, og 500 mM NaOH og opbevares ved stuetemperatur.
  4. Immediately forud for analysen, forberede en 1.5x brugsopløsning på 1 ml PAHBAH reagens til 9 ml bufferopløsning, butik på is indtil brug (skal bruges inden for 4 timer).
  5. Forbered prøver i varmestabile 0,2 eller 0,5 ml rør. Kombiner 5 pi af hver opløsning inkuberet med filtrerpapir (trin 8.1) 45 ul H2O og 100 pi PAHBAH arbejdsopløsning. Sample kontrol (prøver inkuberet uden filter papir) skal køre under de samme koncentrationer (5 ul prøve, 45 pi H 2 O, 100 ul PAHBAH arbejder løsning). Teste også 5 standarder (5 ul) indeholdende mellem 0 og 0,2 g / L glucose og ren H 2 O. Kør prøver og standarder i tre eksemplarer.
  6. Inkuber prøver til nøjagtigt 10 minutter ved 100 ° C, derefter afkøles ved stuetemperatur i nøjagtig 10 minutter. Pipette løsninger i en plade med 96 brønde og kvantitativ spektroskopisk ved en bølgelængde på 410 nm. Fratræk individuelle prøve-kontroller (inkuberet uden filter papir) fra prøver for at opnå den endeligeværdier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TrCel5A og TrCel5A-mCherry blev udtrykt med succes i tobaksplanter ved hjælp af den forbigående ekspression-systemet (figur 1A og 1B). Undersøgelse af ekspressionsmønsteret af TrCel5A-mCherry fusionsproteinet viste sunde blade (figur 1C), der viste udbredt protein ekspression under grønt lys (figur 1D).

Ekstraktion af de samlede opløselige proteiner blev udført på tobaksplanter, der havde blade, der indeholdt udtrykt transient TrCel5A protein og SDS-PAGE viste en stor række af proteiner var til stede (figur 2A, bane 1). Den samlede opløselige protein prøve fra TrCel5A udtrykkende planter og totalt opløseligt protein prøve fra NTEPs, blev inkuberet i 10 minutter ved 55 ° C. TrCel5A forbliver stabile og aktive ved 55 ° C, mens mange andre (native tobak) proteiner er ikke stabile ved denne temperatur. Således har mange ikke-vigal proteiner blev præcipiteret ved denne behandling, hvilket giver en delvist oprenset prøve af TrCel5A. Efter denne termiske udfældning trin blev en stærk protein bånd observeret på ~ 40 kDa (figur 2A, bane 1). Det er sandsynligt, at det katalytiske domæne (CD) af TrCel5A, som tidligere er blevet vist til at køre på denne størrelse, når de udtrykkes i planter 4. Den negative og positive kontrolprøver (figur 2A, bane 3 og 4) viste lave koncentrationer af resterende termo-tolerant tobak proteiner fra NTEPs (negativ kontrol, figur 2A, bane 3) og flere bands indikerer en blanding af T. reesei proteiner (positiv kontrol, figur 2A, bane 4).

Størrelsen af TrCel5A blev bekræftet ved antistoffarvning rettet mod His-6tag indarbejdes i TrCel5A C-terminalen, som blev anset for at være fraværende i begge kontroller (Figur 2B). Den TrCel5A blev demonstreret tilbevarer endoglucanaseaktivitet af CMC zymografi (figur 2C, bane 1 og 2), hvor genfoldet protein skabt en stærk blokerede område, angiver CMC nedbrydning, i samme højde som i Coomassie-farvet SDS-PAGE-gel og Western blot. Ingen aktivitet blev observeret for de ikke-cellulase proteinblandinger fra NTEPs (figur 2C, bane 3), og blandingen af T. reesei proteiner drives som en positiv kontrol, viste endoglucanaseaktivitet fra flere komponenter (figur 2C, bane 4).

For at kvantificere den cellulolytiske aktivitet TrCel5A tre assays blev anvendt. For det første var nedbrydning af 4-MUC analyseres ved at observere forøget fluorescens emission ved 465 nm (exciteret ved 360 nm) af de frigivne 4-MU. TrCel5A blev vist at nedbryde 4MUC, som gjorde en 1:1000 fortynding af en kommercielt tilgængelig blanding af T. reesei cellulaser (figur 3A).

