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संयोजक Cellulase Cel5A की अभिव्यक्ति से Published: June 13, 2014 doi: 10.3791/51711
Automatic Translation
1, *1, *1, 2, 1
1Institute for Molecular Biotechnology, Bio7, RWTH Aachen University, 2Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology
* These authors contributed equally

Summary

तम्बाकू पौधों एक क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली के माध्यम से, एक कवक cellulase, TrCel5A निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया गया. अभिव्यक्ति एक फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन का उपयोग पर नजर रखी जा सकता है, और प्रोटीन गतिविधि के बाद अभिव्यक्ति की विशेषता थी.

Abstract

सेलूलोज़ अपमानजनक एंजाइमों, cellulases, अनुसंधान और औद्योगिक हितों दोनों का लक्ष्य कर रहे हैं. ऐसे hyphae निर्माण कवक और anaerobic बैक्टीरिया के रूप में मुश्किल को संस्कृति जीवों में इन एंजाइमों की प्रधानता है, इस क्षेत्र में पुनः संयोजक प्रौद्योगिकियों का उपयोग तेजी से किया गया है. संयंत्र अभिव्यक्ति के तरीकों एंजाइमों और अन्य औद्योगिक रूप से उपयोगी प्रोटीन का बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक वांछनीय व्यवस्था कर रहे हैं. इस के साथ साथ, तमाखू में एक कवक endoglucanase, ट्राइकोडर्मा reesei Cel5A, का क्षणिक अभिव्यक्ति के तरीकों के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. सफल प्रोटीन अभिव्यक्ति एक mCherry एंजाइम संलयन प्रोटीन का उपयोग कर प्रतिदीप्ति द्वारा निगरानी, ​​दिखाया गया है. साथ ही, बुनियादी परीक्षण का एक सेट transiently व्यक्त टी. की गतिविधियों की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है एसडीएस पृष्ठ, पश्चिमी सोख्ता, zymography, साथ ही प्रतिदीप्ति और डाई आधारित सब्सट्रेट गिरावट assays सहित reesei Cel5A,. यहाँ वर्णित प्रणाली एक सक्रिय सेल का उत्पादन किया जा सकता हैएक कम समय अवधि में ulase, विधान या inducible अभिव्यक्ति सिस्टम के माध्यम से पौधों में अधिक उत्पादन के लिए क्षमता का आकलन किया जा सके.

Introduction

Lignocellulosic बायोमास और तरल ईंधन में अपने रूपांतरण की गिरावट जीवाश्म ईंधन पर निर्भरता कम करने के लिए एक विधि के रूप में कल्पना की गई है. आर्थिक रूप से व्यवहार्य बायोमास प्रोसेसिंग सिस्टम स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण बाधा सेलूलोज़ और hemicellulose 1 के enzymatic गिरावट में है. संयंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम एक औद्योगिक पैमाने पर एंजाइमों के उत्पादन के लिए महान क्षमता दिखा. वे हजारों साल के लिए किया गया है के रूप में फसल पौधों आर्थिक और मात्रा में करने के लिए कृषि प्रणालियों पहले से ही स्थापित कर रहे हैं. पौधों में cellulases के उत्पादन की वजह से autohydrolysis 2 में आसानी, और संयंत्र सेल दीवारों 1 की पाचनशक्ति में वृद्धि से कम एंजाइम का स्तर के उपयोग को अधिकतम करने के लिए क्षमता जैसे कारकों के लिए वांछनीय है. अंत में, संयंत्र प्रणालियों संयंत्र कोशिकाओं के विशिष्ट क्षेत्रों को पुनः संयोजक प्रोटीन को निशाना अनुमति देते हैं और posttranslationally 3 जहां आवश्यक एंजाइमों को संशोधित करने में सक्षम हैं.

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तमाखू (तम्बाकू) बहुत सामान्य कारण इसका तेजी से विकास और बायोमास संचय सुविधाओं से 4, पौधों में heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया जाता है. पुनः संयोजक प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति स्थानीयकरण के रूप में लचीलापन बनाए रखने और इस प्रकार चयनित प्रोटीन, यानी cellulases की posttranslational संशोधनों, जबकि कम समय अवधि 5 में प्रोटीन के उत्पादन में सक्षम बनाता है जो एक तकनीक है. यह भी पौधों में आगे अभिव्यक्ति रणनीतियों के लिए नींव बिछाने, जबकि बुनियादी विश्लेषण के लिए cellulase (एस) के उत्पादन में सक्षम बनाता है. इस तरह के एक क्षणिक अभिव्यक्ति रणनीति का प्रयोग, कवक होस्ट ट्राइकोडर्मा reesei (Hypocrea jecorina) से व्युत्पन्न glycosyl hydrolase परिवार 5, Cel5A, 6 से एक endoglucanase (इसके बाद TrCel5A के रूप में) का उत्पादन किया है. TrCel5A natively ग्लाइकोसिलेटेड है जो एक 42 केडीए प्रोटीन होता है और हैदराबाद में अत्यधिक सक्रिय हैसेल्यूलोज चेन 7 roylzing.

यहाँ वर्णित क्षणिक अभिव्यक्ति तकनीक संयंत्र Agrobacteria एक उपयुक्त अभिव्यक्ति वेक्टर में ब्याज की जीन ले जाने के साथ छोड़ देता है घुसपैठ, एक अपेक्षाकृत अधिक इस्तेमाल किया प्रणाली पर आधारित है. Planta अभिव्यक्ति में सफल का तेजी से विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए, TrCel5A भी mCherry, मूल रूप से Discosoma सपा से व्युत्पन्न एक मोनोमेरिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ एक संलयन प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया जा सकता है. प्रोटीन के लिए जुड़े हुए एक अतिरिक्त छह हिस्टडीन अवशेषों (उनकी टैग) के साथ, 8 DsRed सी टर्मिनस (TrCel5A-mCherry). Heterologous संलयन प्रोटीन, TrCel5A-mCherry की अभिव्यक्ति इस प्रकार mCherry प्रसार की जांच करने के लिए हरी बत्ती का उपयोग करके बढ़ संयंत्र के भीतर नजर रखी जा सकती है. अगर वांछित, संयंत्र सामग्री की पतली वर्गों प्रोटीन की विशिष्ट स्थानीयकरण स्थापित करने के लिए microscopically हरी बत्ती के तहत जांच की जा सकती. इस काम है, संकेत और ट्रॅन के लिएबैठने पेप्टाइड्स जालिका 9 को heterologous प्रोटीन निर्यात स्थानीयकरण करने, निर्माण में शामिल किया गया.

Cellulase गतिविधि परीक्षणों के एक नंबर चलाया जा सकता है TrCel5A, सहित संयंत्र व्यक्त cellulases, की गतिविधि का विश्लेषण. कुल घुलनशील संयंत्र प्रोटीन की निकासी के बाद, TrCel5A आंशिक रूप से एक थर्मल ऊष्मायन तकनीक का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है. प्रोटीन आकार पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा एसडीएस पृष्ठ का उपयोग कर स्थापित कर रहा है. घुलनशीलता 10 के लिए: (सीएमसी Carboxymethyl सेलूलोज़ बनाने) zymography substrates, carboxy-methylated किया गया है जो जैसे सेल्यूलोज के खिलाफ गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Cellulase और ग्लुकोसिडेस गतिविधि (4-MUC संयुक्त) β-D-cellobioside के साथ जुड़े फ्लोरोफोरे 4-methylumbelliferyl (4 यू) का उपयोग पर नजर रखी जा सकती है. Endoglucanase गतिविधि का आकलन करने के लिए एक अन्य विधि एक AZO-D के साथ संबद्ध किया गया है जो सीएमसी के spectrometric विश्लेषण शामिलतु (Remazolbrilliant ब्लू नि.) 11. इसके अलावा, endoglucanases और cellulases की एक सीमा के दोनों प्रोटीन गतिविधि P-हाइड्रोक्सी benzoic एसिड hydrazide (PAHBAH) परख 12 के रूप में एक चीनी विश्लेषण परीक्षण के उपयोग, द्वारा नजर रखी जा सकती है. इन तकनीकों में ब्याज की व्यक्त cellulase की गतिविधि को स्पष्ट और यों इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

जंगली प्रकार एन tabacum संयंत्रों की 1. ग्रोथ

  1. एन विकसित करने के लिए tabacum एल CV. धरती पर पेटिट हवाना SR1 पौधों, अंकुरण के लिए सामान्य potting मिट्टी से भर उपयुक्त बर्तन पर तम्बाकू बीज प्लेस. 2 सप्ताह के बाद, व्यक्तिगत बर्तन करने के लिए seedlings के हस्तांतरण. लगातार 22 डिग्री सेल्सियस (अंधेरे अवधि) या 25 डिग्री सेल्सियस (प्रकाश की अवधि) के साथ एक ग्रीन हाउस में पौधों और 70% रिश्तेदार हवा नमी सेते हैं. एक 16/8 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र में रोशनी प्रदान (जैसे फिलिप्स IP65 400 डब्ल्यू लैंप, 180 μmol · सेकंड -1 · एम -2, λ = 400-700 एनएम) दैनिक और पानी.

TrCel5A और TrCel5A-mCherry प्रोटीन की 2. क्षणिक अभिव्यक्ति

  1. बाँझ शर्तों के तहत, Agarobacterium tumefaciens के एकल कालोनियों (GV3101 :: pMP90RK जीएमआर, KMR, RifR) pTRAkc-ईआर TrCel5A या pTRAkc-ईआर TrCel5A-mCherry और 10 एमएल खमीर निकालने युक्त एक Erlenmeyer फ्लास्क को हस्तांतरण जिसमें या तो उठाचयन के लिए शोरबा (YEB, निर्माताओं विनिर्देशों के अनुसार तैयार) मध्यम और kanamycin (50 मिलीग्राम / एमएल), रिफाम्पिसिन (50 मिलीग्राम / एमएल), और कार्बेनिसिलिन (100 मिलीग्राम / एमएल). 26 डिग्री सेल्सियस पर 36-40 घंटा और 180 आरपीएम के लिए सेते हैं. नोट: प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त निर्माणों की डिजाइन इस पत्र के दायरे से बाहर है, लेकिन मार्गदर्शन के लिए, मैक्लीन एट अल 13 और मुनरो और Pellham 14 के तरीकों का निर्माण डिजाइन के लिए पीछा किया जा सकता है..
  2. जैसा कि ऊपर उल्लेख एंटीबायोटिक सांद्रता के साथ YEB की 20 मिलीलीटर टीका लगाना और पहले की तरह ही परिस्थितियों में सेते प्रत्येक संस्कृति के 200 μl लो.
  3. 36-40 घंटे के बाद, 2 μl acetosyringon (200 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता), 100 μl 40% (w / v) ग्लूकोज समाधान और 1 एम एमईएस बफर पीएच 5.6 के 200 μl. जोड़कर संस्कृतियों preinduce रातोंरात सेते हैं.
  4. एक 2x घुसपैठ बफर (100 छ / एल सुक्रोज, 3.6 ग्राम / एल ग्लूकोज, 8.6 ग्राम / एल Murashige और Skoog बेसल लवण की 100 मिलीलीटर की तैयारी,) पोटेशियम हीड्राकसीड का उपयोग 5.6 पीएच को समायोजित करें.
  5. यह एक आयुध डिपो 5-6 से 600 तक पहुँच जाता है जब तक 01:05 dilutions के साथ संस्कृतियों के आयुध डिपो 600 उपाय. आयुध डिपो के 600 में 30 मिलीलीटर घुसपैठ मध्यम के लिए आवश्यक संस्कृति मात्रा की गणना. 2x घुसपैठ बफर के 15 मिलीलीटर जोड़ें, फिर 30 मिलीलीटर अप करने के लिए बफर बनाने के लिए विआयनीकृत एच 2 हे जोड़ें.
  6. ग्रीन हाउस से पौधों लो और घुसपैठ को कम करने के लिए ऊपर से 5 वें पत्ती को निक के लिए 3 से शरीर की अक्ष रेखा में न स्थित रहने वाला पक्ष एक विंदुक टिप का उपयोग करें.
  7. घुसपैठ को कम करने के लिए निक के पत्तों की शरीर की अक्ष रेखा में न स्थित रहने वाला पक्ष एक विंदुक टिप का उपयोग करें.
  8. घुसपैठ माध्यम के साथ एक सिरिंज भरें और पहले किए गए nicks में से एक पर (सुई) के बिना डाल दिया. मध्यतल की ओर पत्ती तरफ एक उंगली से सिरिंज का समर्थन करें. Interveinal पत्ती क्षेत्रों के ऊतकों में ध्यान से मध्यम दबाएँ. नोट: घुसपैठ के बाद, जैसा कि ऊपर वर्णित एक ही परिस्थितियों में एक ग्रीन हाउस में पौधों की खेती. इसके अलावा, untr की एक समान अनुपात बनाए रखने केघुसपैठ पौधों के रूप में एक ही परिस्थितियों में नियंत्रण के रूप में eated, गैर क्षणिक अभिव्यक्ति पौधों (NTEPs),.

संयंत्र पत्तियों में TrCel5A-mCherry अभिव्यक्ति की 3. आकलन

  1. 4-6 दिनों के बाद, ए के साथ घुसपैठ पौधों ले ग्रीन हाउस से pTRAkc-ईआर TrCel5A-mCherry युक्त और प्रतिदीप्ति विश्लेषण के लिए एक अंधेरे कमरे में उन्हें जगह tumefaciens.
  2. एक लाल फिल्टर (620-750 एनएम) के साथ 515 एनएम पर हरे प्रकाश उत्सर्जक एक पोर्टेबल प्रकाश स्रोत का उपयोग TrCel5A-mCherry, प्रकाश पौधों व्यक्त पत्ती वर्गों में प्रतिदीप्ति कल्पना करने के लिए. नोट: गहराई में संयंत्र पत्तियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लक्षण वर्णन प्रकाश और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत एक vibratome और परीक्षा के साथ पतली सेक्शनिंग के पत्तों से प्राप्त किया जा सकता है. इस के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें:
    1. एक घुसपैठ की पत्ती से लगभग 5 एक्स 5 मिमी आकार के छोटे वर्गों में कटौती और agarose 50 मिमी में फॉस्फेट बफर (पीएच 5.7) को भंग कर 4% में उन्हें एम्बेड.
    2. कटौतीएक vibratome का उपयोग एम्बेडेड पत्तियों से 80-90 माइक्रोन आकार की धारा. बफर या एक कवर पर्ची के साथ कवर और ऊपर कहा गया है कि एक ही तरंग दैर्ध्य और फिल्टर का उपयोग कर, एक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर के साथ 10x बढ़ाई पर एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर उन्हें जांच, एक खुर्दबीन स्लाइड पर रखें.

तम्बाकू के पत्ते से 4. TrCel5A निकालना

  1. ए से संक्रमित पौधों से 1 ग्राम की एक अनुमानित वजन को तम्बाकू के पत्तों से टुकड़े काटें pTRAkc-ईआर TrCel5A और तरल नाइट्रोजन के साथ precooled एक मोर्टार में जगह युक्त tumefaciens. नमूनों को तरल नाइट्रोजन का एक उचित मात्रा में जोड़ें. पीस एक precooled मूसल का उपयोग पाउडर को छोड़ देता है.
  2. जमीन पत्ती बात करने के लिए 1 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड युक्त फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) के 2 मिलीलीटर जोड़ें और पत्ती बात का बहुमत निलंबन में है जब तक मिश्रण. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 15,000 XG पर और प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला ले अपकेंद्रित्र निकाल सकते हैं.
  3. CentriFuge 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 15,000 XG पर निकालने और गोली बाधित करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला ले. गोली त्यागें.
  4. आंशिक रूप से 10 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला incubating द्वारा TrCel5A शुद्ध. आरटी पर 10 मिनट के लिए 15,000 XG पर अपकेंद्रित्र फिर, एक और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर आराम करने की अनुमति. नियंत्रण के नमूने प्राप्त करने के लिए गैर घुसपैठ पौधों के लिए आंशिक शोधन प्रक्रिया को दोहराएं. निम्न सभी प्रयोगों के लिए इन नमूनों का प्रयोग करें. नोट: प्रोटीन समाधान के लिए 3 महीने के लिए 1 सप्ताह के लिए या -20 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
  5. नियंत्रण के नमूने प्राप्त करने के लिए गैर घुसपैठ पौधों के लिए आंशिक शोधन प्रक्रिया को दोहराएं. निम्न सभी प्रयोगों के लिए इन नमूनों का प्रयोग करें. नोट: प्रोटीन समाधान के लिए 3 महीने के लिए 1 सप्ताह के लिए या -20 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

5. एसडीएस पृष्ठ, पश्चिमी सोख्ता, और TrCel5A-mCherry <की Azo-सीएमसी zymography/ P>

