Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Expression av rekombinant Cellulas Cel5A från Published: June 13, 2014 doi: 10.3791/51711
Automatic Translation
1, *1, *1, 2, 1
1Institute for Molecular Biotechnology, Bio7, RWTH Aachen University, 2Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology
* These authors contributed equally

Summary

Tobaksplantor användes för att framställa ett svampcellulas, TrCel5A via ett transient expressionssystem. Uttrycket kan övervakas med hjälp av en fluorescerande fusionsprotein och proteinet aktivitet karakteriserades efter expression.

Abstract

Cellulosa nedbrytande enzymer, cellulaser, är måltavlor för både forskning och industriella intressen. Huvuddelen av dessa enzymer i svår kultur organismer, såsom hyfer skapande svampar och anaeroba bakterier, har påskyndat användning av rekombinanta tekniker inom detta område. Växtuttrycksmetoder är ett önskvärt system för storskalig produktion av enzymer och andra industriellt användbara proteiner. Häri beskrivs metoder för transient expression av en svamp endoglukanas, Trichoderma reesei Cel5A i Nicotiana tabacum påvisas. Framgångsrik proteinexpression visas, övervakas genom fluorescens med användning av en mCherry-enzym fusionsprotein. Dessutom är en uppsättning grundläggande tester som används för att undersöka aktiviteten av övergående uttryckt T. reesei Cel5A, inklusive SDS-PAGE, Western blotting, zymografi, samt fluorescens och färgbaserade substratnedbrytningsanalyser. Det system som beskrivs här kan användas för att producera en aktiv cellULASE i en kort tid, för att bedöma potentialen för ytterligare produktion i växter genom konstitutiva eller inducerbara expressionssystem.

Introduction

Nedbrytning av lignocellulosa och dess omvandling till flytande bränsle har tänkt som en metod för att minska beroendet av fossila bränslen. Ett betydande hinder i upprättandet ekonomiskt genomförbara behandlingssystemen för biomassa är i den enzymatiska nedbrytningen av cellulosa och hemicellulosa 1. Växtexpressionssystem visar stor potential för produktion av enzymer i industriell skala. Jordbrukssystem till skördeväxter ekonomiskt och i volym redan är etablerade, som de har varit i tusentals år. Produktionen av cellulaser i växter är önskvärt på grund av faktorer såsom hur lätt autohydrolysis 2, och potentialen för att maximera användningen av lägre enzymnivåer genom att öka smältbarheten av växtcellväggar 1. Slutligen växtsystem tillåter målinriktning av rekombinanta proteiner till specifika områden av växtceller och har möjlighet att posttranslationellt modifiera enzymer där krävs 3.

ve_content ">

Nicotiana tabacum (tobak) är mycket vanligt förekommande som modellorganism för heterologa proteinexpressionsstudier i växter, på grund av sin snabba tillväxt och biomassa ackumulering har 4. Transient uttryck av rekombinanta proteiner är en teknik som gör att proteinproduktion i korta tidsperioder 5, samtidigt som flexibiliteten vad gäller lokalisering och därmed posttranslationella modifieringar av de utvalda proteiner, dvs cellulaser. Detta möjliggör produktion av cellulas (er) för grundläggande analys, samtidigt lägga grunden för ytterligare uttryck strategier i växter. Att använda en sådan transient expression strategi används en endoglukanas från glykosyl hydrolas familj 5, Cel5A, härledd från svampvärd Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 som produceras (hädanefter kallad TrCel5A). TrCel5A är ett protein 42 kDa som nativt är glykosylerat och är mycket aktiv i hydroylzing cellulosakedjor 7.

Den transienta expressionstekniken beskriven här är baserad på ett relativt vanligt förekommande system infiltrerande växtbladen med Agrobacteria som bär genen av intresse i en lämplig expressionsvektor. För att möjliggöra snabb analys av framgångsrika in planta expression kan TrCel5A även uttryckas som ett fusionsprotein med mCherry, ett monomert fluorescerande protein som ursprungligen härrör från Discosoma sp. Protein DsRed 8, med ytterligare sex histidinrester (His-tag) fuserade till C-terminalen (TrCel5A-mCherry). Uttryck av den heterologa fusionsprotein, TrCel5A-mCherry, kan alltså övervakas inom den växande anläggningen med hjälp av grönt ljus för att undersöka mCherry spridning. Om så önskas kan tunna sektioner av växtmaterialet skall undersökas under grönt ljus i mikroskop för att fastställa den specifika lokaliseringen av proteinet. För detta arbete signal och transit peptider införlivades i konstruktionen, för att lokalisera den heterologa protein export till endoplasmatiska retiklet 9.