En kvantificerbar analyseaf aktiviteten af ​​TrCel5A mod CMC blev gjort ved at måle frigivelsen af ​​et azofarvestof ved 590 nm fra Azo-CMC. TrCel5A aktivitet under disse betingelser, var tilsvarende i aktivitet til et 1:1000 fortynding af cellulaseblanding nævnt ovenfor (figur 3B).

Evne TrCel5A at nedbryde filtrerpapir blev også analyseret. Til dette assay blev en indledende forsukring assay (dvs. med TrCel5A opløsning forringe filter-papir), og derefter blev supernatanten analyseret ved PAHBAH assay for at fastslå mængden af reducerende sukkerarter frigivet (figur 3B).

Figur 1
Figur 1.. Plant ekspressionskassetter for TrCel5A konstruktioner og heterolog ekspression af TrCel5A-mCherry i attobak blade visualiseret ved fluorescens under grønt lys. Skematiske repræsentationer af planten ekspressionskassette anvendes til TrCel5A (A) og TrCel5A-mCherry (B) er vist. Efter forbigående TrCel5A-MC udtryk blev tobaksblade undersøgt under normal (C) eller grønt lys (D). Til paneler (A) og (B) CaMV-promotoren (P35SS) og terminator signal (pA35S) er angivet i lyseblå. 5'-UTR af chalcon-synthase (CHS) og kodningssekvensen His6 (His6) er angivet i blåt. Anlægget codon-optimeret lederpeptid (LPH) afledt fra den tunge kæde af det murine mAb24 er afbildet i grøn. LPH opnår sekretion af det rekombinante protein til apoplasten, hvorefter en C-terminal KDEL-signal, der er angivet i rød, forsinker proteinet til ER. Pile mærke bindingsstedet for primeren for at amplificere CaMV 35SS ekspressionskassetten. For paneler (C) og (D) grønt lys havde en excitation 515 nm.Billeder blev taget uden forstørrelse.

Figur 2
. Figur 2 størrelse og aktivitet TrCel5A vist ved SDS-PAGE, Western blotting, og CMC zymografi Adskillelse af de totale opløselige proteiner:. Fra tobaksplanter hvor TrCel5A blev transient udtrykt før (1) og efter (2) termisk udfældning rensning; fra tobaksplanter hvor TrCel5A ikke var til stede, også efter termisk udfældning (3); eller en kommercielt tilgængelig blanding af T. reesei cellulaser (4). SDS-PAGE-separerede proteiner visualiseres med Coomassie blå farvning (A) Western blotting mod His-tag region TrCel5A (B) og cellulaseaktiviteten vist ved zymografi hjælp CMC visualiseret under anvendelse af congorødt (C). PageRuler Plus(Fermentas) blev anvendt som molekylvægtmarkør (M).

Figur 3
Fig. 3. Enzymaktivitet kvantificering af TrCel5A. TrCel5A blev inkuberet med 4-MUC (A), Azo-CMC (B) og filtrerpapir (C) og substratet nedbrydning måles ved frigivelse af fluoroforen 4-MU (A), et azofarvestof (B), eller ved at kvantificere reducerende sukker ved at overvåge farveændring PAHBAH (C). Hvert assay viser resultaterne for tre gentagelser. Fejllinjer angiver standardafvigelsen. I alle tre assays de analyserede prøver var puffer alene, TrCel5A efter termisk udfældning oprensning NTEP (WT Nt) efter termisk udfældning oprensning og en kommercielt tilgængelig blanding af T. reesei cellulaser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinant ekspression af cellulaser er et område af stor interesse på grund af ønsket om mere effektive biobrændstoffer produktionssystemer 1. Planter byder på mange muligheder for en vellykket cellulase produktion, med funktioner såsom økonomisk høst teknikker og autohydrolysis metoder bliver meget ønskelige egenskaber for storstilet produktion af biobrændstoffer. Yderligere brug af forskellige lokaliseringer til fremstilling af proteiner tillader, om nødvendigt, posttranslationelle modifikationer 20. Ændring anlæggene til at konstitutiv ekspression af cellulaser, samtidig med at indlysende fordele, er en tidskrævende metode, som måske eller måske ikke blive en succes. Teknikker, såsom binding af de udtrykte proteiner og inducerbare ekspressionsmekanismer øge sandsynligheden for en vellykket cellulase produktion i planter, men disse stadig tage mange måneder at etablere. Her bliver forbigående ekspressionsfremgangsmåder påvist at illustrere mulighederne for en bestemt cellulaseskal fremstilles ved plantesystemer i løbet af dage.

En fusion med fluorescerende protein mCherry blev her brugt til at demonstrere succes forbigående protein ekspression metoder. TrCel5A-mCherry var klart fordelt over størstedelen af blade, som var blevet infiltreret med vektor-holdige Agrobacteria. Lokalisering til det endoplasmatiske retikulum giver posttranslationelle modifikationer af det udtrykte protein. Evnen af et ekspressionssystem for at muliggøre f.eks glycosylering er særlig vigtigt for de cellulaser, der oprindeligt stammer fra fungale organismer, ligesom T. reesei 21.. Gærekspressionssystemer som er mere populært for heterolog cellulase udtryk, ofte resultere i hyper-glykosylering af de enzymer, som er drøftet at være en potentiel hindring for fuld cellulase aktivitet 22. Plant glycosylation mekanismer are uden den ulempe, hyper-glykosylering. Derudover ekspression i plantesystemer giver mulighed for lokalisering til områder, som tillader eller ikke tillader posttranslationelle modifikationer, således at tilpasning til kilde af proteinet. Systemet viste her, kan også anvendes, ved anvendelse af forskellige signalsekvenser 14, til lokalisering til apoplasten, chloroplastproteiner, cytosol eller Golgi vesikler. Anvendelsen af ​​fluorescerende proteinfusioner, såsom TrCel5A-mCherry, kan påvise succes proteinekspression samt lokalisering af proteinet. Imidlertid er sådanne konjugater ikke påkrævet for yderligere test aktivitet. Derfor anbefales det, at en ikke-mCherry TrCel5A konstruktion anvendes til alle yderligere prøver, som blev vist her, at indhente data mere nøjagtige aktivitet af det udtrykte cellulase. Vedrørende kontroller for yderligere eksperimenter, der prøver fra ikke-forbigående infiltrerede planter almindeligvis ses at være en passende kontrol.

5. Zymografi analyse af aktivitet mod CMC viste, at det resterende peptid var aktiv som en endoglucanase. Mens SDS-PAGE og Western blotting er meget almindelige analyser, CMC zymografi er en langt mere specifik test for cellulase (og især endoglucanaseaktivitet) aktivitet. Nogle vigtige faktorer at huske på for en vellykket zymografi resultater er a) at underlaget (i dette tilfælde CMC) skal være helt opløst og jævnt fordelt over hele gelen; b) at proteinet skal held genfoldet fortrinsvis i en kort periode for at begrænse mængden af ​​protein diffusion gennem gelen; og c) at deraktivitet assay skal være den optimale temperatur for enzymet, der analyseres (for TrCel5A mellem 50 og 60 ° C) og skal være kort for at muliggøre skarpere bånd af nedbrydning.

Kvantitativ analyse af cellulase aktivitet af udtrykt TrCel5A viste, at enzymet var aktiv mod en række substrater, herunder 4-MUC, CMC og filterpapir. Hver af substraterne blev undersøgt ved hjælp af en anden spektroskopisk test, enten via en fluorofor (4-MU) eller ved lysspredning analyse af en farvereaktion (Azo-farvestof eller PAHBAH). Alle tre substrater og assays er almindeligt brugt til vurderingen af ​​cellulase aktivitet, og er relativt ligetil assays. 4-MUC anvendes som en grundlæggende substrat for at bestemme glycosylhydrolase aktivitet, som en lang række af disse enzymer (endoglucanaser, exoglucanaser og β-glucosidaser) er aktive mod det. Hastigheden af ​​analysen begrænset række krav, høj følsomhedog evne til mange cellulaser at spalte underlaget, gør dette en nyttig analyse til generel screening for cellulaser, eller til sondering succes et udtryk løb. Et punkt at huske på, når du bruger 4-MUC er, at dette substrat er særlig velegnet til aktiviteten af ​​β-glucosidaser, hvilket gør aktiviteten af ​​endoglucanaser (såsom TrCel5A) eller exoglucanaser forekommer svag i forhold til β-glucosidaser eller enzymblandingerne som indeholde β-glucosidaser. Ved udførelse af et 4-MUC-assay med lave proteinkoncentrationer eller på anden måde lave aktivitetsniveauer anbefales det at udnytte tilsætning af glycin (pH 10) som et stop løsning, da pH-ændring forbedrer fluorescensen af ​​4-MU. CMC er et mere specifikt substrat for enzymet udtrykt her, da det kun nedbrydes af endoglucanaser. Azo-CMC assay er mere kompliceret end den for 4-MUC, på grund af behovet for udfældning af cellulose (og methanol) af zink. Den største fordel ved dette substrat, og dermed assayEr, at den er specifik for endoglucanaseaktivitet, hvilket gør det meget nyttigt for at fastslå arten af ​​cellulase, der produceres. Filtrerpapir nedbrydning er en anden almindelig test for oprettelse cellulaseaktivitet. Mængden af ​​iagttagne nedbrydning varierer betydeligt afhængig af egenskaberne af cellulasen vurderes, og det er et foretrukket substrat til at undersøge aktiviteten af ​​enzymblandinger. Den PAHBAH assay, her bruges til at undersøge filtrerpapir nedbrydning, anerkender mængde af sukker udgivet efter forsukring og så er også anvendelig til en bred vifte af modelsubstrater ikke påvist her, herunder CMC, lichenan, β-glucan, α-cellulose, AVICEL , xylan og xyloglucan. Til denne analyse, bør man sørge for at inkludere standarder på samme plade (eller i det samme løb), da prøverne blive vurderet som variation i inkubationstider kan føre til forskelle i resultaterne. Det er derfor også vigtigt at gentages analysen for at sikre nøjagtighed. DerudoverEn stikprøve-kontrol skal altid køres, hvor prøven inkuberes uden cellulose substrat, at kontrollere for eventuelle reducerende sukkerarter naturligt til stede i prøver, som kunne afdækkes ved PAHBAH, og ellers ville give falske positive resultater.

Konklusionen er, at fremgangsmåder til transient ekspression og karakterisering af en rekombinant cellulase klart demonstreret. Disse teknikker giver en enkel måde at generere tilstrækkelige mængder af protein for yderligere undersøgelse af en eller flere cellulaser, ved hjælp af aktivitet tests som dem demonstreret her. Især disse metoder giver en hurtig måde til at undersøge potentialet i udpegede cellulaser i planta produktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 - Forschung für die Nützung von Biomasse", og Cluster of Excellence "Skræddersyede brændstoffer", der finansieres gennem Excellence-initiativet af de tyske føderale og statslige regeringer til at fremme videnskab og forskning på tyske universiteter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside SIGMA-ALDRICH M6018
Acetic acid ROTH 3738
Acetosyringon (concentrated) ROTH 6003
Antibiotic - kanamycin ROTH T832
Antibiotic - rifampicin ROTH 4163
Antibiotic - carbenicillin ROTH 6344
Antibody - rabbit anti His(6) pAb ROCKLAND 600-401-382
Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb DIANOVA 111-055-008
Azo-carboxymethyl cellulose MEGAZYME S-ACMC
β-cyclodextrin SIGMA-ALDRICH C4805
Calcium chloride dihydrate SIGMA-ALDRICH C5080
Carboxymethyl cellulose ROTH 3333.1
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 SIGMA-ALDRICH C2730
Congo red SIGMA-ALDRICH 75768
Coomasie brilliant blue G 250 ROTH 9598.2
D(+)-glucose ROTH 8337
Ethanol ROTH K928
Filter paper - Rotilabo blotting paper ROTH CL67
NBT/BCIP SIGMA-ALDRICH 72091
MES buffer ROTH 4256
Methanol ROTH 8388
Sodium citrate ROTH 3580
Sodium dodecylsulfate SERVA 20765
Sodium hydroxide ROTH 6771
Soil, Einheitserde classic  PATZER GMBH
Spectrometer - Infinite M200 TECAN
Sucrose SIGMA-ALDRICH S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide  SIGMA-ALDRICH H9882
Phosphate buffered saline ROTH 1058
UV light source - BLAK RAY UVP
Vibratome - VT1000S Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
  2. Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
  3. Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
  4. Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
  5. Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
  6. Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
  7. Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
  8. Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
  9. Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
  10. Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
  11. Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
  12. Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
  13. Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
  14. Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  16. Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
  17. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  18. Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
  19. Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
  20. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
  21. Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).

Tags

Miljøvidenskab heterolog udtryk endoplasmatiske reticulum endoglucanase cellulose glycosylphosphatidylinositolspecifikt hydrolase fluorescens cellulase, tobaksplanter
Ekspression af rekombinant Cellulase Cel5A fra<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; I tobaksplanter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garvey, M., Klinger, J., Klose, H.,… More

Garvey, M., Klinger, J., Klose, H., Fischer, R., Commandeur, U. Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants. J. Vis. Exp. (88), e51711, doi:10.3791/51711 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter