Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Expression of rekombinant Cellulase Cel5A fra Published: June 13, 2014 doi: 10.3791/51711
Automatic Translation
1, *1, *1, 2, 1
1Institute for Molecular Biotechnology, Bio7, RWTH Aachen University, 2Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology
* These authors contributed equally

Summary

Tobakksplanter ble brukt til å produsere en fungal cellulase, TrCel5A, via et transient ekspresjonssystem. Uttrykket kan bli overvåket ved hjelp av en fluoriserende fusjonsprotein, og proteinaktiviteten ble karakterisert etter ekspresjon.

Abstract

Cellulose nedbrytende enzymer, cellulaser, er mål for både forskning og industrielle interesser. Det meste av disse enzymene i vanskelige til-kultur organismer, slik som hyfer byggende fungi og anaerobe bakterier, har påskyndet ved bruk av rekombinant teknologi på dette området. Plant expression metoder er en ønskelig system for storskala produksjon av enzymer og andre industrielt nyttige proteiner. Heri er metoder for transient ekspresjon av en sopp-endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, i Nicotiana tabacum demonstrert. Vellykket protein uttrykk vises, overvåket av fluorescens ved hjelp av en mCherry-enzym fusjonsprotein. I tillegg er et sett grunntester brukt til å undersøke aktiviteten til forbigående uttrykt T. reesei Cel5A, inklusive SDS-PAGE, Western blotting, zymography, så vel som fluorescens-og fargestoffbaserte substrat degradering analyser. Systemet som er beskrevet her kan brukes til å frembringe en aktiv celleulase i en kort tidsperiode, slik som å vurdere potensialet for videre produksjon i planter gjennom konstitutive eller induserbare ekspresjonssystemer.

Introduction

Nedbrytning av lignocellulose biomasse og dens konvertering til flytende drivstoff har blitt tenkt som en metode for å redusere avhengigheten av fossilt brensel. En vesentlig hinder i å etablere økonomisk gjennomfør biomasse behandlingssystemer er i enzymatisk nedbrytning av cellulose og hemicellulose en. Plant ekspresjonssystemer viser et stort potensial for produksjon av enzymer i en industriell skala. Landbruk systemer til slakteanlegg økonomisk og i volum er allerede etablert, som de har vært i tusenvis av år. Produksjonen av cellulaser i planter er ønskelig på grunn av faktorer som den enkle autohydrolysis 2, og potensialet for å maksimere bruken av lavere enzymnivåer ved å øke fordøyeligheten av plante-cellevegger en. Til slutt, plante-systemer tillater målretting av rekombinante proteiner i bestemte områder av planteceller og er i stand til å posttranslationally endre enzymer der kreves tre.

ve_content ">

Nicotiana tabacum (tobakk) er svært ofte brukt som modellorganisme for heterologe protein expression studier i planter, på grunn av sin raske vekst og biomasse akkumulering funksjoner fire. Transient ekspresjon av rekombinante proteiner er en teknikk som gjør det proteinproduksjon i korte tidsperioder 5, og samtidig opprettholde fleksibilitet med hensyn til lokalisering og dermed posttranslational modifikasjoner av de utvalgte proteiner, dvs. cellulaser. Dette muliggjør produksjon av en cellulase (r) for grunnleggende analyse, og samtidig legge forholdene til rette for ytterligere uttrykk strategier i planter. Ved hjelp av en slik forbigående uttrykk strategi, er en endoglucanase fra glycosyl hydrolase familien 5, Cel5A, avledet fra soppens verten Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 produsert (heretter kalt TrCel5A). TrCel5A er et 42 kDa protein som er nativt glykosylert og er svært aktive i hydroylzing cellulosekjedene 7.

Den forbigående ekspresjon teknikk som er beskrevet her er basert på en forholdsvis vanlig brukt system, infiltrere anlegget blader med Agrobacteria bærer genet av interesse i en passende ekspresjonsvektor. For å muliggjøre rask analyse av vellykket i planta uttrykk, kan TrCel5A også uttrykkes som et fusjonsprotein med mCherry, en monomerisk fluorescerende protein opprinnelig stammer fra Discosoma sp. Protein DsRed 8, med ytterligere seks histidin rester (Hans-tag) smeltet til C-terminalen (TrCel5A-mCherry). Ekspresjon av det heterologe fusjonsproteinet, TrCel5A-mCherry, kan således bli overvåket i løpet av den voksende planten ved hjelp av grønt lys for å undersøke mCherry spredning. Hvis ønskelig, kan tynne snitt av plantematerialet bli undersøkt under grønt lys mikroskopisk for å etablere den spesifikke lokaliseringen av proteinet. For dette arbeidet, signal og transitte peptider ble innlemmet i konstruksjonen, for å lokalisere den heterologe protein eksport til det endoplasmatiske retikulum ni.

For å analysere aktiviteten av plante uttrykt cellulaser, inkludert TrCel5A, en rekke cellulase aktivitetstester kan kjøres. Etter ekstraksjon av den totale oppløselige planteproteiner, kan TrCel5A bli delvis renset ved anvendelse av en termisk inkubasjon teknikk. Protein størrelse er etablert ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av Western blotting. Zymography kan brukes til å analysere aktivitet mot substrater, f.eks cellulose som har vært karboksy-metylert (gjør karboksymetylcellulose: CMC) for oppløseligheten 10. Cellulase, og glukosidase-aktivitet kan overvåkes ved hjelp av fluoroforen 4-methylumbelliferyl (4-MU) forbundet med β-D-cellobioside (kombinert: 4-AMS). En annen metode for å vurdere endoglucanase aktivitet involverer spektrometrisk analyse av CMC som er blitt forbundet med en azo-dye (Remazolbrilliant Blå R) 11. I tillegg kan protein-aktivitet av både endoglucanases og en rekke cellulaser overvåkes ved bruk av en sukkeranalyse test, som for eksempel p-hydroksy benzosyre-hydrazid (PAHBAH) assay 12.. Disse teknikker kan brukes til å belyse og kvantifisering av aktiviteten til uttrykt cellulase av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Vekst av vill type N. tabacum Planter

  1. Å vokse N. tabacum L. cv. Petit Havana SR1 planter på jord, plassere tobakk frø på egnede potter fylt med vanlig pottejord for spiring. Etter to uker, overføre frøplanter til individuelle potter. Inkuber planter i et drivhus med konstant 22 ° C (mørketiden) eller 25 ° C (lys periode) og 70% relativ luftfuktighet. Gi belysning i en 16/8 timers lys / mørke-syklusen (f.eks Philips IP65 400 W lamper, 180 mikromol · sek -1 · m -2; λ = 400-700 nm) og vann daglig.

2. Gående uttrykk av TrCel5A og TrCel5A-mCherry Proteiner

  1. Under sterile forhold, plukke enkeltkolonier av Agarobacterium tumefaciens (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RifR) som inneholder enten pTRAkc-ER-TrCel5A eller pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry og overføring til en Erlenmeyerkolbe som inneholder 10 ml gjærekstraktbuljong (YEB, fremstilt i henhold til produsentens spesifikasjoner) medium og kanamycin (50 mg / ml), rifampicin (50 mg / ml), og Carbenicillin (100 mg / ml) for valg. Inkuber i 36-40 timer ved 26 ° C og 180 rpm. Merk: Utformingen av hensiktsmessige konstruksjoner for protein uttrykk er utenfor omfanget av denne artikkelen, men for veiledning, kan metodene for Maclean et al 13 og Munro og Pellham 14 følges for konstruere design..
  2. Ta 200 ul av hver kultur for å inokulere 20 ml av YEB med de antibiotiske konsentrasjoner som er nevnt ovenfor og inkuberes under de samme betingelser som før.
  3. Etter 36-40 timer, preinduce kulturene ved tilsetning av 2 pl acetosyringon (200 uM sluttkonsentrasjon) 100 pl 40% (w / v) glukose-løsning og 200 pl av 1 M MES-buffer pH 5,6. Inkuber over natten.
  4. Forbered 100 ml av en 2 x infiltrasjon buffer (100 g / l sakkarose, 3,6 g / l glukose, 8,6 g / L Murashige and Skoog basale salterJuster pH-verdien til 5,6 ved hjelp av kaliumhydroksyd).
  5. Mål OD 600 av kulturer med 1:05 fortynninger til den når en OD 600 på 5-6. Beregn kultur volumet som trengs for 30 ml infiltrasjon medium på OD 600. Tilsett 15 ml av 2x infiltrasjon buffer, tilsett deionisert H2O for å gjøre buffer opp til 30 ml.
  6. Ta planter fra drivhuset og bruk en pipette tips til nick abaxial side av 3. til 5. blad fra toppen for å lette infiltrasjon.
  7. Bruk en pipette tips til nick abaxial siden av bladene for å lette infiltrasjon.
  8. Fyll en sprøyte med infiltrasjon medium og sette den (uten nål) på en av de tidligere gjort kutt. Støtte sprøyte med en finger på adaxial blad side. Trykk mediet forsiktig inn i vevet av interveinal bladsonene. Merk: Etter infiltrasjon, dyrke planter i et drivhus under samme forhold som beskrevet ovenfor. Også, opprettholde en lik andel av untrflere ganger for ikke-gående uttrykk planter (NTEPs) som kontroller, under de samme vilkår som infiltrerte planter.

Tre. Vurdering av TrCel5A-mCherry Expression i anlegget blader

  1. Etter 4-6 dager, ta planter infiltrert med A. tumefaciens inneholder pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry fra drivhuset og plassere dem i et mørkt rom for fluorescens analyse.
  2. For å visualisere fluorescens i blad seksjoner uttrykker TrCel5A-mCherry, lette planter ved hjelp av en bærbar lyskilde avgir grønt lys på 515 nm med et rødt filter (620-750 nm). Merk: I dybden karakterisering av protein ekspresjon i plante bladene kan oppnås ved tynn-seksjonering bladene med en vibratome og undersøkelse under lys-og fluorescensmikroskopi. For dette følg trinnene nedenfor:
    1. Skjær små deler av omtrent 5 x 5 mm størrelse fra et infiltrert blad og legge dem i 4% agarose oppløst i 50 mM fosfatbuffer (pH 5.7).
    2. Kuttdelen av 80-90 mikrometer størrelse fra embedded blader ved hjelp av en vibratome. Legg dem på et objektglass, dekk med buffer eller et dekkglass og undersøke dem ved hjelp av et mikroskop på 10X forstørrelse med en fluorescens detektor, med samme bølgelengde og filter nevnt ovenfor.

4. TrCel5A Utvinning fra tobakk blader

  1. Skjær stykker fra tobakksblader til en vekt på ca 1 g fra planter smittet med A. tumefaciens inneholder pTRAkc-ER-TrCel5A og plasser i en morter precooled med flytende nitrogen. Tilsett en passende mengde av flytende nitrogen til prøvene. Grind later til pulver med en precooled stampe.
  2. Tilsett 2 ml fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 1 mM fenylmethyl-sulfonylfluorid til bakken blad materiale og bland helt til det meste av bladet saken er i suspensjon. Sentrifuger ved 15.000 xg ekstrakt i 20 min ved 4 ° C og ta protein-inneholdende supernatant.
  3. Centrifuge ekstraktet ved 15.000 xg i 20 min ved 4 ° C og ta protein-inneholdende supernatant være forsiktig for ikke å forstyrre pelleten. Kast pellet.
  4. Delvis rense TrCel5A ved inkubering av protein-holdige supernatant ved 55 ° C i 10 min. Tillat å hvile ved romtemperatur i ytterligere 10 min, deretter sentrifugert ved 15000 xg i 10 min ved RT. Gjenta delvis renseprosess for ikke filtreres planter for å skaffe kontrollprøver. Bruk disse prøvene for alle etterfølgende forsøk. Merk: Protein løsninger kan lagres ved 4 ° C i opptil en uke eller ved -20 ° C i opp til 3 måneder.
  5. Gjenta den partielle renseprosess for ikke filtreres planter for å skaffe kontrollprøver. Bruk disse prøvene for alle etterfølgende forsøk. Merk: Protein løsninger kan lagres ved 4 ° C i opptil en uke eller ved -20 ° C i opp til 3 måneder.

5. SDS-PAGE, Western Blotting, og Azo-CMC Zymography av TrCel5A-mCherry </ P>

  1. Kjøpe eller forberede 12% (w / v) SDS-PAGE geler som per etablerte metoder 15.
  2. Oppløs CMC i vann for å oppnå en 1,5% (w / v) oppløsning. For at CMC-SDS-PAGE-geler, erstatte 1 ml 1,5% CMC i 1 ml vann i et 10 ml SDS-PAGE-gel mix-løsning, noe som resulterer i en 0,1% (w / v) CMC + 12% (w / v ) SDS-PAGE-gel blanding. Hell gel normalt. Merk: Påse at CMC i den opprinnelige oppløsning er fullstendig oppløst ved en kombinasjon av omrøring og oppvarming til 40 ° C (gjentar direkte for å fremstille gel-løsning).
  3. Denaturere prøvene ved koking i nærvær av SDS, i henhold til etablerte metoder 12. Som en positiv kontroll, bruker en 1:500 fortynning av et kommersielt tilgjengelig cellulase blandingen fra T. reesei, slik som T. reesei ATCC 26.921. Som en negativ kontroll bruke en tilsvarende fremstilt proteinoppløsning fra ikke filtreres blader (NTEPs).
  4. Gjennomfør elektroforese som per normale protokoller 15,for eksempel bruke 200 V for ~ 50 min med elektroforese stanses når fargestoffet fram nådd bunnen av gelen.
  5. Flekk en SDS-PAGE-gel ved å bruke 0,1% (w / v) Coomassie brilliant blue og destain ved hjelp av en metanol / iseddik-blandingen. Merk: Rapid farging og avfarging kan utføres ved forsiktig oppvarming av farging og avfarging løsninger, det vil si ved hjelp av en mikrobølgeovn for ~ 15 sek for å varme (men ikke koke) først fargingen og deretter Farve løsninger, endring av avfarging løsning etter 10 min , eller når det avkjøles, og gjenta med ny avfarging løsning.
  6. Utfør Western blotting av en SDS-PAGE-gel ved bruk av etablerte protokoller 16,17. Bruk av følgende antistoffer: et polyklonalt kanin antistoff mot et His-tag (primær) og et polyklonalt geit-anti-kanin-antistoff Fc-region som har blitt konjugert til alkalisk fosfatase (sekundære). Merk: sekundære antistoffer bør velges for å aktivere visualisering ved hjelp av nitro tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 '-indolyphosphate p-toluidin-salt (NBT / BCIP), som beskrevet 18.
  7. Utfør in-gel protein refolding på 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-gel ved inkubering av gelen i 1,5% (w / v) β-syklodekstrin, 20 mM fosfat-citrat-buffer, pH 6,5, ved romtemperatur med skånsom risting i 15 min 19.
  8. Kast β-cyklodekstrin-løsning, og en kort vask gelen med H2O Inkuber ved RT i 50 mM natriumacetatbuffer (pH 4,8) i ytterligere 15 min. Utfør CMC zymography hjelp av refolded 0,15% CMC SDS-PAGE-gel ved inkubering av gel i 30 mM natriumacetat-buffer pH 4,8 i 20 min ved 50 ° C.
  9. Utfør CMC zymography hjelp av refolded 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-gel ved inkubering av gel i 30 mM natriumacetatbuffer (pH 4,8) i 20 min ved 50 ° C.
  10. Flekk gelen i 10 minutter ved bruk av en 0,1% w / v Congo rød løsning og destain i 30 minutter eller inntil klare bånd observeres ved anvendelse av 1 M NaCl. Vaskes gelen med 0,3% (v / v) eddiksyre for klarere avbildning.

6. 4-MUC aktivitet analysen av TrCel5A

  1. Forbered en stamløsning på 10 mm 4-MUC i 50% (v / v) metanol, og lagre den i mørket på RT
  2. Umiddelbart før analysen, forberede en 4-MUC 2x arbeidsoppløsning, som består av 1 mM 4-MUC og 60 mM natrium-acetat, pH 4,8.
  3. Utføre denne test på prøver inneholdende 100 ul av bladprotein (med eller uten TrCel5A å indusere uttrykt), 100 pl av en kommersielt tilgjengelig cellulase blandingen fra T. reesei 1:1.000, og ren H 2 O, henholdsvis. Kjør hver prøve i tre eksemplarer.
  4. Pipetter 100 pl av den 4-MUC arbeidsløsning i separate brønner i en 96-brønners plate, og tilsett 100 ul av hver prøve.
  5. Bestem 0 min endepunktet av 4-MU fluorescens gjennom fluorescerende spektroskopi ved bruk av en eksitasjonsbølgelengde på 360 nm og en emisjonsbølgelengde på 465 nm.
  6. Inkuber platene for 20min ved 50 ° C, dekket med klebelokk for å hindre fordampning. Stopp reaksjonen ved frysing (eller ved å kombinere 100 ul 0,15 M glycin, pH 10,0, og 100 ul av prøven i en separat plate).
  7. Bestem endepunktet av 4-MU fluorescens gjennom fluorescerende spektroskopi ved bruk av en eksitasjonsbølgelengde på 360 nm og en emisjonsbølgelengde på 465 nm. Trekk fra 0 min fra endepunktet (20 min) endepunktet for å oppnå endringen i fluorescens-verdier.

7. Azo-karboksylmetylcellulose aktivitet analysen av TrCel5A

  1. Forbered et lager av 1,5% (w / v) Azo-CMC, som er lagret ved romtemperatur, og en løsning inneholdende ventet 18 mM sink-acetat, 0,5 M natriumacetat, pH 5, og 80% etanol (v / v), lagring ved værelse temperatur.
  2. Umiddelbart før analysen, fremstille en Azo-CMC 2x arbeidsoppløsning, som består av 1% (w / v) Azo-CMC (som H2O) og 60 mM natrium-acetat, pH 4,8.
  3. Kombiner 50 pl av prøven og 50 pl av den arbeidsing-løsning i 1,5 ml rør.
  4. Testprøvene inneholdende 50 pl av bladprotein (med eller uten TrCel5A forbigående uttrykt); 100 ul av en kommersielt tilgjengelig cellulase blandingen fra T. reesei utvannet 1:1.000; og ren H 2 O. Kjør prøver og standarder i tre eksemplarer.
  5. Inkuber prøvene i 20 min ved 50 ° C. Stopp reaksjonen ved å tilsette 250 ul av presipiteringsoppløsningen. Vortex hver prøve kraftig i 10 sekunder for å sikre løsninger ble helt sammen.
  6. Inkuber prøvene ved RT i 10 min og deretter igjen vortex. Sentrifuger prøvene ved 1000 xg i 10 min. Fjern 200 mL av hver prøve supernatanten til et 96-brønners plate, tar seg ikke å forstyrre pelleten.
  7. Assay ved hjelp av absorbans-spektroskopi ved en bølgelengde på 590 nm.

8. PAHBAH analysen av TrCel5A

  1. Bruk en hulling å kutte en sirkel (~ 5,5 mm diameter) av filterpapir. Tilsett 100 mL 60 mm NaAc, pH 4,8, og en00 ul av prøver, enten som inneholder bladprotein (med eller uten TrCel5A å indusere uttrykt), eller en kommersiell T. reesei cellulase-blanding, fortynnet 1:1.000, og inkuberes med filterpapir sirkler i 20 timer ved 50 ° C med 300 rpm risting. For hver prøve ble inkubert med filterpapir, også inkubere et duplikat løsning uten filterpapir som individuelle prøve-kontroller.
  2. Tilbered en 330 mM p-hydroksy-benzosyre-hydrazid (PAHBAH) oppløsning A ved oppløsning av PAHBAH i H 2 O ved tilsetning av 5 ml konsentrert HCl i en samlet mengde av 100 ml oppløsning, og oppbevar ved RT. Merk: Best resultater oppnås ved tilsetning av HCl til et mindre volum av PAHBAH slurry, dvs. 30 ml, som blir omrørt under temperaturen for å hjelpe oppløsningen før volumet til 100 ml med H2O
  3. Forbered PAHBAH løsning B, som inneholder 50 mM natriumsitrat, 10 mM kalsiumklorid, og 500 mM NaOH og oppbevar ved RT.
  4. Immediately forut for analysen, forberede en 1,5 x arbeids løsning av 1 ml PAHBAH-reagens til 9 ml bufferoppløsning, oppbevares på is inntil bruk (som skal brukes i løpet av 4 timer).
  5. Forbered prøvene i termostabile 0,2 eller 0,5 ml rør. Kombiner 5 ul av hver oppløsning inkubert med filterpapir (trinn 8.1) 45 pl av H2O og 100 pl av PAHBAH arbeidsløsning. Eksempel kontroller (prøver ruges uten filter papir) skal kjøres under samme konsentrasjoner (5 mL prøve, 45 mL H 2 O, 100 mL PAHBAH arbeidsløsning). Teste også 5 standarder (5 mL) inneholdende mellom 0 og 0,2 g / l glukose, og ren H 2 O. Kjør prøver og standarder i tre eksemplarer.
  6. Inkuber prøvene for nøyaktig 10 min ved 100 ° C, deretter avkjøles i RT for nøyaktig 10 min. Pipette-løsninger inn i en 96 brønn plate og spektroskopisk analyse ved en bølgelengde på 410 nm. Trekk fra enkelteksempler-kontroller (ruges uten filterpapir) fra prøver å oppnå endeligverdier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TrCel5A og TrCel5A-mCherry ble uttrykt hell i tobakksplanter bruker gående uttrykk systemet (figur 1A og 1B). Undersøkelse av uttrykket mønster av TrCel5A-mCherry fusjonsproteinet viste friske blader (figur 1C), som viste omfattende protein ekspresjon i henhold grønt lys (fig. 1D).

Utvinning av de totale løselige proteiner ble utført på tobakksplanter som hadde blader som inneholdt det forbigående uttrykte TrCel5A protein og SDS-PAGE viste et stort utvalg av proteiner var til stede (figur 2A, kolonne 1). Den totale oppløselige protein prøve fra TrCel5A uttrykke planter og et totalt oppløselig protein prøven avledet fra NTEPs, ble inkubert i 10 min ved 55 ° C. TrCel5A er stabilt og aktivt ved 55 ° C, mens mange andre (native tobakk) proteiner er ikke stabil ved denne temperatur. Således mange ikke-essential proteiner ble utfelt ved denne behandling, slik at en delvis renset prøve av TrCel5A. Etter denne termiske-utfellingstrinnet, ble et sterkt proteinbånd ble observert ved ~ 40 kDa (figur 2A, kolonne 1). Dette vil sannsynligvis være det katalytiske domene (CD) av TrCel5A, som har blitt vist tidligere å løpe på denne størrelse når uttrykt i planter 4. De negative og positive kontrollprøver (figur 2A, felt 3 og 4, henholdsvis) viste lave konsentrasjoner av gjenværende termotolerante tobakks proteiner fra NTEPs (negativ kontroll, figur 2A, felt 3) og flere bånd som indikerer en blanding av T. reesei proteiner (positiv kontroll, figur 2A, felt 4).