  1. खरीद या स्थापित विधियों 15 प्रति के रूप में (w / v) एसडीएस पृष्ठ जैल 12% तैयार करते हैं.
  2. एक 1.5% (w / v) समाधान प्राप्त करने के लिए पानी में सीएमसी भंग. सीएमसी एसडीएस पृष्ठ जैल बनाने के लिए, (w / v) सीएमसी + 12% (w / v एक 0.1%, जिसके परिणामस्वरूप एक 10 मिलीलीटर एसडीएस पृष्ठ जेल मिश्रण समाधान में पानी के 1 मिलीलीटर के लिए 1.5% सीएमसी के 1 मिलीलीटर स्थानापन्न ) एसडीएस पृष्ठ जेल मिश्रण. सामान्य रूप से जेल डालो. नोट: (सीधे पूर्व जेल समाधान की तैयारी को दोहराने) मूल समाधान में सीएमसी पूरी तरह से 40 डिग्री सेल्सियस के लिए सरगर्मी और गर्म करने का एक संयोजन द्वारा भंग कर रहा है कि निश्चित करना है.
  3. स्थापित विधियों 12 के अनुसार, एसडीएस की उपस्थिति में उबलते द्वारा नमूनों denature. एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, टी. से एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध cellulase मिश्रण का एक 1:500 कमजोर पड़ने का उपयोग ऐसे टी. के रूप में reesei, reesei ATCC 26,921. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में गैर घुसपैठ की पत्तियों (NTEPs) से एक इसी तरह तैयार प्रोटीन समाधान का उपयोग करें.
  4. सामान्य प्रोटोकॉल 15 के अनुसार वैद्युतकणसंचलन बाहर ले जाने,डाई सामने जेल की तह तक पहुँच एक बार जैसे रुका वैद्युतकणसंचलन के साथ 50 मिनट के लिए ~ 200 वी का उपयोग करें.
  5. 0.1% का उपयोग कर एक एसडीएस पृष्ठ जेल दाग (w / v) Coomassie नीले शानदार और एक मेथनॉल / हिमनदों एसिटिक एसिड मिश्रण का उपयोग destain. नोट: रैपिड धुंधला और destaining धीरे धुंधला हीटिंग और 10 मिनट के बाद destaining समाधान बदलते, गर्म (लेकिन नहीं फोड़ा) पहले धुंधला हो जाना और फिर destaining समाधान करने के लिए 15 सेकंड ~ के लिए एक माइक्रोवेव का उपयोग करके यानी समाधान, destaining द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है , या ठंडा, और नई destaining समाधान के साथ दोहराने जब.
  6. स्थापित प्रोटोकॉल 16,17 का उपयोग कर एक एसडीएस पृष्ठ जेल के पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन करना. (माध्यमिक) एक alkaline फॉस्फेट संयुग्मित किया गया है जो एक उनके टैग (प्राथमिक) और एक पॉलीक्लोनल बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी एफसी क्षेत्र के खिलाफ एक पॉलीक्लोनल खरगोश एंटीबॉडी: निम्नलिखित एंटीबॉडी का प्रयोग करें. नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी nitroblue tetrazol का उपयोग दृश्य सक्षम चयनित किया जाना चाहिएIUM chloride/5-bromo-4-chloro-3 'indolyphosphate पी toluidine नमक (एनबीटी / BCIP), 18 में वर्णित के रूप में.
  7. 0.15% पर refolding में जेल प्रोटीन (w / v) कमरे के तापमान पर β-cyclodextrin, 20 मिमी फॉस्फेट साइट्रेट बफर, 6.5 पीएच, के साथ 1.5% में जेल incubating द्वारा (w / v) सीएमसी एसडीएस पृष्ठ जेल प्रदर्शन करना कोमल 15 मिनट 19 के लिए मिलाते हुए.
  8. Β-cyclodextrin समाधान त्यागें और संक्षेप में एच 2 ओ के साथ जेल धोने एक और 15 मिनट के लिए 50mm सोडियम एसीटेट बफर (पीएच 4.8) में आरटी पर सेते हैं. 50 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 30 मिमी सोडियम एसीटेट बफर पीएच 4.8 में जेल incubating द्वारा refolded 0.15% सीएमसी एसडीएस पृष्ठ जेल का उपयोग सीएमसी zymography प्रदर्शन करना
  9. (W / v) सीएमसी एसडीएस पृष्ठ जेल में 50 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 30 मिमी सोडियम एसीटेट बफर (पीएच 4.8) में जेल incubating द्वारा refolded 0.15% का उपयोग सीएमसी zymography प्रदर्शन करना
  10. एक 0.1% का उपयोग कर 10 मिनट के लिए जेल दाग डब्ल्यू / 30 मिनट के लिए कांगो लाल समाधान और destain वी या स्पष्ट बैंड 1 एम ना का उपयोग कर मनाया जाता है जब तकसीएल. साफ इमेजिंग के लिए 0.3% (v / v) एसिटिक एसिड के साथ जेल धो लें.

TrCel5A की 6. 4-MUC गतिविधि परख

  1. 50% में 10 मिमी 4-MUC (v / v) मेथनॉल के एक शेयर समाधान तैयार है, और यह आरटी पर अंधेरे में स्टोर
  2. तुरंत पहले परख करने के लिए, एक 4 MUC 2x काम कर 1 मिमी 4-MUC से बना समाधान, और 60 मिमी सोडियम एसीटेट, पीएच 4.8 तैयार करते हैं.
  3. (Inducibly व्यक्त के साथ या TrCel5A) के बिना पत्ता प्रोटीन की 100 μl, टी. से 100 μl एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध cellulase मिश्रण युक्त नमूनों पर इस परीक्षण प्रदर्शन reesei 1:1,000, और शुद्ध एच 2 हे, क्रमशः. तीन प्रतियों में प्रत्येक नमूना चलाएँ.
  4. एक 96 अच्छी तरह से थाली की अलग कुओं में 4 MUC काम कर समाधान के पिपेट 100 μl, तो प्रत्येक नमूने के 100 μl जोड़ें.
  5. 360 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 465 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर, फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से 4 म्यू प्रतिदीप्ति 0 मिनट timepoint निर्धारित करते हैं.
  6. 20 के लिए प्लेटें सेते50 डिग्री सेल्सियस पर मिनट, वाष्पीकरण को रोकने के लिए चिपकने वाला lids के साथ कवर किया. ठंड (या μl 0.15 मीटर ग्लाइसिन, पीएच 10.0, और एक अलग प्लेट में नमूना के 100 μl 100 के संयोजन के द्वारा) द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो.
  7. 360 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 465 एनएम के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर, फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से 4 म्यू प्रतिदीप्ति के छोर को जानने के. प्रतिदीप्ति मूल्यों में परिवर्तन प्राप्त करने के लिए समापन बिंदु (20 मिनट) timepoint से 0 मिनट घटाना.

TrCel5A की 7. Azo-Carboxymethyl सेलूलोज़ गतिविधि परख

  1. 1.5% के एक शेयर की तैयारी (w / v) आरटी पर संग्रहीत है, और जो Azo-सीएमसी 18 मिमी जस्ता एसीटेट, 0.5 एम सोडियम एसीटेट, पीएच 5 और 80% इथेनॉल (वी / वी), कमरे में दुकान युक्त वर्षा समाधान तापमान.
  2. तुरंत पहले परख करने के लिए, 1% से बना एक Azo-सीएमसी 2x काम कर समाधान, (w / v) Azo-सीएमसी (एच 2 ओ में) और 60 मिमी सोडियम एसीटेट, पीएच 4.8 तैयार करते हैं.
  3. नमूना के 50 μl और काम के 50 μl जुडा1.5 मिलीलीटर ट्यूब में समाधान आईएनजी.
  4. (Transiently व्यक्त के साथ या TrCel5A) के बिना पत्ता प्रोटीन की 50 μl युक्त परीक्षण के नमूने; टी. से एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध cellulase मिश्रण के 100 μl reesei 1:1,000 पतला; और शुद्ध एच 2 ओ तीन प्रतियों में चलाने के नमूने और मानकों.
  5. 50 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए नमूने सेते वर्षा समाधान के 250 μl जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो. भंवर सख्ती 10 सेकंड के लिए प्रत्येक नमूना समाधान पूरी तरह से संयुक्त थे सुनिश्चित करने के लिए.
  6. फिर 10 मिनट के लिए और फिर भंवर के लिए आरटी पर नमूने सेते हैं. 10 मिनट के लिए 1000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र. गोली बाधित करने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए प्रत्येक नमूना सतह पर तैरनेवाला के 200 μl निकालें.
  7. 590 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर absorbance स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग परख.

TrCel5A 8. PAHBAH परख

  1. फिल्टर पेपर के एक चक्र (~ 5.5 मिमी व्यास) में कटौती करने के लिए एक छेद पंच का प्रयोग करें. 100 μl 60 मिमी एनएएसी, पीएच 4.8, और 1 जोड़ेंनमूने, (inducibly व्यक्त के साथ या TrCel5A) के बिना पत्ता प्रोटीन युक्त या एक वाणिज्यिक टी. के 00 μl reesei cellulase मिश्रण, 1:1,000 पतला, और 300 आरपीएम झटकों के साथ 50 डिग्री सेल्सियस पर 20 घंटे के लिए फिल्टर पेपर हलकों के साथ सेते हैं. फिल्टर पेपर के साथ incubated प्रत्येक नमूना के लिए, यह भी व्यक्तिगत नमूना नियंत्रण के रूप में फिल्टर पेपर के बिना डुप्लिकेट समाधान सेते हैं.
  2. आरटी पर 5 100 मिलीलीटर के समाधान के लिए कुल एचसीएल केंद्रित मिलीलीटर, और दुकान के अलावा के साथ एच 2 ओ में PAHBAH भंग करके एक 330 मिमी P-हाइड्रोक्सी benzoic एसिड hydrazide (PAHBAH) समाधान के लिए एक तैयार करें. नोट: सर्वश्रेष्ठ परिणाम एच 2 ओ के साथ 100 मिलीलीटर मात्रा लेने से पहले विघटन में मदद करने के लिए तापमान के तहत हड़कंप मच गया है जो PAHBAH घोल, यानी 30 मिलीलीटर की एक छोटी मात्रा के लिए एचसीएल जोड़कर प्राप्त कर रहे हैं
  3. आरटी पर 50 मिमी सोडियम साइट्रेट, 10 मिमी कैल्शियम क्लोराइड, और 500 मिमी NaOH और दुकान युक्त, PAHBAH समाधान बी तैयार करें.
  4. Immediately पूर्व परख करने के लिए, उपयोग करें जब तक (4 घंटा के भीतर इस्तेमाल किया जा सकता है) बर्फ पर 9 मिलीलीटर बफर समाधान, स्टोर करने के लिए 1 मिलीलीटर PAHBAH अभिकर्मक के एक 1.5x काम समाधान तैयार करते हैं.
  5. थर्मास्टाइबल 0.2 या 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में नमूने तैयार करते हैं. फिल्टर पेपर (कदम 8.1) एच 2 ओ के 45 μl और PAHBAH काम कर समाधान के 100 μl के साथ incubated प्रत्येक समाधान के 5 μl जुडा है. नमूना नियंत्रण (फिल्टर पेपर के बिना incubated नमूने) एक ही सांद्रता (5 μl नमूना, 45 μl एच 2 हे, 100 μl PAHBAH काम कर समाधान) के तहत चलाई जानी चाहिए. इसके अलावा 0 के बीच और ग्लूकोज की 0.2 ग्राम / एल युक्त 5 मानकों (5 μl), और शुद्ध एच 2 ओ परीक्षण तीन प्रतियों में चलाने के नमूने और मानकों.
  6. 100 डिग्री सेल्सियस पर ठीक 10 मिनट के लिए नमूने सेते हैं, तो वास्तव में 10 मिनट के लिए आरटी पर शांत. 410 एनएम के तरंग दैर्ध्य में एक 96 अच्छी तरह से थाली और परख spectroscopically में पिपेट समाधान. अंतिम प्राप्त करने के नमूनों से (फिल्टर पेपर के बिना incubated) व्यक्तिगत नमूना नियंत्रण घटाएँमानों.

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Representative Results

TrCel5A और TrCel5A-mCherry क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली (आंकड़े 1 ए और 1 बी) का उपयोग तंबाकू के पौधों में सफलतापूर्वक व्यक्त किया गया. TrCel5A-mCherry संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति पैटर्न की परीक्षा स्वस्थ पत्ते हरे प्रकाश (चित्रा -1) के तहत बड़े पैमाने पर प्रोटीन अभिव्यक्ति से पता चला है जो (चित्रा 1C), का पता चला.

कुल घुलनशील प्रोटीन की निकासी निहित है कि पत्ते था जो तंबाकू के पौधों पर प्रदर्शन किया गया था क्षणिक TrCel5A प्रोटीन व्यक्त की और एसडीएस पृष्ठ वर्तमान (2A चित्रा, लेन 1) थे प्रोटीन की एक बड़ी विविधता से पता चला है. पौधों और NTEPs से प्राप्त कुल घुलनशील प्रोटीन नमूना व्यक्त TrCel5A से कुल घुलनशील प्रोटीन के नमूने, 55 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए incubated रहे थे कई अन्य देशी (तम्बाकू) प्रोटीन इस तापमान पर स्थिर नहीं कर रहे हैं, जबकि TrCel5A 55 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है और सक्रिय रहता है. इस प्रकार, कई गैर essentiअल प्रोटीन TrCel5A की एक आंशिक रूप से शुद्ध किया नमूना छोड़ रहा है, इस इलाज से उपजी गया. इस थर्मल वर्षा कदम के बाद, एक मजबूत प्रोटीन बैंड ~ 40 केडीए (2A चित्रा, लेन 1) में मनाया गया. यह पौधों 4 में व्यक्त जब यह आकार में चलाने के लिए पहले से दिखाया गया है जो TrCel5A के उत्प्रेरक डोमेन (सीडी), होने की संभावना है. नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के नमूने (चित्रा 2A, गलियों में क्रमश: 3 और 4,) NTEPs (नकारात्मक नियंत्रण, चित्रा 2A, 3 लेन) और कई बैंड से टी. के एक मिश्रण का संकेत शेष थर्मो सहिष्णु तंबाकू प्रोटीन की कम मात्रा से पता चला reesei प्रोटीन (सकारात्मक नियंत्रण, चित्रा 2A, 4 लेन).

TrCel5A का आकार दोनों नियंत्रण (चित्रा 2 बी) के लिए अनुपस्थित होने के लिए देखा गया था जो TrCel5A सी टर्मिनस, में शामिल उनकी-6tag में निर्देशित एंटीबॉडी धुंधला द्वारा पुष्टि की गई. TrCel5A को प्रदर्शित किया गयासीएमसी zymography द्वारा endoglucanase गतिविधि को बनाए रखने (चित्रा -2, गलियों 1 और 2) एसडीएस पृष्ठ जेल और पश्चिमी धब्बा दाग Coomassie में के रूप में, जहां refolded प्रोटीन ही ऊंचाई पर, सीएमसी गिरावट का संकेत है, एक मजबूत मंजूरी दे दी क्षेत्र बनाया. कोई गतिविधि नहीं NTEPs (चित्रा -2, 3 लेन) से गैर cellulase प्रोटीन मिश्रण के लिए मनाया था, और टी. का मिश्रण एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में चलाने reesei प्रोटीन कई घटकों (चित्रा -2, 4 लेन) से endoglucanase गतिविधि दिखाया.

तीन assays के लिए इस्तेमाल किया गया TrCel5A की Cellulolytic गतिविधि यों. सबसे पहले, 4 MUC की गिरावट जारी कर 4 यू के (360 एनएम पर उत्साहित) 465 एनएम पर वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति उत्सर्जन देख द्वारा विश्लेषण किया गया था. टी. के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिश्रण का एक 1:1,000 कमजोर पड़ने के रूप में किया TrCel5A, 4MUC नीचा दिखाया गया था reesei cellulases (चित्रा 3).

एक quantifiable विश्लेषणसीएमसी के खिलाफ TrCel5A की गतिविधि की Azo-सीएमसी से 590 एनएम पर एक Azo डाई की रिहाई को मापने के द्वारा किया गया था. इन शर्तों के तहत TrCel5A गतिविधि (3B चित्रा) से ऊपर उल्लेख किया cellulase मिश्रण का एक 1:1,000 कमजोर पड़ने के लिए गतिविधि में बराबर था.

फिल्टर पेपर नीचा करने के लिए TrCel5A की क्षमता भी विश्लेषण किया गया था. इस परख के लिए, एक प्रारंभिक शर्करीकरण परख (यानी फिल्टर पेपर अपमानजनक TrCel5A समाधान) के साथ प्रदर्शन किया गया था और फिर सतह पर तैरनेवाला (3B चित्रा) जारी शर्करा को कम करने की मात्रा का पता लगाने के लिए PAHBAH परख द्वारा विश्लेषण किया गया था.

चित्रा 1
करने में TrCel5A निर्माणों और TrCel5A-mCherry की heterologous अभिव्यक्ति के लिए चित्रा 1. संयंत्र अभिव्यक्ति कैसेटBacco हरी बत्ती के तहत प्रतिदीप्ति द्वारा कल्पना छोड़ देता है. TrCel5A (ए) और TrCel5A-mCherry (बी) के लिए इस्तेमाल संयंत्र अभिव्यक्ति कैसेट के योजनाबद्ध अभ्यावेदन दिखाए जाते हैं. क्षणिक TrCel5A-MC अभिव्यक्ति के बाद, तम्बाकू के पत्ते (सी) या हरी बत्ती (डी) सामान्य के तहत जांच की गई. पैनल के लिए (ए) और (बी) CaMV प्रमोटर (P35SS) और टर्मिनेटर संकेत (pA35S) हल्के नीले रंग में संकेत कर रहे हैं. Chalcone synthase (सीएचएस), और His6 कोडन अनुक्रम (His6) की 5'-UTR नीले रंग में संकेत कर रहे हैं. murine mAb24 की भारी श्रृंखला से व्युत्पन्न संयंत्र कोडोन अनुकूलित नेता पेप्टाइड (LPH) हरे रंग में दिखाया गया है. LPH लाल रंग में संकेत दिया एक सी टर्मिनल KDEL संकेत, ईआर के लिए प्रोटीन अवरूद्ध, जिसके बाद apoplast को पुनः संयोजक प्रोटीन का स्राव को प्राप्त होता है. तीर CaMV 35SS अभिव्यक्ति कैसेट बढ़ाना प्राइमर के लिए बाध्यकारी साइट लेबल. पैनल (सी) और (डी) के लिए हरी बत्ती एक उत्तेजना 515 एनएम था.छवियाँ बढ़ाई बिना लिया गया था.

चित्रा 2
. चित्रा 2 आकार और एसडीएस पृष्ठ, पश्चिमी सोख्ता, और सीएमसी zymography द्वारा दिखाया TrCel5A की गतिविधि कुल घुलनशील प्रोटीन का पृथक्करण:. TrCel5A transiently से पहले व्यक्त की गई थी, जहां तंबाकू के पौधों से (1) और (2) थर्मल तेज़ी शोधन के बाद; TrCel5A भी थर्मल वर्षा के बाद, मौजूद नहीं था, जहां तंबाकू के पौधों से (3); या टी. के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिश्रण की reesei cellulases (4). एसडीएस पृष्ठ अलग हो प्रोटीन Coomassie ब्लू धुंधला (ए), TrCel5A (बी) के उनके टैग क्षेत्र के खिलाफ पश्चिमी सोख्ता, और सीएमसी का उपयोग zymography द्वारा दिखाया cellulase गतिविधि के साथ कल्पना कर रहे हैं कांगो लाल (सी) का उपयोग कल्पना. PageRuler प्लस(Fermentas) आणविक वजन मार्कर (एम) के रूप में इस्तेमाल किया गया था.

चित्रा 3
चित्रा 3. TrCel5A. TrCel5A एंजाइम गतिविधि मात्रा का ठहराव, 4 MUC (ए), Azo-सीएमसी (बी), और फिल्टर पेपर (सी) और फ्लोरोफोरे 4-चिंटू (ए) की रिहाई के द्वारा मापा सब्सट्रेट गिरावट के साथ incubated था एक Azo डाई (बी), या PAHBAH (सी) का रंग बदलने की निगरानी के द्वारा शर्करा को कम करने बढ़ाता द्वारा. प्रत्येक परख तीन प्रतिकृति के लिए परिणाम से पता चलता है. त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का संकेत मिलता है. सभी तीन assays में विश्लेषण के नमूने, अकेले TrCel5A बफर थे थर्मल तेज़ी शोधन के बाद, NTEP (गुम्मट NT) थर्मल तेज़ी शोधन, और टी. के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिश्रण के बाद reesei cellulases.

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Discussion

Cellulases के संयोजक अभिव्यक्ति के कारण अधिक कुशल जैव ईंधन उत्पादन प्रणाली 1 के लिए इच्छा के लिए, बहुत रुचि का एक क्षेत्र है. पौधे इस तरह के आर्थिक संचयन तकनीक और बड़े पैमाने पर जैव ईंधन के उत्पादन के लिए बहुत वांछनीय गुण जा रहा autohydrolysis तरीके के रूप में सुविधाओं के साथ, सफल cellulase उत्पादन के लिए कई संभावनाएं हैं. इसके अलावा, प्रोटीन के उत्पादन के लिए विभिन्न localizations का उपयोग करते हैं, यदि आवश्यक हो, posttranslational संशोधनों 20 अनुमति देते हैं. स्पष्ट लाभ की पेशकश की है, जबकि cellulases के विधान अभिव्यक्ति सक्षम करने के लिए पौधों फेरबदल, या सफल नहीं हो सकता है जो एक समय लेने वाली पद्धति है. इस तरह व्यक्त प्रोटीन और inducible अभिव्यक्ति तंत्र की ज़ब्ती के रूप में तकनीक पौधों में सफल cellulase उत्पादन की संभावना में वृद्धि, हालांकि ये अभी भी स्थापित करने के लिए कई महीने लगेंगे. इधर, क्षणिक अभिव्यक्ति के तरीकों एक विशिष्ट cellulase के लिए संभावित उदाहरण देकर स्पष्ट करना, प्रदर्शन कर रहे हैंदिन के एक मामले में संयंत्र प्रणालियों के माध्यम से उत्पादन किया जाना है.

फ्लोरोसेंट प्रोटीन mCherry साथ एक संलयन क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के तरीकों की सफलता का प्रदर्शन करने के लिए यहां इस्तेमाल किया गया था. TrCel5A-mCherry स्पष्ट रूप से वेक्टर युक्त Agrobacteria साथ घुसपैठ कर दिया गया था, जो पत्तियों के बहुमत भर में वितरित किया गया. जालिका स्थानीयकरण व्यक्त प्रोटीन की posttranslational संशोधनों सक्षम बनाता है. जैसे ग्लाइकोसिलेशन सक्षम करने के लिए एक अभिव्यक्ति प्रणाली की क्षमता टी. की तरह मूल रूप से कवक जीवों से निकाली गई है जो उन cellulases, के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है reesei 21. Heterologous cellulase अभिव्यक्ति के लिए तेजी से लोकप्रिय हैं जो खमीर अभिव्यक्ति प्रणाली, अक्सर पूरी cellulase गतिविधि 22 के लिए एक संभावित बाधा होने की बहस है जो एंजाइम की अति ग्लाइकोसिलेशन में परिणाम. प्लांट ग्लाइकोसिलेशन तंत्र एकअति ग्लाइकोसिलेशन का दोष यह है कि बिना कर रहे हैं. साथ ही, संयंत्र प्रणालियों में अभिव्यक्ति इस प्रकार के प्रोटीन के स्रोत को सिलाई, सक्रिय करने की अनुमति है या posttranslational संशोधन की अनुमति नहीं है जो क्षेत्रों के स्थानीयकरण के लिए अनुमति देता है. यहाँ का प्रदर्शन प्रणाली भी apoplast, क्लोरोप्लास्ट, cytosol या Golgi पुटिका स्थानीयकरण के लिए, विभिन्न संकेत दृश्यों 14 के आवेदन के द्वारा प्रयोग किया जा सकता है. ऐसे TrCel5A-mCherry के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन fusions, का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति की सफलता के साथ ही प्रोटीन का स्थानीयकरण प्रदर्शित कर सकते हैं. हालांकि, इस तरह conjugates आगे गतिविधि परीक्षण के लिए आवश्यक नहीं हैं. इस प्रकार यह यहाँ दिखाया गया था के रूप में एक गैर mCherry TrCel5A निर्माण व्यक्त cellulase की अधिक सटीक गतिविधि डेटा प्राप्त करने के लिए, सभी आगे परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सिफारिश की है. आगे के प्रयोगों के लिए नियंत्रण के बारे में, गैर क्षणिक घुसपैठ पौधों से नमूने आमतौर पर पर्याप्त नियंत्रण होने के लिए देखा जाता है.

5 में TrCel5A प्रोटीन अभिव्यक्ति के पिछले निष्कर्षों के साथ लाइन में है. सीएमसी के खिलाफ गतिविधि के zymography विश्लेषण शेष पेप्टाइड एक endoglucanase के रूप में सक्रिय था कि संकेत दिया. एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता बेहद आम assays हैं, सीएमसी zymography एक अधिक विशिष्ट cellulase के लिए परीक्षण (और विशेष रूप से endoglucanase) गतिविधि है. सफल zymography परिणाम के लिए मन में रखने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कारक हैं एक) सब्सट्रेट (इस मामले में सीएमसी) पूरी तरह से solubilized होना चाहिए और जेल भर में समान रूप से फैला है कि; ख) प्रोटीन सफलतापूर्वक जेल के माध्यम से प्रोटीन प्रसार की राशि की सीमा अधिमानतः एक छोटी सी अवधि में, refolded होने की जरूरत है; और ग) किगतिविधि परख (50 और 60 डिग्री सेल्सियस के बीच TrCel5A के लिए) assayed किया जा रहा एंजाइम के लिए इष्टतम तापमान पर होना चाहिए और गिरावट की तेज बैंड सक्षम करने के लिए संक्षिप्त होना चाहिए.

व्यक्त TrCel5A की cellulase गतिविधि के मात्रात्मक विश्लेषण एंजाइम 4-MUC, सीएमसी और फिल्टर पेपर सहित substrates की एक सीमा है, के खिलाफ सक्रिय था कि प्रदर्शन किया. Substrates के प्रत्येक या तो एक fluorophore (4 यू) के माध्यम से या एक रंग की प्रतिक्रिया (AZO डाई या PAHBAH) के प्रकाश बिखराव विश्लेषण करके, एक अलग स्पेक्ट्रोस्कोपी परीक्षण का उपयोग कर जांच की गई थी. सभी तीन substrates और assays व्यापक रूप cellulase गतिविधि के मूल्यांकन के लिए प्रयोग किया जाता है, और अपेक्षाकृत सीधे आगे assays हैं. 4 MUC इन एंजाइमों (endoglucanases, exoglucanases और β-glucosidases) की एक विस्तृत विविधता के रूप में इसके खिलाफ सक्रिय हैं, glycosyl hydrolase गतिविधि निर्धारित करने के लिए एक बुनियादी सब्सट्रेट के रूप में प्रयोग किया जाता है. परख की गति, आवश्यकताओं की सीमित संख्या, उच्च संवेदनशीलताऔर सब्सट्रेट फोड़ना करने के लिए कई cellulases की क्षमता, इस cellulases के लिए, या एक अभिव्यक्ति रन की सफलता की जांच के लिए सामान्य जांच के लिए एक उपयोगी परख करता है. 4 MUC का उपयोग करते समय मन में रखने के लिए एक बिंदु इस सब्सट्रेट (जैसे TrCel5A के रूप में) endoglucanases की गतिविधि बनाने, β-glucosidases की गतिविधि के लिए विशेष रूप से अनुकूल है या exoglucanases या एंजाइम मिश्रण-glucosidases β की तुलना में कमजोर दिखाई देते हैं जो β-glucosidases होते हैं. एक कम प्रोटीन सांद्रता के साथ 4 MUC परख या अन्यथा कम गतिविधि का स्तर जब प्रदर्शन कर यह पीएच परिवर्तन 4-चिंटू के प्रतिदीप्ति बढ़ाता है, के रूप में एक स्थान पर समाधान के रूप में ग्लाइसिन (पीएच 10) के अलावा के उपयोग की सिफारिश की है. यह केवल endoglucanases द्वारा अपमानित किया जाता है के रूप में सीएमसी, यहाँ व्यक्त एंजाइम के लिए एक अधिक विशिष्ट सब्सट्रेट है. Azo-सीएमसी परख के कारण जिंक द्वारा सेलूलोज (और मेथनॉल) की वर्षा के लिए जरूरत के लिए, 4 MUC के लिए एक से अधिक जटिल है. प्रमुख इस सब्सट्रेट के लाभ, और इस तरह परख, यह उत्पादन किया जा रहा cellulase की प्रकृति की स्थापना के लिए यह बहुत उपयोगी है, जिससे endoglucanase गतिविधि के लिए विशिष्ट है कि है. फिल्टर पेपर गिरावट cellulase गतिविधि की स्थापना के लिए एक अन्य आम परीक्षण है. मनाया गिरावट की राशि का आकलन किया जा रहा है cellulase के गुणों पर काफी निर्भर बदलता है, और यह एंजाइम मिश्रण की गतिविधि की जांच के लिए एक पसंदीदा सब्सट्रेट है. फिल्टर पेपर गिरावट की जांच के लिए यहां इस्तेमाल PAHBAH परख,, शर्करीकरण के बाद जारी शर्करा की मात्रा को पहचानता है और इसलिए भी सीएमसी, lichenan, β-glucan, α-सेल्यूलोज, AVICEL सहित, यहाँ का प्रदर्शन नहीं मॉडल substrates की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू है , xylan और xyloglucan. नमूने का आकलन किया जा रहा है के रूप में ऊष्मायन के समय में बदलाव परिणामों में अंतर पैदा कर सकते हैं के रूप में इस परख के लिए, देखभाल, एक ही थाली (या एक ही समय में) पर मानकों में शामिल करने के लिए लिया जाना चाहिए. यह सटीकता सुनिश्चित करने के लिए परख दोहराने के लिए भी इस प्रकार महत्वपूर्ण है. के अतिरिक्तनमूना PAHBAH से पहचाना जा सकता है जो नमूने में स्वाभाविक रूप से मौजूद किसी भी कम करने शर्करा के लिए नियंत्रित करने के लिए, सेल्यूलोज सब्सट्रेट बिना incubated है, और नहीं तो झूठी सकारात्मक परिणाम देना होगा जहां, एक नमूना नियंत्रण हमेशा चलाया जाना चाहिए.

अंत में, एक पुनः संयोजक cellulase के क्षणिक अभिव्यक्ति और लक्षण वर्णन के लिए तरीकों स्पष्ट रूप से प्रदर्शन कर रहे हैं. इन तकनीकों का प्रदर्शन यहां उन लोगों की तरह गतिविधि परीक्षण का उपयोग कर, एक या अधिक cellulases की आगे की जांच के लिए प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में उत्पन्न करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करते हैं. विशेष रूप से, इन तरीकों Planta उत्पादन में लिए नामित cellulases की क्षमता की जांच के लिए एक तेज तरीका प्रदान करते हैं.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम BMBF Forschungsinitiative द्वारा समर्थित किया गया था "BIOENERGIE 2021 - Forschung फर Nutzung वॉन Biomasse मरने" और विज्ञान को बढ़ावा देने के लिए जर्मन संघीय और राज्य सरकारों द्वारा उत्कृष्टता पहल के माध्यम से वित्त पोषित है जो उत्कृष्टता "बायोमास से दर्जी ईंधन", के क्लस्टर और जर्मन विश्वविद्यालयों में अनुसंधान.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside SIGMA-ALDRICH M6018
Acetic acid ROTH 3738
Acetosyringon (concentrated) ROTH 6003
Antibiotic - kanamycin ROTH T832
Antibiotic - rifampicin ROTH 4163
Antibiotic - carbenicillin ROTH 6344
Antibody - rabbit anti His(6) pAb ROCKLAND 600-401-382
Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb DIANOVA 111-055-008
Azo-carboxymethyl cellulose MEGAZYME S-ACMC
β-cyclodextrin SIGMA-ALDRICH C4805
Calcium chloride dihydrate SIGMA-ALDRICH C5080
Carboxymethyl cellulose ROTH 3333.1
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 SIGMA-ALDRICH C2730
Congo red SIGMA-ALDRICH 75768
Coomasie brilliant blue G 250 ROTH 9598.2
D(+)-glucose ROTH 8337
Ethanol ROTH K928
Filter paper - Rotilabo blotting paper ROTH CL67
NBT/BCIP SIGMA-ALDRICH 72091
MES buffer ROTH 4256
Methanol ROTH 8388
Sodium citrate ROTH 3580
Sodium dodecylsulfate SERVA 20765
Sodium hydroxide ROTH 6771
Soil, Einheitserde classic  PATZER GMBH
Spectrometer - Infinite M200 TECAN
Sucrose SIGMA-ALDRICH S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide  SIGMA-ALDRICH H9882
Phosphate buffered saline ROTH 1058
UV light source - BLAK RAY UVP
Vibratome - VT1000S Leica

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक 88 heterologous अभिव्यक्ति जालिका endoglucanase सेल्यूलोज glycosyl-hydrolase प्रतिदीप्ति Cellulase, तम्बाकू पौधों
संयोजक Cellulase Cel5A की अभिव्यक्ति से<em&gt; ट्राइकोडर्मा reesei</em&gt; तम्बाकू पौधों में
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Garvey, M., Klinger, J., Klose, H., Fischer, R., Commandeur, U. Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants. J. Vis. Exp. (88), e51711, doi:10.3791/51711 (2014).

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