För att analysera aktiviteten av växt uttryckta cellulaser, inklusive TrCel5A ett antal cellulas aktivitetstester kan köras. Efter extraktion av de totala lösliga växtproteiner kan TrCel5A delvis renas genom användning av en termisk inkubation teknik. Protein storlek etableras med användning av SDS-PAGE följt av Western blotting. Zymografi kan användas för att analysera aktiviteten mot substrat, t ex cellulosa som har karboxi-metylerade (gör karboximetylcellulosa: CMC) och löslighet 10. Cellulas och glukosidas-aktivitet kan övervakas med användning av fluorofor 4-metylumbelliferyl (4-MU) associerad med β-D-cellobiosid (kombinerat: 4-MUC). En annan metod att bedöma endoglukanasaktivitet involverar den spektrometriska analysen av CMC som har associerats med en azo-dye (Remazolbrilliant Blue R) 11. Dessutom kan proteinaktivitet både endoglukanaser och ett utbud av cellulaser övervakas genom användning av en sockeranalystest, såsom p-hydroxibensoesyra-hydrazid (PAHBAH)-analys 12. Dessa tekniker kan användas för att belysa och kvantifiera aktiviteten hos den uttryckta cellulas av intresse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tillväxt av vildtyp N. tabacum växter

  1. Att växa N. tabacum L. cv. Petit Havana SR1 växter på jorden, så frön tobaks på lämpliga krukor fyllda med vanlig krukväxtjord för groning. Efter 2 veckor, överföra plantor till enskilda krukor. Inkubera växter i ett växthus med konstant 22 ° C (mörk period) eller 25 ° C (ljus period) och 70% relativ luftfuktighet. Belysning av en 16/8 tim ljus / mörker-cykel (t.ex. Philips IP65 400 W lampor, 180 mikromol · s -1 · m-2, λ = 400-700 nm) och vatten dagligen.

2. Transient Expression av TrCel5A och TrCel5A-mCherry Proteiner

  1. Under sterila förhållanden, plocka enstaka kolonier av Agarobacterium tumefaciens (GV3101 :: pMP90RK gmr, KMR, RifR) innehåller antingen pTRAkc-ER-TrCel5A eller pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry och överföring till en Erlenmeyerkolv, innehållande 10 ml jästextraktbuljong (YEB, beredd enligt tillverkarens specifikationer) medium och kanamycin (50 mg / ml), rifampicin (50 mg / ml), och karbenicillin (100 mg / ml) för val. Inkubera i 36-40 h vid 26 ° C och 180 rpm. OBS: Utformningen av lämpliga konstruktioner för proteinuttryck är utanför ramen för denna uppsats, men som vägledning kan metoderna för Maclean m fl 13 och Munro och Pellham 14 skall följas för konstruktion konstruktion..
  2. Ta 200 ul av varje kultur för att inokulera 20 ml YEB med antibiotikakoncentrationer som nämns ovan och inkubera under samma betingelser som tidigare.
  3. Efter 36 till 40 timmar, preinduce odlingarna genom tillsats av 2 | il acetosyringon (200 ^ M slutlig koncentration), 100 | il 40% (vikt / volym) glukoslösning och 200 | il av 1 M MES-buffert, pH 5,6. Inkubera över natten.
  4. Bered 100 ml av en 2x infiltration buffert (100 g / I sackaros, 3,6 g / L glukos, 8,6 g / L Murashige och Skoog basala salter, Justera pH till 5,6 med användning av kalium-hydroxid).
  5. Mät OD 600 av kulturerna med 1:05 utspädningar tills den når en OD 600 på 5-6. Beräkna odlingsvolym som krävs för 30 ml infiltration medium vid OD 600. Tillsätt 15 ml 2x infiltration buffert, tillsätt sedan avjoniserat H2O för att göra buffert upp till 30 ml.
  6. Ta plantor från växthuset och använda en pipettspets till nick abaxial sidan av 3: e till 5: e bladet från toppen för att underlätta infiltrering.
  7. Använd en pipett till nick den abaxial sidan av bladen för att underlätta infiltration.
  8. Fyll en spruta med infiltrationsmedium och lägga den (utan nål) på en av de tidigare gjorda nicks. Stöd spruta med ett finger på adaxial bladsidan. Tryck på mediet försiktigt in i vävnaden av områden mellan bladzoner. Anmärkning: Efter infiltrering, odla växter i ett växthus under samma betingelser som beskrivits ovan. Också hålla en lika stor andel av untreated, icke-övergående uttryck växter (NTEPs) som kontroller, på samma villkor som infiltrerade växter.

3. Bedömning av TrCel5A-mCherry uttryck i växtblad

  1. Efter 4-6 dagar, ta växter infiltrerade med A. tumefaciens innehållande pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry från växthuset och placera dem i ett mörkt rum för fluorescensanalys.
  2. För att visualisera fluorescens i bladsektioner som uttrycker TrCel5A-mCherry, ljusanläggningar med hjälp av en bärbar ljuskälla avger grönt ljus vid 515 nm med ett rött filter (620-750 nm). OBS: På djupet kan uppnås karakterisering av proteinuttryck i växtblad med tunna sektione blad med en vibratome och undersökning under ljus och fluorescensmikroskopi. För detta följer du stegen nedan:
    1. Skär små delar av cirka 5 x 5 mm storlek från en infiltrerade löv och bädda in dem i 4% agaros upplöst i 50 mM fosfatbuffert (pH 5,7).
    2. Cutavsnitt 80-90 ìm storlek från inbäddade blad med hjälp av en vibratome. Placera dem på ett objektglas, täck med buffert eller ett täckglas och undersöka dem med hjälp av ett mikroskop vid 10X förstoring med en fluorescensdetektor, under användning av samma våglängd och filtret ovan.

4. TrCel5A Extraktion från tobaksblad

  1. Skär bitar från tobaksblad till en ungefärlig vikt på 1 g från växter infekterade med A. tumefaciens innehållande pTRAkc-ER-TrCel5A och plats i en mortel förkyld med flytande kväve. Lägg till en lämplig mängd av flytande kväve till proverna. Grind lämnar till pulver med en förkyld mortelstöt.
  2. Tillsätt 2 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid till marken blad materia och blanda tills flertalet blad materia är i suspension. Centrifugera extraktet vid 15.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C och ta proteininnehållande supernatant.
  3. CentriFuge extraktet vid 15.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C och ta proteininnehållande supematanten försiktigt så att inte störa pelleten. Kasta bort pelleten.
  4. Delvis rena TrCel5A genom inkubering av protein-innehållande supernatanten vid 55 ° C under 10 min. Låt lösningen stå vid rumstemperatur under ytterligare 10 minuter, därefter centrifugera vid 15.000 x g under 10 min vid rumstemperatur. Upprepa partiell reningsprocessen för icke-infiltrerade växter för att erhålla kontrollprover. Använd dessa prover för alla följande experiment. Anm: proteinlösningar kan förvaras vid 4 ° C i upp till en vecka eller vid -20 ° C i upp till 3 månader.
  5. Upprepa den partiella reningsprocessen för icke-infiltrerade växter för att erhålla kontrollprover. Använd dessa prover för alla följande experiment. Anm: proteinlösningar kan förvaras vid 4 ° C i upp till en vecka eller vid -20 ° C i upp till 3 månader.

5. SDS-PAGE, Western blotting, och Azo-CMC zymografi av TrCel5A-mCherry </ P>

  1. Inköp eller förbereda 12% (vikt / volym) SDS-PAGE-geler som per etablerade metoder 15.
  2. Lös CMC i vatten för erhållande av en 1,5% (vikt / volym) lösning. För att göra CMC-SDS-PAGE-geler, ersätta en ml av 1,5% CMC i en ml vatten i en 10 ml SDS-PAGE-gel mix lösning, vilket resulterade i en 0,1% (vikt / vol) CMC + 12% (vikt / volym ) SDS-PAGE-gel blandningen. Häll gelen normalt. OBS: Se till att CMC i den ursprungliga lösningen är helt upplöst genom en kombination av omrörning och uppvärmning till 40 ° C (upprepa direkt innan förbereda gellösningen).
  3. Denaturera prover genom kokning i närvaro av SDS, enligt etablerade metoder 12. Som en positiv kontroll, använd en 1:500 spädning av en kommersiellt tillgänglig cellulas blandning från T. reesei, såsom T. reesei ATCC 26921. Som negativ kontroll använda ett liknande sätt framställt proteinlösning från icke-infiltrerade blad (NTEPs).
  4. Utför elektrofores enligt vanliga protokoll 15,t.ex. använda 200 V under ~ 50 min med elektroforesen stoppas när färgämnesfronten nådde botten av gelén.
  5. Stain en SDS-PAGE-gel med användning av 0,1% (vikt / volym) Coomassie brilliant blue och avfärgning med användning av en metanol / isättika blandningen. Anm: Rapid färgning och avfärgning kan utföras genom att försiktigt värma den färgning och avfärgning lösningar, dvs genom användning av en mikrovågsugn för ~ 15 sek för att värma (men inte koka) först färgnings och därefter avfärgning lösningar, ändra avfärgningslösningen efter 10 min , eller när de svalnat, och upprepa med ny avfärgningslösning.
  6. Utför Western blotting av en SDS-PAGE-gel med användning av etablerade protokoll 16,17. Använd följande antikroppar: en polyklonal kaninantikropp mot en His-tag (primär) och en polyklonal get-anti-kanin-antikropp-Fc-region som har konjugerats till alkaliskt fosfatas (sekundär). OBS: sekundära antikroppar bör väljas för att möjliggöra visualisering med nitro tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 '-indolyphosphate p-toluidin-salt (NBT / BCIP) såsom beskrivs 18.
  7. Utför in-gel proteinåterveckning på 0,15% (vikt / vol) CMC-SDS-PAGE-gel genom att inkubera gelén i 1,5% (vikt / volym) β-cyklodextrin, 20 mM fosfat-citratbuffert, pH 6,5, vid rumstemperatur med långsam skakning i 15 min 19.
  8. Kassera β-cyklodextrin-lösning och i korthet tvätta gelén med H2O Inkubera vid rumstemperatur i 50 mM natriumacetatbuffert (pH 4,8) under ytterligare 15 min. Utför CMC zymografi med användning av den återveckade 0,15% CMC SDS-PAGE-gel genom att inkubera gelén i 30 mM natriumacetatbuffert, pH 4,8 under 20 min vid 50 ° C.
  9. Utför CMC zymografi med användning av den återveckade 0,15% (vikt / vol) CMC-SDS-PAGE-gel genom att inkubera gelén i 30 mM natriumacetat-buffert (pH 4,8) under 20 min vid 50 ° C.
  10. Färga gelén under 10 min med användning av en 0,1% vikt / volym Congo röd lösning och avfärgning under 30 minuter eller tills tydliga band observeras med användning av en M NaCl. Tvätta gelén med 0,3% (volym / volym) ättiksyra för tydligare avbildning.

6. 4-MUC Aktivitetsanalys av TrCel5A

  1. Bered en stamlösning av 10 mM 4-MUC i 50% (v / v) metanol, och förvara den i mörker vid RT
  2. Omedelbart före analysen, förbereda en 4-MUC 2x arbetslösning, bestående av 1 mM 4-MUC och 60 mM natriumacetat, pH 4,8.
  3. Utför detta test på prover innehållande 100 pl bladprotein (med eller utan TrCel5A inducerbart uttryck), 100 l en kommersiellt tillgänglig cellulas blandning från T. reesei 1:1,000 samt ren H2O, respektive. Kör varje prov i triplikat.
  4. Pipettera 100 ul av 4-MUC-arbetslösning till separata brunnar i en platta med 96 brunnar, tillsätt sedan 100 | il av varje prov.
  5. Bestäm 0 min tidpunkterna för 4-MU-fluorescens genom fluorescerande spektroskopi, med användning av en excitationsvåglängd av 360 nm och en emissionsvåglängd av 465 nm.
  6. Inkubera plattorna under 20min vid 50 ° C, täcktes med vidhäftande lock för att förhindra avdunstning. Stoppa reaktionen genom frysning (eller genom att kombinera 100 pl 0,15 M glycin, pH 10,0, och 100 ul av provet i en separat platta).
  7. Bestäm slutpunkten för 4-MU-fluorescens genom fluorescerande spektroskopi, med användning av en excitationsvåglängd av 360 nm och en emissionsvåglängd av 465 nm. Subtrahera 0 min från ändpunkt (20 min) tidpunkt för erhållande av förändringen i fluorescensvärden.

7. Azo-karboximetylcellulosa Aktivitetsanalys av TrCel5A

  1. Förbered ett lager av 1,5% (vikt / volym) Azo-CMC som har förvarats vid RT, och en fällningslösning innehållande 18 mM zinkacetat, 0,5 M natriumacetat, pH 5 och 80% etanol (v / v), lagra vid rumstemperatur temperatur.
  2. Omedelbart före analysen, förbereda en azo-CMC 2x arbetslösning, som består av 1% (vikt / volym) Azo-CMC (i H2O) och 60 mM natriumacetat, pH 4,8.
  3. Kombinera 50 | il av provet och 50 | il av det arbeteningslösning i 1,5 ml rör.
  4. Prov innehållande 50 ^ il bladprotein (med eller utan TrCel5A uttrycktes transient); 100 pl av en kommersiellt tillgänglig cellulas blandning från T. reesei utspädd 1:1000; och rent H2O Kör prover och standarder i tre exemplar.
  5. Inkubera proverna i 20 minuter vid 50 ° C. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 250 pl av fällningslösningen. Vortex varje prov kraftigt i 10 sekunder för att se till lösningar var helt kombineras.
  6. Inkubera proverna vid RT under 10 min och sedan vortex igen. Centrifugera proverna vid 1000 xg under 10 min. Avlägsna 200 l av varje prov supernatanten till en 96-brunnar, se till att inte störa pelleten.
  7. Analysen med absorbansspektroskopi vid en våglängd av 590 nm.

8. PAHBAH Assay av TrCel5A

  1. Använd ett hålslag för att skära en cirkel (~ 5,5 mm diameter) av filterpapper. Tillsätt 100 l 60 mM NaAc, pH 4,8, och 100 | il prover, antingen innehållande bladprotein (med eller utan TrCel5A inducerbart uttryckas) eller en kommersiell T. reesei cellulas blandningen, späddes 1:1000 och inkubera med filterpapper cirklar för 20 timmar vid 50 ° C med 300 rpm skakning. För varje prov inkuberas med filterpapper, även inkubera en dubblett lösning utan filterpapper som individuella prov-kontroller.
  2. Bered en 330 mM p-hydroxi-bensoesyra-hydrazid (PAHBAH) lösning A genom att lösa PAHBAH i H2O med tillsats av 5 ml koncentrerad HCl för totalt 100 ml lösning och lagra vid RT. Anmärkning: Bästa resultat uppnås genom att tillsätta HCl till en mindre volym av PAHBAH uppslamning dvs 30 ml, vilket omrörs under temperatur för att hjälpa upplösning innan volymen till 100 ml med H2O
  3. Förbered PAHBAH lösning B, innehållande 50 mM natriumcitrat, 10 mM kalciumklorid och 500 mM NaOH och förvara vid RT.
  4. Omgiately före analysen, förbereda en 1,5 x fungerande lösning av 1 ml PAHBAH reagens till 9 ml buffertlösning, lagra på is fram till användning (för att användas inom 4 timmar).
  5. Förbered prover i termo 0.2 eller 0.5 ml rör. Kombinera 5 | il av varje lösning inkuberades med filterpapper (steg 8,1) 45 | il av H2O och 100 | il av PAHBAH arbetslösning. Prov kontroller (prov inkuberade utan filterpapper) bör köras under samma koncentrationer (5 pl prov, 45 l H 2 O, 100 ^ PAHBAH arbetslösning). Också testa fem standarder (5 pl) som innehåller mellan 0 och 0,2 g / L glukos, och rent H2O Kör prover och standarder i tre exemplar.
  6. Inkubera proverna efter exakt 10 minuter vid 100 ° C, därefter svalna vid rumstemperatur under exakt 10 min. Pipette lösningar i en 96 brunnar och analys spektroskopiskt vid en våglängd på 410 nm. Subtrahera individuella prov-kontroller (inkuberade utan filterpapper) från prover för att få slutligtvärden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TrCel5A och TrCel5A-mCherry uttrycktes framgångsrikt i tobaksplantor med hjälp av transient expressionssystem (figur 1A och 1B). En undersökning av uttrycksmönstret av TrCel5A-mCherry fusionsproteinet avslöjade friska blad (Figur 1C), som visade utbredd proteinexpression under grönt ljus (figur 1D).

Extraktion av de totala lösliga proteinerna utfördes på tobaksplantor som hade blad som innehöll uttrycktes transient TrCel5A protein och SDS-PAGE visade en stor mängd proteiner var närvarande (figur 2A, spår 1). Den totala lösliga proteinet prov från TrCel5A uttryckande växter och totalt lösligt protein prov härlett från NTEPs, inkuberades under 10 min vid 55 ° C. TrCel5A förblir stabil och aktiv vid 55 ° C under det att många andra (nativa tobaks) proteiner är inte stabila vid denna temperatur. Alltså, många icke-essential-proteiner fälldes ut genom denna behandling, vilket ger en partiellt renade prov av TrCel5A. Efter denna termiska-utfällningssteget ades ett starkt proteinband observerades vid ca 40 kDa (Figur 2A, rad 1). Detta kommer sannolikt att vara den katalytiska domänen (CD) hos TrCel5A, som har visats tidigare för att köra i denna storlek, när den uttrycks i växter 4. De negativa och positiva kontrollprover (figur 2A, spår 3 och 4, respektive) visade låga halter av kvarvarande termotoleranta tobaksproteiner från NTEPs (negativ kontroll, figur 2A, spår 3) och flera band vilket indikerar en blandning av T. reeseZ proteiner (positiv kontroll, figur 2A, rad 4).

Storleken på TrCel5A bekräftades genom antikroppsfärgning riktad mot His-6tag införlivas med TrCel5A C-terminalen, vilket ansågs vara frånvarande för båda kontrollerna (Figur 2B). Den TrCel5A visadesbehålla endoglukanasaktivitet av CMC zymografi (Fig. 2C, lanes 1 och 2), där den återvikta proteinet skapat ett starkt röjda området, vilket tyder på CMC nedbrytning, på samma höjd som i den Coomassie-färgade SDS-PAGE-gel och Western blöt. Ingen aktivitet observerades för de icke-cellulas-proteinblandningar från NTEPs (Figur 2C, rad 3), och blandningen av T. reeseZ proteiner körs som en positiv kontroll visade endoglukanasaktivitet från flera komponenter (Figur 2C, rad 4).

För att kvantifiera cellulolytisk aktivitet av TrCel5A tre analyser användes. För det första var nedbrytningen av 4-MUC analyseras genom att observera den ökade utsläpp fluorescens vid 465 nm (exciteras vid 360 nm) av den frigjorda 4-MU. TrCel5A visades försämra 4MUC, som gjorde en 1:1000 utspädning av en kommersiellt tillgänglig blandning av T. reesei cellulas (figur 3A).

En kvantifierbar analysav aktiviteten av TrCel5A mot CMC gjordes genom att mäta frisättningen av en azo-färgämnet vid 590 nm från Azo-CMC. TrCel5A aktivitet under dessa betingelser, var ekvivalent i aktivitet till en 1:1000 utspädning av cellulas blandningen som nämns ovan (Figur 3B).

Förmågan hos TrCel5A att försämra filterpapper analyserades också. För denna analys användes en initial försockring analys utförd (dvs med TrCel5A lösning försämra filterpapper) och den överstående vätskan analyserades med PAHBAH-analysen för att fastställa den mängd reducerande sockerarter som frigörs (Figur 3B).

Figur 1
Figur 1. Växtuttryckskassetter för TrCel5A konstruktioner och heterologt uttryck av TrCel5A-mCherry i atttobak lämnar visualiseras genom fluorescens under grönt ljus. Schematiska representationer av växtexpressionskassett som används för TrCel5A (A) och TrCel5A-mCherry (B) visas. Efter övergående TrCel5A-mC uttryck, var tobaksblad undersöktes under normal (C) eller grönt ljus (D). För panelerna (A) och (B) CaMV-promotorn (P35SS) och terminatorsignal (pA35S) indikeras i ljusblått. 5'-UTR av chalkonsyntas (CHS) och His6-kodande sekvensen (His6) indikeras i blått. Anläggningen kodonoptimerade ledarpeptiden (LPH) härledd från den tunga kedjan av den murina mAb24 är avbildad i grönt. LPH uppnår utsöndringen av det rekombinanta proteinet mot apoplasten, efter vilken en C-terminal KDEL-signalen, som visas i rött, fördröjer det protein till ER. Arrows märka bindningsstället för primer för att amplifiera CaMV 35SS expressionskassetten. För panelerna (C) och (D) den gröna lampan hade en excitation 515 nm.Bilder togs utan förstoring.

Figur 2
. Figur 2 Storlek och aktivitet TrCel5A visas av SDS-PAGE, Western blotting, och CMC zymography Separation av de totala lösliga proteiner:. Från växter tobaks där TrCel5A transient uttryckt före (1) och efter (2) värme nederbörd rening; från tobaksplantor där TrCel5A inte var närvarande, även efter termisk nederbörd (3); eller av en kommersiellt tillgänglig blandning av T. reesei cellulas (4). SDS-PAGE-separerade proteinerna visualiseras med Coomassie Blue-färgning (A), Western-blotting mot His-tag-regionen TrCel5A (B), och den cellulasaktivitet visas genom zymografi med användning av CMC visualiserades med användning av kongorött (C). PageRuler Plus(Fermentas) användes som molekylviktsmarkör (M).

Figur 3
Figur 3. Enzymaktivitet kvantifiering av TrCel5A. TrCel5A inkuberades med 4-MUC (A), Azo-CMC (B), och filterpapper (C) och substratet nedbrytning mätt genom frisättning av fluoroforen 4-MU (A), ett azo-färgämne (B) eller genom att kvantifiera reducerande socker genom övervakning av färgförändring hos PAHBAH (C). Varje analys visar resultaten för tre replikat. Felstaplar anger standardavvikelsen. I alla tre analyserna de analyserade proven var enbart buffert, TrCel5A efter termisk utfällning rening, NTEP (WT Nt) efter termisk utfällning rening, och en kommersiellt tillgänglig blandning av T. reesei cellulaser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinant expression av cellulaser är ett område av stort intresse, på grund av en önskan om mer effektiva biobränslen produktionssystem 1. Växter erbjuder många möjligheter för en lyckad cellulasproduktion, med funktioner som ekonomisk skördeteknik och autohydrolysis metoder vara mycket önskvärda egenskaper för storskalig produktion av biobränsle. Vidare användning av olika lokaliseringar för att producera proteiner tillåter, om så krävs, posttranslationella modifieringar 20. Ändra växter för att konstitutivt uttryck av cellulaser, samtidigt som den erbjuder uppenbara fördelar, är en tidskrävande metod som kan eller inte kan vara framgångsrika. Tekniker såsom kvarstad av de uttryckta proteinerna och inducerbara uttrycksmekanismer ökar sannolikheten för framgångsrika cellulasproduktion i växter, men dessa fortfarande ta många månader att etablera. Här är övergående uttrycksmetoder visat, för att illustrera möjligheten för en specifik cellulasatt produceras genom växtsystem inom några dagar.

En fusion med det fluorescerande proteinet mCherry användes här för att visa att framgången för de transienta proteinexpressionsmetoder. TrCel5A-mCherry tydligt fördelat över de flesta bladen som hade infiltrerats med vektorn innehållande Agrobacteria. Lokalisering till det endoplasmatiska nätverket möjliggör posttranslationella modifieringar av det uttryckta proteinet. Möjligheten av ett expressionssystem för att möjliggöra t.ex. glykosylering är särskilt viktigt för de cellulaser som ursprungligen härrör från svamporganismer, som T. reesei 21. Jäst expressionssystem, som är allt mer populärt för heterologt cellulas uttryck, ofta leda till hyper-glykosylering av de enzymer, som debatteras för att vara ett potentiellt hinder för fullt cellulasaktivitet 22. Växt glykosylering mekanismer enre utan nackdelen att hyper-glykosylering. Dessutom har expression i växtsystem möjliggör lokalisering till områden som tillåter eller inte tillåter posttranslationella modifieringar, vilket gör det möjligt att anpassa till källan av proteinet. Systemet visade här kan också användas, genom tillämpning av olika signalsekvenser 14, för lokalisering till apoplasten, kloroplast, cytosol eller Golgi vesiklar. Användningen av fluorescerande proteinfusioner, såsom TrCel5A-mCherry, kan visa framgången för proteinuttryck samt lokaliseringen av proteinet. Emellertid är sådana konjugat krävs inte för ytterligare aktivitetstester. Det rekommenderas att en icke-mCherry TrCel5A konstrukt användas för alla ytterligare tester, såsom visas här, för att erhålla mer exakta aktivitetsdata av den uttryckta cellulas. Beträffande kontroller för ytterligare experiment, är prover från icke-transient infiltrerade växter som vanligen ses som tillräckliga kontroller.

5. Zymography analys av aktivitet mot CMC indikerade att den återstående peptiden var verksam som endoglukanas. Även om SDS-PAGE och Western blotting är extremt vanliga analyser är CMC zymografi ett mycket mer specifikt test för cellulas (särskilt endoglukanas) aktivitet. Några viktiga faktorer att tänka på för framgångsrika zymography resultat är a) att substratet (i det här fallet CMC) måste vara helt upplöst och jämnt fördelade över hela gelen; b) att proteinet måste framgångsrikt återveckas, företrädesvis i en kort period för att begränsa mängden av protein diffusion genom gelén; och c) attaktivitetsanalysen bör vara den optimala temperaturen för enzymet som analyseras (för TrCel5A mellan 50 och 60 ° C) och bör vara kort för att möjliggöra skarpare band av nedbrytning.

Kvantitativ analys av den cellulasaktivitet av uttryckt TrCel5A visade att enzymet var aktivt mot en mängd olika substrat, inklusive 4-MUC, CMC och filterpapper. Var och en av substraten undersöktes med en annan spektroskopisk prov, antingen via en fluorofor (4-MU) eller genom ljusspridning analys av en färgreaktion (Azo-färgämne eller PAHBAH). Alla tre substraten och analyser är allmänt används för bedömningen av cellulasaktivitet, och är relativt enkelt analyser. 4-MUC används som ett grundsubstrat för att bestämma glykosyl hydrolas-aktivitet, eftersom en stor mängd av dessa enzymer (endoglukanaser, exoglucanases och β-glukosidaser) är verksamma mot den. Hastigheten hos analysen, begränsat antal krav, hög känslighetoch möjligheten för många cellulaser att klyva substratet, gör detta till en användbar analys för allmän screening för cellulaser, eller för att sondera framgång för ett uttryck körning. En sak att tänka på när du använder 4-MUC är att detta substrat är särskilt lämpad för aktiviteten av β-glukosidaser, vilket gör aktiviteten av endoglukanaser (t.ex. TrCel5A) eller exoglucanases verka svag i jämförelse med β-glukosidaser eller enzymblandningar som innehåller β-glukosidaser. Vid utförande av ett 4-MUC-analys med låga proteinkoncentrationer eller annars låga aktivitetsnivåer är det rekommenderat att använda tillsats av glycin (pH 10) som en enda lösning, som pH förändring förstärker fluorescensen av 4-MU. CMC är ett mer specifikt substrat för enzymet uttrycks här, eftersom det är bara ned av endoglukanaser. Azo-CMC-analysen är mer komplicerad än den för 4-MUC, på grund av behovet av en utfällning av cellulosa (och metanol) av zink. Den största fördelen med detta substrat, och därmed analys, Är att den är specifik för endoglukanas-aktivitet, vilket gör den mycket användbar för att fastställa vilken typ av cellulas som produceras. Filter nedbrytning papper är ett annat vanligt test för att fastställa cellulasaktivitet. Mängden nedbrytning observeras varierar betydligt beroende på egenskaperna hos cellulas som bedöms, och det är ett föredraget substrat för att undersöka aktiviteten av enzymblandningar. Den PAHBAH analysen används här för att undersöka filterpapper nedbrytning, erkänner mängden socker släpptes efter försockringen och så är också tillämplig på ett brett spektrum av modellsubstrat inte visat här, inklusive CMC, lichenan, β-glukan, α-cellulosa, AVICEL , xylan och xyloglukan. För denna analys, bör man se till att även omfatta normer för samma platta (eller i samma körning) som proven bedöms, som variation i inkubationstider kan leda till skillnader i resultat. Det är således också viktigt att upprepa analysen för att säkerställa noggrannheten. Dessutom, Ett kontrollprov skall alltid köras, där provet inkuberas utan cellulosaunderlaget, för att kontrollera för eventuella reducerande sockerarter som förekommer naturligt i de prover som skulle kunna identifieras av PAHBAH och annars skulle ge ett falskt positivt resultat.

Sammanfattningsvis är förfaranden för övergående uttryck och karakterisering av en rekombinant-cellulas tydligt. Dessa tekniker ger ett enkelt sätt att generera tillräckliga mängder protein för vidare undersökning av en eller flera cellulaser, med hjälp av aktivitetstester som de som visats här. Särskilt dessa metoder ger ett snabbt sätt att undersöka potentialen för utsedda cellulaser i planta produktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 - Forschung für die Nutzung von Biomasse" och Cluster of Excellence "Skräddarsydda bränslen från biomassa", som finansieras genom Excellence Initiative av de tyska federala och statliga myndigheter för att främja vetenskap och forskning vid tyska universitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside SIGMA-ALDRICH M6018
Acetic acid ROTH 3738
Acetosyringon (concentrated) ROTH 6003
Antibiotic - kanamycin ROTH T832
Antibiotic - rifampicin ROTH 4163
Antibiotic - carbenicillin ROTH 6344
Antibody - rabbit anti His(6) pAb ROCKLAND 600-401-382
Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb DIANOVA 111-055-008
Azo-carboxymethyl cellulose MEGAZYME S-ACMC
β-cyclodextrin SIGMA-ALDRICH C4805
Calcium chloride dihydrate SIGMA-ALDRICH C5080
Carboxymethyl cellulose ROTH 3333.1
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 SIGMA-ALDRICH C2730
Congo red SIGMA-ALDRICH 75768
Coomasie brilliant blue G 250 ROTH 9598.2
D(+)-glucose ROTH 8337
Ethanol ROTH K928
Filter paper - Rotilabo blotting paper ROTH CL67
NBT/BCIP SIGMA-ALDRICH 72091
MES buffer ROTH 4256
Methanol ROTH 8388
Sodium citrate ROTH 3580
Sodium dodecylsulfate SERVA 20765
Sodium hydroxide ROTH 6771
Soil, Einheitserde classic  PATZER GMBH
Spectrometer - Infinite M200 TECAN
Sucrose SIGMA-ALDRICH S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide  SIGMA-ALDRICH H9882
Phosphate buffered saline ROTH 1058
UV light source - BLAK RAY UVP
Vibratome - VT1000S Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
  2. Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
  3. Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
  4. Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
  5. Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
  6. Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
  7. Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
  8. Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
  9. Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
  10. Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
  11. Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
  12. Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
  13. Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
  14. Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  16. Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
  17. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  18. Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
  19. Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
  20. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
  21. Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).

Tags

Miljövetenskap heterologt uttryck endoplasmatiska retiklet endoglukanaset cellulosa glykosyl-hydrolas fluorescens cellulas, växter tobak
Expression av rekombinant Cellulas Cel5A från<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; I tobaksplantor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garvey, M., Klinger, J., Klose, H.,… More

Garvey, M., Klinger, J., Klose, H., Fischer, R., Commandeur, U. Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants. J. Vis. Exp. (88), e51711, doi:10.3791/51711 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter