Summary
واستخدمت نباتات التبغ لإنتاج سلولاز الفطرية، TrCel5A، عبر نظام التعبير عابر. ويمكن رصد التعبير باستخدام انصهار بروتين الفلورسنت، واتسم نشاط البروتين التعبير آخر.
Abstract
الانزيمات المهينة السليلوز، السليلوزات، هي أهداف كل من البحث والمصالح الصناعية. كثرة هذه الإنزيمات في إلى ثقافة الصعب الكائنات الحية، مثل الفطريات بناء خيوط والبكتيريا اللاهوائية، وقد سارعت استخدام التكنولوجيات المؤتلف في هذا المجال. طرق التعبير النباتية هي نظام مرغوب فيه لإنتاج على نطاق واسع من الإنزيمات وغيرها من البروتينات مفيدة صناعيا. هنا، وأظهرت وسائل للتعبير عابر لendoglucanase الفطرية، الترايكوديرما reesei Cel5A، في نيكوتيانا تبغ. ويرد ناجحة التعبير البروتين، ومراقبتها من قبل مضان باستخدام انصهار بروتين mCherry انزيم. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام مجموعة من الاختبارات الأساسية لدراسة نشاط T. أعرب عابر reesei Cel5A، بما في ذلك SDS-PAGE، النشاف الغربية، zymography، فضلا عن مضان والركيزة المقايسات تدهور قائم على الأصباغ. النظام المذكور هنا يمكن أن تستخدم لإنتاج الخلية النشطةulase في فترة زمنية قصيرة، وذلك لتقييم إمكانية زيادة الإنتاج في النباتات من خلال نظم التعبير التأسيسية أو محرض.
Introduction
وقد تصور تدهور الكتلة الحيوية اللجنوسليلوزية وتحولها إلى وقود سائل كوسيلة للحد من الاعتماد على الوقود الأحفوري. واحد عقبة كبيرة في إنشاء نظم معالجة الكتلة الحيوية غير مجدية اقتصاديا في تدهور الأنزيمية من السليلوز وهيميسيلولوز 1. تظهر أنظمة التعبير النبات إمكانات كبيرة لإنتاج الإنزيمات على نطاق صناعي. يتم تأسيس نظم الزراعية للنباتات الحصاد واقتصاديا في حجم بالفعل، كما كانت منذ آلاف السنين. إنتاج السليلوزات في النباتات غير المرغوب فيه بسبب عوامل مثل سهولة حلمهة ذاتية 2، وإمكانية تعظيم الاستفادة من انخفاض مستويات إنزيم عن طريق زيادة هضم جدران الخلايا النباتية 1. أخيرا، مصنع أنظمة تسمح استهداف البروتينات المؤتلف لمجالات محددة من الخلايا النباتية وقادرون على تعديل posttranslationally الانزيمات حيث المطلوبة 3.
ve_content ">يستخدم تبغ النيكوتين (التبغ) الشائع جدا باعتباره النموذج الحي للدراسات بروتين تعبير مغاير في النباتات، ويرجع ذلك إلى النمو والكتلة الحيوية معالمه السريع تراكم 4. التعبير عابرة من البروتينات المؤتلف هو الأسلوب الذي يتيح إنتاج البروتين في فترات زمنية قصيرة 5، مع الحفاظ على المرونة لتوطين وبالتالي تعديلات ما بعد النقل من البروتينات المحددة، أي السليلوزات. وهذا يتيح إنتاج سلولاز (ق) للتحليل الأساسي، في حين وضع أيضا الأساس لمزيد من استراتيجيات التعبير في النباتات. باستخدام هذه الاستراتيجية التعبير عابرة، يتم إنتاج endoglucanase من غليكوزيل هيدرولاز العائلة 5، Cel5A، والمستمدة من المضيف الفطرية الترايكوديرما reesei (Hypocrea jecorina) 6 (المشار إليها فيما يلي باسم TrCel5A). TrCel5A هو 42 كيلو دالتون البروتين الذي الغليكوزيلاتي أصلا وغير نشطة للغاية في HYDroylzing سلاسل السليلوز 7.
ويستند أسلوب التعبير عابرة الموصوفة هنا على نظام نسبيا استخداما، التسلل يترك المصنع مع Agrobacteria تحمل الجينات في المصالح في ناقلات التعبير المناسب. للسماح للتحليل السريع للنجاح في بلانتا التعبير، TrCel5A يمكن أيضا التعبير عن بروتين الانصهار مع mCherry، وهو بروتين فلوري أحادى المستمدة أصلا من Discosoma س. بروتين DsRed 8، إضافة إلى ستة بقايا الحامض الأميني (صاحب العلامة) لتنصهر وC-محطة (TrCel5A-mCherry). وهكذا يمكن رصد تعبير عن انصهار بروتين مغاير، TrCel5A-mCherry، في النباتات التي تنمو باستخدام الضوء الأخضر لدراسة mCherry تشتت. إذا رغبت في ذلك، أقسام رقيقة من المواد النباتية يمكن فحصها تحت المجهر الضوء الأخضر لإقامة توطين محددة من البروتين. لهذا العمل، وإشارة وترانوأدرجت الجلوس الببتيدات في بناء، في توطين تصدير البروتين مغاير للشبكية هيولي باطني 9.
لتحليل نشاط السليلوزات أعرب النباتية، بما في ذلك TrCel5A، يمكن تشغيل عدد من الاختبارات النشاط سلولاز. بعد استخراج من مجموع البروتينات النباتية القابلة للذوبان، TrCel5A يمكن تنقيته جزئيا باستخدام تقنية الحضانة الحرارية. تم تأسيس حجم البروتين باستخدام SDS-PAGE تليها النشاف الغربية. Zymography يمكن استخدامها لتحليل نشاط ضد ركائز، مثل السليلوز الذي كان كربوكسي ميثليته (صنع السليلوز carboxymethyl: CMC) للالذوبان 10. سلولاز وجلوكوزيد النشاط يمكن رصدها باستخدام fluorophore 4-ميثيل مبيليفيريل (4-MU) المرتبطة β-D-cellobioside (مجتمعة: 4-MUC). طريقة أخرى لتقييم النشاط endoglucanase ينطوي على التحليل الطيفي للCMC الذي ارتبط مع الآزو دانتم (Remazolbrilliant الأزرق R) 11. بالإضافة إلى ذلك، كل من نشاط البروتين endoglucanases ومجموعة من السليلوزات يمكن رصدها عن طريق استخدام اختبار تحليل السكر، مثل هيدرازيد ف هيدروكسي البنزويك حمض (PAHBAH) مقايسة 12. هذه التقنيات يمكن استخدامها لتوضيح وتحديد نشاط سلولاز أعرب المصالح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. النمو البرية نوع N. تبغ النباتات
- أن ينمو N. تبغ L. السيرة الذاتية. النباتات بيتي هافانا SR1 على التربة ووضع البذور التبغ على الأواني المناسبة مليئة تربة طبيعية للإنبات. 2 بعد أسابيع، ونقل الشتلات إلى الأواني الفردية. احتضان النباتات في الدفيئة مع ثابتة 22 درجة مئوية (الفترة المظلمة) أو 25 درجة مئوية (الفترة ضوء) و 70٪ رطوبة الهواء النسبية. توفير الإضاءة في 16/8 ساعة ضوء / دورة الظلام (مثل فيليبس مصابيح IP65 400 واط؛ 180 ميكرومول · · م -1 ثانية -2؛ λ = 400-700 نانومتر) والماء يوميا.
2. التعبير عابر من TrCel5A وTrCel5A-mCherry البروتينات
- تحت ظروف معقمة، واختيار واحدة من المستعمرات المورمة Agarobacterium (GV3101 :: pMP90RK تقرير الرصد العالمي، KMR، RifR) التي تحتوي إما pTRAkc-ER-TrCel5A أو pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry ونقل إلى دورق مخروطي يحتوي على 10 مل خلاصة الخميرةمرق (YEB، الذي أعد وفقا للمواصفات المصنعين) المتوسطة والكانامايسين (50 ملغ / مل)، ريفامبيسين (50 ملغ / مل)، وكربنيسيلين (100 ملغ / مل) للاختيار. احتضان لمدة 36-40 ساعة عند 26 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. ملاحظة: تصميم بنيات ملائمة للتعبير البروتين هو خارج نطاق هذه الورقة، ولكن للإرشاد، وأساليب ماكلين وآخرون 13 ومونرو وPellham 14 يمكن اتباعها لتصميم بناء.
- تأخذ 200 ميكرولتر من كل ثقافة لتطعيم 20 مل من YEB مع تركيزات المضادات الحيوية المذكورة أعلاه واحتضان تحت نفس الظروف كما كان من قبل.
- بعد 36-40 ساعة، preinduce الثقافات عن طريق إضافة 2 ميكرولتر acetosyringon (200 ميكرومتر تركيز النهائي)، و 100 ميكرولتر 40٪ (ث / ت) محلول الجلوكوز و 200 ميكرولتر من 1 M MES العازلة درجة الحموضة 5.6. احتضان بين عشية وضحاها.
- إعداد 100 مل من العازلة 2X تسلل (100 جرام / لتر سكروز، 3.6 جم / L الجلوكوز، 8.6 غرام / لتر Murashige وسكوغ أملاح القاعدية، وضبط درجة الحموضة إلى 5.6 باستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم).
- قياس OD 600 من الثقافات مع التخفيفات 01:05 حتى يصل إلى OD 600 من 5-6. حساب حجم الثقافة اللازمة ل30 مل تسلل المتوسطة في OD 600. إضافة 15 مل من 2X العازلة تسلل، ثم إضافة H 2 O منزوع الأيونات لجعل عازلة تصل إلى 30 مل.
- تأخذ النباتات من الاحتباس الحراري واستخدام غيض ماصة إلى نيك الجانب مجافي المحور الثالث من 3 إلى 5 عشر ورقة من أعلى لتخفيف التسلل.
- استخدام غيض ماصة إلى نيك الجانب مجافي المحور من الأوراق لتخفيف التسلل.
- ملء المحاقن مع تسلل المتوسطة ووضعها (بدون إبرة) على واحدة من النكات التي سبق. دعم المحاقن مع الاصبع على الجانب متجه نحو المحور ورقة. اضغط المتوسطة بعناية في الأنسجة مناطق رقة في interveinal. ملاحظة: بعد تسلل، وزراعة النباتات في الدفيئة في ظل نفس الظروف كما هو موضح أعلاه. أيضا، الحفاظ على نسبة متساوية من untrعتيد، والنباتات غير عابرة التعبير (NTEPs) والضوابط، في ظل نفس الظروف والنباتات تسلل.
3. تقييم TrCel5A-mCherry التعبير في أوراق النبات
- بعد 4-6 أيام، واتخاذ النباتات تسللت مع أ. المورمة تحتوي على pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry من الاحتباس الحراري ووضعها في غرفة مظلمة لتحليل مضان.
- لتصور مضان في أقسام ورقة التعبير عن TrCel5A-mCherry والنباتات ضوء باستخدام مصدر ضوء المحمولة التي ينبعث منها ضوء أخضر في 515 نانومتر مع فلتر الحمراء (620-750 نانومتر). ملاحظة: في عمق يمكن أن يتحقق توصيف التعبير البروتين في أوراق النبات بواسطة إجازات باجتزاء رقيقة مع vibratome والفحص تحت ضوء ومضان المجهري. لهذا اتبع الخطوات التالية:
- قطع أجزاء صغيرة من حوالي 5 × 5 مم حجم من أوراق تسلل وتضمينها في 4٪ المنحل الاغاروز في 50 ملي العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 5.7).
- قطعقسم من 80-90 حجم ميكرون من أوراق جزءا لا يتجزأ باستخدام vibratome. وضعها على شريحة المجهر، وتغطي مع العازلة أو زلة الغطاء ودراستها باستخدام المجهر في التكبير 10X مع كاشف مضان، وذلك باستخدام نفس الطول الموجي وتصفية ذكر أعلاه.
4. TrCel5A استخراج من أوراق التبغ
- قطع قطعة من يترك التبغ إلى الوزن التقريبي من 1 غرام من النباتات المصابة مع أ. المورمة تحتوي على pTRAkc-ER-TrCel5A ومكان في بمدافع الهاون precooled مع النيتروجين السائل. إضافة كمية مناسبة من النيتروجين السائل للعينات. طحن يترك لمسحوق باستخدام مدقة precooled.
- إضافة 2 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 1 ملم phenylmethylsulfonyl الفلورايد إلى هذه المسألة ورقة الأرض وتخلط حتى غالبية المسألة ورقة في التعليق. استخراج الطرد المركزي في 15،000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية، واتخاذ طاف التي تحتوي على البروتين.
- CentriFUGE استخراج في 15،000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية، واتخاذ طاف التي تحتوي على البروتين والحرص على عدم تعطيل بيليه. تجاهل بيليه.
- تنقية جزئيا TrCel5A التي يحتضنها طاف التي تحتوي على البروتين عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. السماح للراحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة أخرى، ثم الطرد المركزي في 15،000 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. تكرار عملية تنقية جزئية لمحطات غير تسلل للحصول على عينات السيطرة. استخدام هذه العينات لجميع التجارب التالية. ملاحظة: يمكن تخزين حلول البروتين في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع أو في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
- تكرار عملية تنقية جزئية لمحطات غير تسلل للحصول على عينات السيطرة. استخدام هذه العينات لجميع التجارب التالية. ملاحظة: يمكن تخزين حلول البروتين في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع أو في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
5. SDS-PAGE، الغربية التنشيف، ونيتروجينية-CMC Zymography من TrCel5A-mCherry </ ع>
- شراء أو إعداد 12٪ (ث / ت) المواد الهلامية SDS-PAGE وفقا لأساليب تأسيس 15.
- تذوب في الماء CMC للحصول على 1.5٪ (ث / ت) الحل. لجعل المواد الهلامية CMC-SDS-PAGE، بديلا 1 مل من 1.5٪ CMC ل1 مل من الماء في محلول 10 مل SDS-PAGE مزيج هلام، مما أدى إلى 0.1٪ (ث / ت) CMC + 12٪ (ث / ت ) SDS-PAGE مزيج هلام. صب جل طبيعي. ملاحظة: تأكد أن CMC في الحل الأصلي يذوب تماما من قبل مجموعة من التحريك والتسخين إلى 40 ° C (اكرر مباشرة قبل إعداد الحل هلام).
- تفسد عينات من الغليان في وجود SDS، وفقا لطرق أنشئت 12. كعنصر تحكم إيجابية، واستخدام 1:500 التخفيف من خليط سلولاز المتاحة تجاريا من T. reesei، مثل T. reesei آي تي سي سي 26921. كعنصر تحكم السلبية استخدام حل البروتين أعدت بالمثل من الأوراق غير اخترقتها (NTEPs).
- تنفيذ الكهربائي وفقا لبروتوكولات العادية 15،على سبيل المثال استخدام 200 V ل~ 50 دقيقة مع توقف الكهربائي مرة واحدة وصلت الجبهة صبغ الجزء السفلي من هلام.
- وصمة عار واحد هلام SDS-PAGE باستخدام 0.1٪ (ث / ت) Coomassie الأزرق اللامع ويزيل اللون باستخدام الميثانول / حامض الخليك الجليدية الخليط. ملاحظة: تلطيخ السريع وdestaining يمكن القيام بها عن طريق تسخين بلطف وتلطيخ destaining الحلول، أي باستخدام الميكروويف لمدة 15 ثانية ~ لتسخين (ولكن لا تغلي) أولا ثم تلطيخ الحلول destaining، وتغيير الحل destaining بعد 10 دقيقة ، أو عندما تبرد، وكرر مع حل destaining جديدة.
- أداء النشاف الغربية واحد هلام SDS-PAGE باستخدام بروتوكولات تأسيس 16،17. استخدام الأجسام المضادة التالية: أ الضد الأرنب بولكلونل ضد صاحب العلامة (الابتدائي) والماعز المضادة للأرنب بولكلونل الأجسام المضادة المنطقة التيسير التي تم مترافق إلى الفوسفاتيز القلوية (الثانوي). ملاحظة: يجب أن يتم تحديد الأجسام المضادة الثانوية لتمكين التصور باستخدام تترازوليوم tetrazolالبوتاسيوم chloride/5-bromo-4-chloro-3 'indolyphosphate ف طولويدين الملح (NBT / BCIP)، كما هو موضح 18.
- أداء البروتين في جل طوي ثانية على 0.15٪ (ث / ت) هلام CMC SDS-PAGE التي يحتضنها الجل في 1.5٪ (ث / ت) β-cyclodextrin، 20 ملي فوسفات سترات العازلة، ودرجة الحموضة 6.5، في درجة حرارة الغرفة مع لطيف تهتز لمدة 15 دقيقة 19.
- تجاهل حل β cyclodextrin وتغسل لفترة وجيزة الجل مع H 2 O. احتضان عند RT في 50MM الصوديوم العازلة خلات (الرقم الهيدروجيني 4.8) لمدة 15 دقيقة أخرى. أداء CMC zymography باستخدام refolded 0.15٪ CMC SDS-PAGE هلام التي يحتضنها الجل في 30 ملي خلات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 4.8 لمدة 20 دقيقة عند 50 درجة مئوية.
- أداء CMC zymography باستخدام refolded 0.15٪ (ث / ت) هلام CMC SDS-PAGE التي يحتضنها الجل في 30 ملي خلات الصوديوم العازلة (درجة الحموضة 4.8) لمدة 20 دقيقة عند 50 درجة مئوية.
- وصمة عار الجل لمدة 10 دقيقة باستخدام 0.1٪ ث / ت الكونغو حل يزيل اللون الأحمر ولمدة 30 دقيقة أو حتى يتم احظت فرق واضح باستخدام 1 M ناالبنود. غسل هلام مع 0.3٪ (ت / ت) وحامض الخليك لتصوير أكثر وضوحا.
6. 4 MUC آخر الفحص من TrCel5A
- إعداد محلول المخزون من 10 ملي 4 MUC في 50٪ (ت / ت) والميثانول، وتخزينه في الظلام في RT
- مباشرة قبل الفحص، يعد الحل العمل 4-MUC 2X، ويتألف من 1 ملم 4-MUC و 60 ملي خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.8.
- تنفيذ هذا الاختبار على عينات تحتوي على 100 ميكرولتر من البروتين ورقة (مع أو بدون TrCel5A أعرب inducibly)، و 100 ميكرولتر مزيج سلولاز المتاحة تجاريا من T. 1:1،000 reesei، وH 2 O نقية، على التوالي. تشغيل كل عينة في ثلاث نسخ.
- ماصة 100 ميكرولتر من الحل العمل 4-MUC في آبار منفصلة من لوحة 96 جيدا، ثم يضاف 100 ميكرولتر من كل عينة.
- تحديد 0 دقيقة timepoint من 4-MU مضان من خلال التحليل الطيفي الفلورسنت، وذلك باستخدام الطول الموجي الإثارة من 360 نانومتر والطول الموجي من 465 نانومتر الانبعاثات.
- احتضان لوحات لمدة 20دقيقة عند 50 درجة مئوية، مع تغطية الجفون لاصقة لمنع التبخر. وقف رد الفعل من خلال تجميد (أو عن طريق الجمع بين 100 ميكرولتر 0.15 M الجلايسين، ودرجة الحموضة 10.0، و 100 ميكرولتر من العينة في لوحة منفصلة).
- تحديد نقطة النهاية من 4-MU مضان من خلال التحليل الطيفي الفلورسنت، وذلك باستخدام الطول الموجي الإثارة من 360 نانومتر والطول الموجي من 465 نانومتر الانبعاثات. طرح 0 دقيقة من نقطة النهاية (20 دقيقة) timepoint للحصول على تغيير في القيم مضان.
7. نيتروجينية-كاربوكسيميثيل السليلوز آخر الفحص من TrCel5A
- إعداد مخزون من 1.5٪ (ث / ت) نيتروجينية-CMC التي يتم تخزينها في RT، وهطول محلول يحتوي على 18 ملي خلات الزنك، 0.5 M خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5 و 80٪ من الإيثانول (ت / ت)، وتخزين في غرفة درجة الحرارة.
- مباشرة قبل الفحص، يعد الحل نيتروجينية-CMC 2X العمل، ويتألف من 1٪ (ث / ت) نيتروجينية-CMC (في H 2 O) و 60 ملي خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.8.
- الجمع بين 50 ميكرولتر من عينة و 50 ميكرولتر من العملالحل جي في 1.5 مل أنابيب.
- عينات الاختبار التي تحتوي على 50 ميكرولتر من البروتين ورقة (مع أو بدون TrCel5A أعرب عابر)؛ 100 ميكرولتر من خليط سلولاز المتاحة تجاريا من T. reesei المخفف 1:1،000؛ ونقية H 2 O. عينات والمعايير تعمل في ثلاث نسخ.
- احتضان العينات لمدة 20 دقيقة عند 50 درجة مئوية. وقف رد الفعل من خلال إضافة 250 ميكرولتر من هطول الحل. دوامة كل عينة بقوة لمدة 10 ثانية لضمان الحلول مجتمعة تماما.
- احتضان العينات في RT لمدة 10 دقيقة ثم الدوامة مرة أخرى. عينات الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة 200 ميكرولتر من كل عينة طاف لوحة 96 جيدا، مع الحرص على عدم تعطيل بيليه.
- الفحص باستخدام التحليل الطيفي الامتصاصية في الطول الموجي من 590 نانومتر.
8. PAHBAH الفحص من TrCel5A
- استخدام حفرة لكمة لقطع دائرة (~ 5.5 مم) من ورق الترشيح. إضافة 100 ميكرولتر 60 ملي NAAC، ودرجة الحموضة 4.8، و 100 ميكرولتر من العينات، إما تحتوي على البروتين ورقة (مع أو بدون TrCel5A أعرب inducibly) أو T. التجارية reesei خليط سلولاز، المخفف 1:1،000، واحتضان مع مرشح الدوائر ورقة لمدة 20 ساعة عند 50 درجة مئوية مع 300 دورة في الدقيقة تهتز. لكل عينة حضنت مع ورق الترشيح، وأيضا احتضان حل مكررة دون ورق الترشيح كما فردية عينة الضوابط.
- إعداد 330 ملي ف هيدروكسي هيدرازيد حمض البنزويك (PAHBAH) حل A عن طريق إذابة PAHBAH في H 2 O مع إضافة 5 مل حمض الهيدروكلوريك تتركز لما مجموعه 100 مل الحل، وتخزينها في RT. ملاحظة: يتم تحقيق أفضل النتائج عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك إلى وحدة تخزين أصغر من PAHBAH الطين، أي 30 مل، والذي يحرك تحت درجة حرارة للمساعدة في حل قبل اتخاذ هذا الحجم إلى 100 مل مع H 2 O.
- إعداد PAHBAH الحل B، تحتوي على سترات الصوديوم 50 ملي، وكلوريد الكالسيوم 10 ملم، و 500 ملم هيدروكسيد الصوديوم وتخزينها في RT.
- Immediately قبل الفحص، وإعداد حل العاملة 1.5X من 1 مل PAHBAH كاشف إلى 9 مل حل العازلة، متجر على الجليد حتى الاستخدام (لاستخدامها في غضون 4 ساعة).
- تحضير العينات في بالحرارة 0.2 أو 0.5 مل أنابيب. الجمع بين 5 ميكرولتر من كل حل المحتضنة مع ورق الترشيح (الخطوة 8.1) 45 ميكرولتر من H 2 O و 100 ميكرولتر من الحل PAHBAH العمل. يجب تشغيل الضوابط عينة (عينات المحتضنة دون ورق الترشيح) تحت نفس تركيزات (5 ميكرولتر عينة، 45 ميكرولتر H 2 O، والحل يعمل 100 ميكرولتر PAHBAH). أيضا اختبار المعايير 5 (5 ميكرولتر) تحتوي على ما بين 0 و 0.2 غرام / لتر من الجلوكوز، ونقية H 2 O. عينات والمعايير تعمل في ثلاث نسخ.
- احتضان العينات لمدة 10 دقيقة بالضبط عند 100 درجة مئوية، ثم تبرد في RT لمدة 10 دقيقة بالضبط. حلول ماصة في 96 لوحة جيدا والفحص الطيفي عند طول موجي 410 نانومتر من. طرح الفردية عينة التحكم (حضنت دون ورق الترشيح) من العينات للحصول على النهائيالقيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأعرب عن TrCel5A وTrCel5A-mCherry بنجاح في نباتات التبغ باستخدام نظام التعبير عابرة (أرقام 1A و 1B). النظر في نمط التعبير عن بروتين الانصهار TrCel5A-mCherry كشفت أوراق صحية (الشكل 1C)، والذي أظهر نطاق واسع تعبير البروتين تحت الضوء الأخضر (الشكل 1D).
تم إجراء استخراج مجموع البروتينات القابلة للذوبان في نباتات التبغ التي كانت الأوراق التي تحتوي على البروتين وأعرب عابر TrCel5A وأظهرت SDS-PAGE مجموعة كبيرة ومتنوعة من البروتينات كانوا حاضرين (الشكل 2A، حارة 1). مجموع عينة بروتين قابل للذوبان من TrCel5A معربا عن النباتات وما مجموعه عينة البروتين للذوبان المستمدة من NTEPs، وحضنت لمدة 10 دقيقة عند 55 درجة مئوية. TrCel5A لا تزال مستقرة ونشطة في 55 درجة مئوية في حين أن العديد (الأم التبغ) البروتينات الأخرى ليست مستقرة في درجة الحرارة هذه. وبالتالي، فإن العديد من غير essenti-وقد عجلت البروتينات آل بواسطة هذا العلاج، وترك عينة تنقيته جزئيا من TrCel5A. بعد هذا الحرارية هطول الخطوة، لوحظ وجود البروتين في الفرقة قوية ~ 40 كيلو دالتون (الشكل 2A، حارة 1). هذا ومن المرجح أن يكون المجال الحفاز (CD) من TrCel5A، وهو ما ثبت سابقا لتشغيل في هذا الحجم عندما أعرب في النباتات 4. السلبية والإيجابية عينات التحكم (الشكل 2A، الممرات 3 و 4 على التوالي) أظهرت تركيزات منخفضة من البروتينات المتبقية التبغ الحرارية تسامحا من NTEPs (مراقبة سلبية، الشكل 2A، حارة 3) وشرائح متعددة مما يدل على خليط من T. البروتينات reesei (مراقبة إيجابية، الشكل 2A، حارة 4).
وأكد حجم TrCel5A بواسطة تلوين الأجسام المضادة الموجهة إلى صاحب-6tag دمجها في TrCel5A C-محطة، والتي كان ينظر لتغيبه لكلا الضوابط (الشكل 2B). وقد أظهرت TrCel5A لالاحتفاظ النشاط endoglucanase بواسطة CMC zymography (الشكل 2C، الممرات 1 و 2)، حيث البروتين refolded إنشاء منطقة مسح قوي، مشيرا إلى تدهور اللجنة العسكرية المركزية، على نفس الارتفاع كما في Coomassie الملون هلام SDS-PAGE وصمة عار الغربية. لم يلاحظ أي نشاط للغير سلولاز-مخاليط من البروتين NTEPs (الشكل 2C، حارة 3)، وخليط من T. أظهرت البروتينات reesei تشغيل كعنصر تحكم إيجابية النشاط endoglucanase من مكونات متعددة (الشكل 2C، حارة 4).
لقياس النشاط cellulolytic من TrCel5A استخدمت ثلاثة المقايسات. أولا، تم تحليل تدهور 4 MUC بملاحظة زيادة الانبعاثات مضان في 465 نانومتر (360 نانومتر في منتهى السعادة) للصدر 4-MU. وقد تبين أن تتحلل TrCel5A 4MUC، كما فعل 1:1،000 التخفيف من خليط المتاحة تجاريا من T. السليلوزات reesei (الشكل 3A).
تحليل للقياس الكميلنشاط TrCel5A ضد CMC وقد تم من خلال قياس الافراج عن نيتروجينية صبغ في 590 نانومتر من نيتروجينية-CMC. TrCel5A النشاط في ظل هذه الظروف، كان يعادل في النشاط لتخفيف 1:1،000 من خليط سلولاز المذكورة أعلاه (الشكل 3B).
وجرى أيضا تحليل قدرة TrCel5A للحط من ورق الترشيح. لهذا الاختبار، تم إجراء مقايسة تسكر الأولية (أي مع الحل TrCel5A مهينة ورقة الترشيح) ومن ثم تم تحليل طاف بواسطة الفحص PAHBAH للتأكد من كمية السكريات المختزلة سراح (الشكل 3B).
أشرطة الشكل 1. التعبير النباتية للبنيات TrCel5A وتعبير مغايرة من TrCel5A-mCherry في لباتشو يترك تصور من قبل مضان تحت ضوء أخضر. تمثيل تخطيطي من الكاسيت التعبير النباتية المستخدمة لTrCel5A (A) وTrCel5A-mCherry (B) وترد. بعد عابرة TrCel5A-MC التعبير، تم فحص أوراق التبغ تحت العادي (C) أو الضوء الأخضر (D). لوحات (A) و (B) يشار إلى المروج CaMV (P35SS) وإشارة فاصل (pA35S) في اللون الأزرق الفاتح. يشار إلى 5'-UTR من كالكون سينسيز (كلية العلوم الصحية)، وHis6 الترميز تسلسل (His6) باللون الأزرق. وصفت الأمثل كودون زعيم الببتيد النباتية (LPH) مشتقة من السلسلة الثقيلة للmAb24 الفئران باللون الأخضر. LPH يحقق إفراز البروتين المؤتلف إلى apoplast، وبعد ذلك إشارة KDEL-C المحطة، أشارت باللون الأحمر، يؤخر البروتين إلى ER. السهام تسمية موقع ملزم للالتمهيدي لتضخيم التعبير كاسيت CaMV 35SS. لوحات (C) و (D) الضوء الأخضر كان له الإثارة 515 نانومتر.وقد أخذت صور بدون تكبير.
الشكل 2 الحجم والنشاط من TrCel5A أبداه SDS-PAGE، النشاف الغربية، واللجنة العسكرية المركزية zymography فصل من مجموع البروتينات القابلة للذوبان: من نباتات التبغ حيث أعرب عن TrCel5A عابر قبل (1) وبعد (2) هطول تنقية الحرارية؛ من نباتات التبغ حيث كان TrCel5A غير موجود، وأيضا بعد هطول الحرارية (3)؛ أو من خليط المتاحة تجاريا من T. السليلوزات reesei (4). وتصور SDS-PAGE البروتينات فصل مع Coomassie الأزرق تلطيخ (A)، النشاف الغربية ضد المنطقة صاحب العلامة من TrCel5A (B)، والنشاط الذي أبداه سلولاز zymography باستخدام CMC تصور باستخدام الكونغو الأحمر (C). PageRuler بلس(Fermentas) كانت تستخدم بوصفها علامة الوزن الجزيئي (M).
الرقم 3. وقد حضنت النشاط الإنزيمي الكمي للTrCel5A. TrCel5A مع 4-MUC (A)، نيتروجينية-CMC (B)، ورقة الترشيح (C) وتدهور الركيزة تقاس الإفراج من fluorophore 4-MU (A)، ونيتروجينية صبغ (B)، أو عن طريق قياس السكريات المختزلة عن طريق رصد تغير لون PAHBAH (C). كل مقايسة يظهر نتائج لمدة ثلاث مكررات. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. في جميع المقايسات الثلاثة كانت العينات التي تم تحليلها العازلة وحده، TrCel5A بعد هطول تنقية الحرارية، NTEP (WT NT) بعد هطول تنقية الحرارية، وخليط المتاحة تجاريا من T. السليلوزات reesei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التعبير المؤتلف من السليلوزات هو مجال اهتمام كبير، ويرجع ذلك إلى الرغبة في نظم أكثر كفاءة إنتاج الوقود الحيوي 1. النباتات تقدم العديد من الإمكانيات لإنتاج سلولاز ناجحة، مع ميزات مثل تقنيات الحصاد الاقتصادي وأساليب حلمهة ذاتية كونها خصائص مرغوبة جدا لإنتاج الوقود الحيوي على نطاق واسع. أبعد من ذلك، استخدام تعريب مختلفة لإنتاج البروتينات تسمح، إذا لزم الأمر، والتعديلات ما بعد النقل 20. تغيير النباتات لتمكين التعبير التأسيسية للالسليلوزات، في حين تقدم فوائد واضحة، هي طريقة تستغرق وقتا طويلا والتي قد تكون أو لا تكون ناجحة. تقنيات مثل احتجاز من البروتينات وأعرب وآليات التعبير محرض تزيد من احتمال الإنتاج سلولاز ناجحة في النباتات، ولكن هذه لا تزال تأخذ عدة شهور لإنشاء. هنا، وأظهرت وسائل التعبير عابرة، لتوضيح المحتملة لسلولاز محددةإلى أن يتم إنتاجها من خلال نظم النبات في غضون أيام.
تم استخدام الانصهار مع بروتين فلوري mCherry هنا للتدليل على نجاح الأساليب بروتين تعبير عابر. وقد تم توزيع TrCel5A-mCherry بوضوح عبر غالبية الأوراق التي كانت مخترقة مع Agrobacteria التي تحتوي على النواقل. التعريب إلى الشبكة الإندوبلازمية تمكن تعديلات ما بعد النقل من البروتين المعبر عنها. قدرة نظام التعبير لتمكين مثل ارتباط بالغليكوزيل أهمية خاصة بالنسبة لأولئك السليلوزات والتي هي مستمدة في الأصل من الكائنات الفطرية، مثل T. reesei 21. نظم التعبير الخميرة، والتي تحظى بشعبية على نحو متزايد للتعبير مغاير سلولاز، يؤدي في كثير من الأحيان في فرط ارتباط بالغليكوزيل من الانزيمات التي نوقشت أن تكون عائقا المحتملة للنشاط سلولاز كامل 22. ارتباط بالغليكوزيل مصنع آليات ل إعادة دون العيب من فرط ارتباط بالغليكوزيل. بالإضافة إلى ذلك، التعبير في أنظمة محطة يسمح للتوطين إلى المناطق التي تسمح أو لا تسمح التعديلات ما بعد النقل، وبالتالي تمكين الخياطة إلى مصدر للبروتين. ويمكن أيضا أن النظام أثبت هنا أن تستخدم، من خلال تطبيق تسلسل إشارة مختلفة 14، للتوطين إلى apoplast، بلاستيدات الخضراء، العصارة الخلوية أو حويصلات جولجي. استخدام اندماج بروتين فلوري، مثل TrCel5A-mCherry، يمكن أن تثبت نجاح تعبير البروتين وكذلك توطين البروتين. ومع ذلك، لا يطلب مثل هذه تقارن لاجراء مزيد من الاختبارات النشاط. وبالتالي فمن المستحسن أن بناء غير mCherry TrCel5A استخدامها لجميع اختبارات أخرى، كما هو موضح هنا، للحصول على بيانات أكثر دقة النشاط من سلولاز التعبير عنها. بشأن ضوابط لمزيد من التجارب، وينظر عينات من النباتات تسلل غير عابر عادة أن تكون ضوابط كافية.
الطبقة = "jove_content"> توصيف البروتين المعبر عنه، TrCel5A، من خلال SDS-PAGE والنشاف الغربية كشفت عن وجود الفرقة في حوالي 40kDa، مشيرا إلى أن المنطقة رابط البروتين قد المشقوق والتي كانت تستمد المنتجات الرئيسية التي تحتوي على الببتيد المجال الحفاز . وهذا يتماشى مع النتائج السابقة من TrCel5A تعبير البروتين في النباتات 5. وأشار تحليل Zymography من النشاط ضد CMC أن الببتيد المتبقية كانت نشطة باعتبارها endoglucanase. بينما SDS-PAGE والنشاف الغربية هي فحوصات شائعة جدا، CMC zymography هو اختبار أكثر تحديدا بكثير للسلولاز (وعلى وجه الخصوص endoglucanase) النشاط. بعض العوامل الهامة لنأخذ في الاعتبار من أجل تحقيق النتائج zymography الناجحة هي أ) أن الركيزة (في هذه الحالة CMC) يجب أن يكون solubilized تماما وتنتشر بالتساوي في جميع أنحاء هلام؛ ب) أن البروتين يحتاج إلى refolded بنجاح، ويفضل في فترة قصيرة للحد من كمية البروتين نشرها من خلال الجل؛ وج) أنيجب أن يكون فحص النشاط في درجة الحرارة المثلى لإنزيم يجري يعاير (لTrCel5A بين 50 و 60 درجة مئوية) ويجب أن تكون قصيرة لتمكين العصابات أكثر وضوحا من التدهور.
أظهر التحليل الكمي للنشاط سلولاز من TrCel5A أعرب أن الانزيم كانت نشطة ضد مجموعة من ركائز، بما في ذلك 4 MUC، اللجنة العسكرية المركزية ورقة الترشيح. تم فحص كل من ركائز باستخدام اختبار الطيفية مختلفة، إما عن طريق fluorophore (4-MU) أو عن طريق تحليل مبعثر ضوء رد فعل اللون (نيتروجينية صبغ أو PAHBAH). وتستخدم جميع ركائز ثلاث وفحوصات على نطاق واسع لتقييم النشاط سلولاز، والمقايسات هي على التوالي إلى الأمام نسبيا. يستخدم 4 MUC باعتبارها الركيزة الأساسية لتحديد النشاط غليكوزيل هيدرولاز، ومجموعة واسعة من هذه الإنزيمات (endoglucanases، exoglucanases وβ-glucosidases) تنشط ضدها. سرعة الفحص، عدد محدود من متطلبات، وحساسية عاليةوقدرة العديد من السليلوزات ليلتصق الركيزة، يجعل هذا الفحص مفيدة لفحص عام لالسليلوزات، أو لبحث نجاح شوط التعبير. نقطة واحدة أن نأخذ في الاعتبار عند استخدام 4 MUC هو أن هذه الركيزة هي مناسبة خاصة لنشاط β-glucosidases، مما يجعل من النشاط endoglucanases (مثل TrCel5A) أو exoglucanases يبدو ضعيفا بالمقارنة مع β-glucosidases أو مخاليط الانزيم الذي تحتوي glucosidases β. عند إجراء فحص 4-MUC مع تركيزات البروتين منخفضة أو مستويات النشاط المنخفضة على خلاف ذلك فمن المستحسن للاستفادة من إضافة الجلايسين (الرقم الهيدروجيني 10) كحل توقف، حيث أن تغيير درجة الحموضة يعزز مضان من 4-MU. CMC هو الركيزة أكثر تحديدا للانزيم التي أعرب عنها هنا، كما تدهورت فقط من قبل endoglucanases. مقايسة نيتروجينية-CMC هو أكثر تعقيدا من واحد ل 4-MUC، وذلك بسبب الحاجة إلى هطول الأمطار من السليلوز (والميثانول) من خلال الزنك. على فائدة كبيرة من هذه الركيزة، وبالتالي فحص، هو أنه محددة للنشاط endoglucanase، مما يجعلها مفيدة جدا لإقامة طبيعة سلولاز التي يتم إنتاجها. مرشح تدهور الورقة هو اختبار آخر شائع لتأسيس نشاط سلولاز. تختلف كمية تدهور وحظ تعتمد بشكل كبير على خصائص سلولاز التي يجري تقييمها، وأنه هو الركيزة المفضل لدراسة النشاط مخاليط الانزيم. مقايسة PAHBAH، وتستخدم هنا لفحص فلتر تدهور الورق، وتسلم كمية السكريات التي تم إصدارها بعد تسكر وذلك ينطبق أيضا على مجموعة واسعة من ركائز النموذج لم يثبت هنا، بما في ذلك اللجنة العسكرية المركزية، lichenan، β-جلوكان، α-السليلوز، AVICEL ، الزيلان وxyloglucan. لهذا الاختبار، ينبغي توخي الحذر لتشمل المعايير على نفس لوحة (أو في نفس المدى) كما العينات التي يجري تقييمها، والاختلاف في أوقات الحضانة يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في النتائج. بالتالي فمن المهم أيضا أن تكرار الفحص لضمان الدقة. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي دائما أن يتم تشغيل عنصر تحكم العينة، حيث يتم تحضين العينة دون الركيزة السليلوز، للسيطرة على أي السكريات الموجودة طبيعيا في الحد من العينات التي يمكن تحديدها من قبل PAHBAH، وخلاف ذلك من شأنه أن يعطي نتائج إيجابية كاذبة.
في الختام، وأظهرت بوضوح طرق للتعبير عابرة وتوصيف سلولاز المؤتلف. توفر هذه التقنيات وسيلة واضحة لتوليد كميات كافية من البروتين لمزيد من الفحص واحد أو أكثر السليلوزات، وذلك باستخدام اختبارات النشاط مثل تلك التي أثبتت هنا. على وجه الخصوص، هذه الطرق توفر طريقة سريعة لفحص إمكانيات السليلوزات المخصصة للإنتاج في بلانتا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل BMBF Forschungsinitiative "BIOENERGIE 2021 - Forschung FÜR يموت Nutzung فون Biomasse" والكتلة التميز "الوقود مصممة خصيصا من الكتلة الحيوية"، الذي يتم تمويله من خلال مبادرة التميز من قبل الحكومات الاتحادية وحكومات الولايات الألمانية لتعزيز العلوم والبحث في الجامعات الألمانية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic - kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic - rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic - carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody - rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper - Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer - Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source - BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome - VT1000S | Leica |
References
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
- Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
- Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
- Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
- Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
- Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
- Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
- Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
- Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
- Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
- Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
- Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
- Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
- Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
- Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
- Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
- Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).