Størrelsen av TrCel5A ble bekreftet av antistoffarging rettet mot His-6tag innlemmet i TrCel5A C-terminus, som ble sett til å være fraværende for både kontrollene (figur 2B). Den TrCel5A ble demonstrert tilbeholder endoglucanase aktivitet av CMC zymography (figur 2C, felt 1 og 2), der refolded protein skapt en sterk erte område, som indikerer CMC nedbrytning, i samme høyde som i Coomassie farget SDS-PAGE gel og Western blot. Ingen aktivitet ble observert for de ikke-cellulaseløse proteinblandinger fra NTEPs (figur 2C, felt 3), og blandingen av T. reesei proteiner drives som en positiv kontroll, viste endoglucanase aktivitet fra flere komponenter (figur 2C, felt 4).

For å kvantifisere den cellulolytiske aktivitet av TrCel5A tre analysene ble anvendt. For det første, ble nedbrytningen av 4-MUC analysert ved å observere den økte fluorescensemisjon ved 465 nm (eksitert ved 360 nm) av frigitt 4-MU. TrCel5A ble vist degradering 4MUC, som gjorde en 1:1.000 fortynning av en kommersielt tilgjengelig blanding av T. reesei cellulaser (figur 3A).

En kvantifiserbare analyseav aktiviteten til TrCel5A mot CMC ble gjort ved å måle frigjøring av et Azo-fargestoffet ved 590 nm fra Azo-CMC. TrCel5A aktivitet under disse betingelser, var ekvivalent i aktivitet for en 1:1.000 fortynning av cellulase blandingen omtalt ovenfor (figur 3B).

Muligheten av TrCel5A til å nedbryte filterpapir ble også analysert. For denne analyse ble en innledende forsukring assay utføres (dvs. med TrCel5A løsning nedbrytende filterpapir), og deretter ble supernatanten analysert av PAHBAH-analyse for å fastslå mengden av reduserende sukker utgitt (figur 3B).

Figur 1
Figur 1. Plant uttrykk kassetter for TrCel5A konstruerer og heterologe uttrykk for TrCel5A-mCherry i åbacco later visualisert ved fluorescens i henhold til grønt lys. Skjematisk representasjon av planten ekspresjonskassett som brukes for TrCel5A (A) og TrCel5A-mCherry (B) er vist. Etter forbigående TrCel5A-MC uttrykk, ble tobakksblader undersøkt under normal (C) eller grønt lys (D). For paneler (A) og (B) i CaMV-promoteren (P35SS) og terminator signal (pA35S), er angitt i lyseblå. 5'-UTR av chalcone synthase (CHS), og His6 kodende sekvens (His6) er markert med blått. Anlegget kodonoptimalisert lederpeptidet (LPH) avledet fra den tunge kjede av murint mAb24 er avbildet i grønt. LPH oppnår sekresjon av det rekombinante protein til apoplast, hvoretter en C-terminal KDEL signal, vist i rødt, forsinker protein til ER. Piler merke bindingsstedet for primer å forsterke CaMV 35SS uttrykk kassett. For paneler (C) og (D) det grønne lyset hadde en eksitasjon 515 nm.Bilder ble tatt uten forstørrelse.

Fig. 2
. Figur 2 størrelse og aktivitet av TrCel5A vist ved SDS-PAGE, Western blotting, og CMC zymography Separering av de totale løselige proteinene:. Fra tobakksplanter der TrCel5A ble forbigående uttrykt før (1) og etter (2) termisk ventet rensing; fra tobakksplanter der TrCel5A ikke var til stede, også etter termisk nedbør (3); eller av en kommersielt tilgjengelig blanding av T. reesei cellulaser (4). SDS-PAGE-separerte proteiner visualiseres med Coomassie blå farging (A), Western blotting mot His-tag-regionen i TrCel5A (B), og cellulase-aktivitet er vist ved hjelp av zymography CMC visualisert ved hjelp Kongo Rød (C). PageRuler Plus(Fermentas) ble anvendt som molekylvektmarkør (M).

Figur 3
Fig. 3. Enzymaktiviteten kvantifisering av TrCel5A. TrCel5A ble inkubert med 4-MUC (A), Azo-CMC (B), og filterpapir (C) og substratet degradering målt ved frigjøring av fluoroforen 4-MU (A), en Azo-fargestoffer (B), eller ved å kvantifisere reduserende sukkerarter ved å overvåke fargeendring av PAHBAH (C). Hver analyse viser resultatene for tre gjentak. Feilfelt angir standardavvik. I alle tre analysene de analyserte prøvene var buffer alene, TrCel5A etter termisk ventet rensing, NTEP (WT Nt) etter termisk ventet rensing, og en kommersielt tilgjengelig blanding av T. reesei cellulaser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinant ekspresjon av cellulaser er et felt av stor interesse, på grunn av ønsket om mer effektive biobrensel produksjonssystemer en. Planter gir mange muligheter for vellykket cellulase produksjon, med funksjoner som økonomisk høsting teknikker og autohydrolysis metoder blir svært ønskelige egenskaper for storskala produksjon av biodrivstoff. Videre, bruk av forskjellige lokaliseringer for å produsere proteiner som tillater, hvis nødvendig, posttranslational modifikasjoner 20. Endre planter å aktivere konstituerende uttrykk for cellulaser, samtidig som den tilbyr åpenbare fordeler, er en tidkrevende metode som kan eller ikke kan være vellykket. Teknikker som beslaglegging av de uttrykte proteiner og induserbare uttrykk mekanismer øker sannsynligheten for vellykket cellulase produksjon i planter, men disse fortsatt ta mange måneder å etablere. Her blir transiente ekspresjonssystemer metoder vist, for å illustrere potensialet for en bestemt cellulaseå bli produsert gjennom plantesystemer i løpet av noen dager.

En fusjon med fluorescerende protein mCherry ble brukt her for å demonstrere suksess for de forbigående protein expression metoder. TrCel5A-mCherry var tydelig fordelt over størstedelen av bladene som var blitt infiltrert med vektoren inneholdende Agrobacteria. Lokalisering til det endoplasmatiske retikulum gjør posttranslational modifikasjoner av uttrykte protein. Muligheten av et ekspresjonssystem for å muliggjøre f. eks glykosylering er spesielt viktig for de cellulaser som opprinnelig er avledet fra sopporganismer, slik som T. reesei 21. Gjær ekspresjonssystemer, som er stadig mer populært for heterolog cellulase uttrykk, ofte resultere i hyper-glykosylering av enzymer, som er debattert å være en potensiell hindring for fullt cellulase aktivitet 22. Plant glycosylation mekanismer enre uten ulempen med hyper-glykosylering. I tillegg, ekspresjon i plantesystemer gir mulighet for lokalisering til områder som tillater eller ikke tillater posttranslational modifikasjoner, og muliggjør å tilpasse til kilden til proteinet. Systemet vist her, kan også anvendes, ved anvendelse av forskjellige signalsekvenser 14, for å lokalisere til apoplast, chloroplast, cytosol eller Golgi-vesikler. Bruken av fluorescerende protein fusjoner, som TrCel5A-mCherry, kan vise suksess for proteinekspresjon så vel som lokaliseringen av proteinet. Imidlertid er slike konjugater er ikke påkrevet for ytterligere aktivitetstester. Således er det anbefalt at en ikke-mCherry TrCel5A konstruksjon brukes for alle ytterligere tester, var som vist her, for å oppnå mer nøyaktige aktivitetsdata fra det uttrykte cellulase. Angående kontroller for videre forsøk, er prøver fra ikke-forbigående infiltrert planter ofte sett på å være betryggende kontroll.

fem. Zymography analyse av aktivitet mot CMC indikerte at den gjenværende peptid var aktiv som et endoglucanase. Mens SDS-PAGE og Western blotting er meget vanlige analyser, er CMC zymography en mye mer spesifikk test for cellulase (og spesielt endoglucanase) aktivitet. Noen viktige faktorer å huske på for vellykkede zymography resultatene er a) at underlaget (i dette tilfellet CMC) må være helt oppløseliggjort og spredt jevnt over hele gel; b) at proteinet må være vellykket refolded, fortrinnsvis i en kort periode for å begrense mengden av protein diffusjon gjennom gelen; og c) ataktiviteten analysen skal være på den optimale temperatur for enzymet som analyseres (for TrCel5A mellom 50 og 60 ° C), og bør være kort for å muliggjøre skarpere bånd av nedbrytning.

Kvantitativ analyse av cellulase-aktivitet av uttrykt TrCel5A viste at enzymet var aktiv mot en rekke substrater, inkludert 4-MUC, CMC og filterpapir. Hver av de substrater ble undersøkt ved hjelp av en annen spektroskopisk test, enten via en fluorofor (4-MU) eller ved lysspredning analyse av en fargereaksjon (Azo-fargestoffet eller PAHBAH). Alle tre underlag og analyser er mye brukt for vurdering av cellulase aktivitet, og er forholdsvis rett frem analyser. 4-MUC blir brukt som en grunnleggende substrat for å bestemme glycosyl hydrolase-aktivitet, som en rekke av disse enzymer (endoglucanases, exoglucanases og β-glucosidases) er aktive mot den. Hastigheten av analysen, begrenset antall krav, høy følsomhetog evne til mange cellulaser å holde fast i underlaget, gjør dette til en nyttig test for generell screening for cellulaser, eller for sondering suksessen av et uttrykk løp. Ett punkt å huske på når du bruker fire-MUC er at dette underlaget er spesielt egnet til aktiviteten til β-glucosidases, noe som gjør aktiviteten til endoglucanases (for eksempel TrCel5A) eller exoglucanases fremstå som svak i forhold til β-glucosidases eller enzymblandinger som inneholder β-glucosidases. Ved utførelse av en 4-MUC assay med lav proteinkonsentrasjon eller på annen måte lavt aktivitetsnivå er det anbefalt å benytte tilsetning av glycin (pH 10) som en stopp-løsning, ettersom pH-endring øker fluorescensen av 4-MU. CMC er et mer spesifikt substrat for enzymet uttrykt her, da det er kun nedbrutt av endoglucanases. Den Azo-CMC-analysen er mer komplisert enn den for 4-MUC, på grunn av behovet for utfelling av cellulose (og metanol) av sink. Den store fordelen med dette substrat, og dermed assay, Er at det er spesifikt for endoglucanase aktivitet, slik at det er meget nyttig for å fastlegge arten av cellulase som blir produsert. Filter papir degradering er en annen vanlig test for å etablere cellulase aktivitet. Mengden av nedbrytning observert varierer betydelig avhengig av egenskapene til det cellulase som blir vurdert, og det er et foretrukket substrat for å undersøke aktiviteten av enzymblandinger. Den PAHBAH assay, som brukes her for å undersøke filterpapir nedbrytning, gjenkjenner mengden av sukkere ut etter forsukring, og så er også anvendbar på et vidt spekter av modell substrater ikke er vist her, inkludert CMC, lichenan, β-glukan, α-cellulose, Avicel , Xylan og xyloglucan. For denne analysen, bør man sørge for å inkludere standarder på samme plate (eller i den samme kjøring) som prøvene vurderes, ettersom variasjoner i inkubasjonstider kan føre til forskjeller i resultatene. Det er derfor også viktig å gjenta analysen for å sikre nøyaktighet. I tillegg, En prøve-kontroll skal alltid kjøres, hvor prøven inkuberes uten at cellulose-substrat, for å kontrollere for eventuelle reduserende sukkere naturlig tilstede i prøvene som blir identifisert av den PAHBAH, og som ellers ville gi falske positive resultater.

Som konklusjon, er metoder for transient ekspresjon og karakterisering av rekombinant cellulase tydelig demonstrert. Disse teknikker gir en enkel måte å generere tilstrekkelige mengder av proteinet for videre undersøkelse av en eller flere av cellulaser, ved hjelp av aktivitetstester som de som demonstrert her. I særdeleshet er disse metoder gir en rask måte for å undersøke potensialet av angitte cellulaser for i planta-produksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av BMBF Forschungsinitiative "Bioenergie 2021 - Forschung für die Nützung von biomasse" og Cluster of Excellence "Skreddersydde Fuels fra biomasse", som er finansiert gjennom Excellence Initiative av den tyske føderale og statlige myndigheter for å fremme vitenskap og forskning ved tyske universiteter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside SIGMA-ALDRICH M6018
Acetic acid ROTH 3738
Acetosyringon (concentrated) ROTH 6003
Antibiotic - kanamycin ROTH T832
Antibiotic - rifampicin ROTH 4163
Antibiotic - carbenicillin ROTH 6344
Antibody - rabbit anti His(6) pAb ROCKLAND 600-401-382
Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb DIANOVA 111-055-008
Azo-carboxymethyl cellulose MEGAZYME S-ACMC
β-cyclodextrin SIGMA-ALDRICH C4805
Calcium chloride dihydrate SIGMA-ALDRICH C5080
Carboxymethyl cellulose ROTH 3333.1
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 SIGMA-ALDRICH C2730
Congo red SIGMA-ALDRICH 75768
Coomasie brilliant blue G 250 ROTH 9598.2
D(+)-glucose ROTH 8337
Ethanol ROTH K928
Filter paper - Rotilabo blotting paper ROTH CL67
NBT/BCIP SIGMA-ALDRICH 72091
MES buffer ROTH 4256
Methanol ROTH 8388
Sodium citrate ROTH 3580
Sodium dodecylsulfate SERVA 20765
Sodium hydroxide ROTH 6771
Soil, Einheitserde classic  PATZER GMBH
Spectrometer - Infinite M200 TECAN
Sucrose SIGMA-ALDRICH S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide  SIGMA-ALDRICH H9882
Phosphate buffered saline ROTH 1058
UV light source - BLAK RAY UVP
Vibratome - VT1000S Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
  2. Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
  3. Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
  4. Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
  5. Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
  6. Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
  7. Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
  8. Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
  9. Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
  10. Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
  11. Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
  12. Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
  13. Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
  14. Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  16. Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
  17. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  18. Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
  19. Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
  20. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
  21. Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).

Tags

Environmental Sciences heterolog uttrykk endoplasmatisk retikulum endoglucanase cellulose glykosyl-hydrolase fluorescens cellulase, tobakksplanter
Expression of rekombinant Cellulase Cel5A fra<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; I tobakksplanter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garvey, M., Klinger, J., Klose, H.,… More

Garvey, M., Klinger, J., Klose, H., Fischer, R., Commandeur, U. Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants. J. Vis. Exp. (88), e51711, doi:10.3791/51711 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter