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Expression de recombinant cellulase Cel5A de Published: June 13, 2014 doi: 10.3791/51711
Automatic Translation
1, *1, *1, 2, 1
1Institute for Molecular Biotechnology, Bio7, RWTH Aachen University, 2Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology
* These authors contributed equally

Summary

Des plants de tabac ont été utilisés pour produire une cellulase fongique, TrCel5A, par l'intermédiaire d'un système d'expression transitoire. L'expression peut être contrôlée en utilisant une protéine de fusion fluorescente, et l'activité de la protéine a été caractérisée post-expression.

Abstract

Enzymes cellulose dégradantes, des cellulases, sont des cibles de la recherche et les intérêts industriels. La prépondérance de ces enzymes dans les organismes difficiles-à la culture, tels que les champignons de renforcement des hyphes et des bactéries anaérobies, a accéléré l'utilisation des technologies recombinantes dans ce domaine. Modes d'expression de plantes sont souhaitables pour un système de production à grande échelle d'enzymes et d'autres protéines utiles industriellement. Le présent mémoire, des procédés pour l'expression transitoire d'une endoglucanase fongique Trichoderma reesei Cel5A, dans Nicotiana tabacum sont démontrées. Expression de la protéine réussie est signalée, surveillée par fluorescence en utilisant une protéine de fusion mCherry-enzyme. En outre, un ensemble de tests de base sont utilisés pour examiner l'activité de T. transitoirement exprimé Cel5A reesei, y compris SDS-PAGE, Western blot, zymographie, ainsi que les dosages de fluorescence et de substrats de dégradation à base de colorant. Le système décrit ici peut être utilisé pour produire une cellule activeULASE dans une courte période de temps, afin d'évaluer le potentiel de production dans les usines à travers des systèmes d'expression constitutifs ou inductibles.

Introduction

La dégradation de la biomasse lignocellulosique et sa transformation en combustible liquide a été envisagée comme une méthode pour réduire la dépendance aux combustibles fossiles. Un obstacle important dans l'établissement de systèmes économiquement viables de transformation de la biomasse est dans la dégradation enzymatique de la cellulose et de l'hémicellulose 1. systèmes d'expression de plantes montrent un grand potentiel pour la production d'enzymes à l'échelle industrielle. Les systèmes agricoles à récolter des plantes économiquement et de volume sont déjà établis, comme ils l'ont été pendant des milliers d'années. La production de cellulases dans des plantes est souhaitable en raison de facteurs tels que la facilité d'auto-hydrolyse 2, et la possibilité d'optimiser l'utilisation des taux d'enzymes plus faibles en augmentant la digestibilité des parois cellulaires végétales 1. Enfin, les systèmes de plantes permettent le ciblage des protéines recombinantes à des zones spécifiques des cellules végétales et sont capables de modifier post-traductionnelle des enzymes le cas échéant 3.

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Nicotiana tabacum (tabac) est très couramment utilisé comme organisme modèle pour les études d'expression de protéines hétérologues dans les plantes, en raison de ses fonctions rapides d'accumulation croissance et la biomasse 4. L'expression transitoire de protéines recombinantes est une technique qui permet la production de protéines dans de courtes périodes de temps 5, tout en conservant une flexibilité quant à la localisation, et donc des modifications post-traductionnelles des protéines choisies à savoir, les cellulases. Cela permet la production de la cellulase (s) pour l'analyse de base, tout en jetant les bases de nouvelles stratégies d'expression dans les plantes. En utilisant cette stratégie d'expression transitoire, une endoglucanase à partir de la famille glycosyl hydrolase 5, Cel5A, dérivée de l'hôte fongique Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 est produit (ci-après dénommé TrCel5A). TrCel5A est une protéine de 42 kDa qui est nativement glycosylée et est très actif dans hydroylzing chaînes de cellulose 7.

La technique d'expression transitoire décrit ici est basé sur un système relativement couramment utilisés, infiltrant les feuilles de la plante avec des agrobactéries portant le gène d'intérêt dans un vecteur d'expression approprié. Afin de permettre une analyse rapide de la réussite de l'expression in planta, TrCel5A peut également être exprimée en tant que protéine de fusion avec mCherry, une protéine fluorescente monomère initialement extraite de Discosoma sp. Protéine DsRed 8, avec un six résidus histidine supplémentaires (His-tag) fusionné à l'extrémité C-terminale (TrCel5A-mCherry). L'expression de la protéine de fusion hétérologue, TrCel5A-mCherry, peut donc être contrôlée dans la plante en croissance en utilisant la lumière verte à examiner mCherry dispersion. Si on le désire, des coupes minces de la matière végétale peut être examinée au microscope sous une lumière verte pour établir la localisation spécifique de la protéine. Pour ce travail, le signal et trans'asseoir peptides ont été incorporés dans la construction, pour localiser l'exportation de protéines hétérologues à le réticulum endoplasmique 9.

Pour analyser l'activité des cellulases végétaux exprimés, y compris TrCel5A, un certain nombre de tests d'activité de cellulase peut être exécuté. Après l'extraction des protéines totales solubles dans des plantes, TrCel5A peut être purifié en partie en utilisant une technique d'incubation thermique. la taille de la protéine est établi en utilisant SDS-PAGE suivi d'un Western blot. Zymographie peut être utilisée pour analyser l'activité contre les substrats, par exemple la cellulose qui a été carboxy-méthylé (fabrication de la carboxyméthylcellulose CMC): pour la solubilité 10. Cellulase et glucosidase peut être contrôlée en utilisant le fluorophore 4 méthylumbelliféryl (4-MU) associé à β-D-cellobioside (combiné: 4-MUC). Un autre procédé pour évaluer l'activité d'endoglucanase comprend l'analyse par spectrométrie de CMC qui a été associée à un azo-dvous (Remazolbrilliant Blue R) 11. En outre, l'activité des protéines de deux endoglucanases et une gamme de cellulases peut être contrôlée par l'utilisation d'un test d'analyse de sucre, tel que l'hydrazide de p-hydroxy benzoïque (PAHBAH) dosage 12. Ces techniques peuvent être utilisées pour élucider et de quantifier l'activité de la cellulase d'intérêt exprimée.

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Protocol

1. Croissance de type sauvage N. tabacum plantes

  1. Pour grandir N. tabacum L. cv. Plantes Petit Havana SR1 sur le sol, placez les graines de tabac sur les pots appropriés remplis avec du terreau normal pour la germination. Après 2 semaines, transférer les plants dans des pots individuels. Incuber les plantes dans une serre avec une constante de 22 ° C (période sombre) ou 25 ° C (période de lumière) et 70% d'humidité relative de l'air. Fournir un éclairage dans un 16/8 h cycle lumière / obscurité (par exemple Philips IP65 400 lampes de W; 180 pmol · s -1 · m -2; λ = 400-700 nm) et de l'eau tous les jours.

2. Expression transitoire de TrCel5A et TrCel5A-mCherry protéines

  1. Dans des conditions stériles, prélever des colonies simples d'Agrobacterium Agarobacterium (de GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RIFR) contenant soit pTRAkc-ER-TrCel5A ou pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry et transfert dans un erlenmeyer contenant 10 ml d'extrait de levurebouillon (YEB, préparé selon les spécifications du fabricant) à moyen et à la kanamycine (50 mg / ml), de rifampicine (50 mg / ml) et de la carbénicilline (100 mg / ml) pour la sélection. Incuber pendant 36-40 heures à 26 ° C et 180 rpm. Remarque: La conception de constructions appropriées pour l'expression de la protéine est en dehors du champ d'application de cet article, mais à titre indicatif, les méthodes de Maclean et al 13 et Munro et Pellham 14 peut être suivie pour la conception de construction..
  2. Prendre 200 pi de chaque culture pour inoculer 20 ml de YEB avec les concentrations en antibiotiques mentionnés ci-dessus et incuber dans les mêmes conditions que précédemment.
  3. Après 36 à 40 h, les cultures preinduce en ajoutant 2 ul acetosyringon (200 pM concentration finale), 100 ul de 40% (p / v) de solution de glucose et de 200 pi de tampon de 1 M de MES pH 5,6. Incuber pendant la nuit.
  4. Préparer 100 ml d'un tampon d'infiltration 2x (sels basaux 100 g / L de saccharose, 3,6 g / L de glucose, 8,6 g / L de Murashige et Skoog, Ajuster le pH à 5,6 avec de l'hydroxyde de potassium).
  5. Mesurer la DO 600 des cultures avec des dilutions 1:05 jusqu'à atteindre une DO 600 de 5-6. Calculer le volume de culture nécessaire pour 30 ml de milieu d'infiltration à DO 600. Ajouter 15 ml de tampon d'infiltration 2x, puis ajouter H 2 O déminéralisée pour rendre le tampon jusqu'à 30 ml.
  6. Prendre des plantes de serre et utiliser un embout de pipette pour entailler le côté abaxial de la 3 e à 5 e feuille du haut pour faciliter l'infiltration.
  7. Utiliser un embout de pipette pour entailler le côté abaxiale des feuilles pour faciliter l'infiltration.
  8. Remplir une seringue avec du milieu de l'infiltration et de le mettre (sans aiguille) sur l'une des entailles faites précédemment. Supporte seringue avec un doigt sur le côté ventral de la feuille. Appuyez sur le support avec soin dans le tissu des zones de la feuille interveinales. Note: Après infiltration, de cultiver les plantes dans une serre, dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. En outre, maintenir une proportion égale de untreated, plantes non-expression transitoire (NTEPs) que les contrôles, dans les mêmes conditions que les plantes infiltrés.

3. Évaluation de TrCel5A-mCherry expression dans les feuilles des plantes

  1. Après 4-6 jours, prendre des plantes infiltrées par A. tumefaciens contenant pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry de l'effet de serre et les placer dans une pièce sombre pour l'analyse de fluorescence.
  2. Pour visualiser la fluorescence dans des sections de feuilles exprimant TrCel5A-mCherry, plantes d'éclairage utilisant une source de lumière portable émettant de la lumière verte à 515 nm avec un filtre rouge (620-750 nm). Remarque: Dans une caractérisation approfondie de l'expression des protéines dans les feuilles des plantes peut être réalisé en feuilles minces sectionnement avec un vibratome et examen à la lumière et microscopie de fluorescence. Pour cette suivez les étapes ci-dessous:
    1. Couper de petites sections d'environ 5 x 5 mm de taille d'une feuille infiltré et les incorporer dans 4% d'agarose dissous dans 50 mM de tampon phosphate (pH 5,7).
    2. Cutsection de 80 à 90 um de taille à partir de feuilles en utilisant un vibratome embarqués. Placez-les sur une lame de microscope, couvrir avec un tampon ou une lamelle et examiner les en utilisant un microscope à un grossissement de 10X avec un détecteur de fluorescence, en utilisant la même longueur d'onde et de filtrage ci-dessus.

4. TrCel5A extraction à partir de feuilles de tabac

  1. Couper des morceaux de feuilles de tabac pour un poids approximatif de 1 g de plantes infectées par A. tumefaciens contenant pTRAkc-ER-TrCel5A et placer dans un mortier préalablement refroidi à l'azote liquide. Ajouter une quantité appropriée de l'azote liquide pour les échantillons. Grind laisse à poudre à l'aide d'un pilon préalablement refroidi.
  2. Ajouter 2 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant du fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM à la matière de la feuille de sol et mélanger jusqu'à ce que la majorité de la matière de la feuille se trouve en suspension. Extrait du Centrifuger à 15 000 g pendant 20 min à 4 ° C et à prendre surnageant contenant des protéines.
  3. Centrifuge l'extrait à 15 000 g pendant 20 min à 4 ° C et de prendre surnageant contenant des protéines en faisant attention de ne pas perturber le culot. Éliminer le culot.
  4. Purifier partiellement TrCel5A par incubation du surnageant contenant des protéines à 55 ° C pendant 10 min. Laisser reposer à température ambiante pendant encore 10 min, puis centrifuger à 15 000 g pendant 10 min à température ambiante. Répétez le processus de purification partielle pour les plantes non infiltrées d'obtenir des échantillons de contrôle. Utiliser ces échantillons pour toutes les expériences suivantes. Remarque: Les solutions de protéines peuvent être stockés à 4 ° C pendant 1 semaine ou à -20 ° C pendant jusqu'à 3 mois.
  5. Répéter le procédé de purification partielle pour les plantes non infiltrées d'obtenir des échantillons de contrôle. Utiliser ces échantillons pour toutes les expériences suivantes. Remarque: Les solutions de protéines peuvent être stockés à 4 ° C pendant 1 semaine ou à -20 ° C pendant jusqu'à 3 mois.

5. SDS-PAGE, transfert de Western, et Azo-CMC Zymographie de TrCel5A-mCherry </ P>

  1. Achat ou préparer 12% (p / v) des gels de SDS-PAGE que par des méthodes établies 15.
  2. Dissoudre la CMC dans l'eau pour obtenir un (m / v) solution à 1,5%. Pour faire des gels de CMC-SDS-PAGE, substituer 1 ml de 1,5% de CMC à 1 ml d'eau dans une solution de 10 ml de gel de SDS-PAGE mélange, résultant en un 0,1% (p / v) de CMC + 12% (p / v ) gel SDS-PAGE mélange. Verser gel normalement. Remarque: S'assurer que la CMC dans la solution initiale est complètement dissous par une combinaison d'agitation et chauffage à 40 ° C (répéter directement avant la préparation de la solution de gel).
  3. Dénaturer les échantillons par ébullition en présence de SDS, selon des méthodes établies 12. Comme témoin positif, en utilisant une dilution 1:500 d'un mélange de cellulases disponibles dans le commerce à partir de T. reesei, tel que T. reesei ATCC 26921. Comme témoin négatif utiliser une solution de protéines de même préparé à partir de feuilles non infiltrées (NTEPs).
  4. Effectuer le électrophorèse selon les protocoles normaux 15,par exemple, l'utilisation de 200 V pendant environ 50 min avec la électrophorèse interrompu une fois que le front de colorant atteint le bas du gel.
  5. Une tache gel de SDS-PAGE en utilisant 0,1% (p / v) de bleu brillant de Coomassie et destain en utilisant un mélange méthanol / acide acétique glacial. Remarque: coloration rapide et décoloration peuvent être effectuées en chauffant légèrement la coloration et décoloration des solutions, c'est à dire en utilisant un micro-ondes pendant environ 15 secondes pour se réchauffer (mais pas bouillir) d'abord la coloration et les solutions de décoloration, de changer la solution de décoloration après 10 min , ou lorsqu'il est refroidi, et répéter avec la nouvelle solution de décoloration.
  6. Effectuer un Western blot d'une gel SDS-PAGE en utilisant des protocoles établis 16,17. Utiliser les anticorps suivants: un anticorps polyclonal de lapin contre un anticorps anti-lapin de région Fc His-tag (primaire) et une chèvre polyclonal qui a été conjugué à une phosphatase alcaline (secondaire). Remarque: Anticorps secondaires doivent être choisis pour permettre la visualisation en utilisant nitrobleu tétrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 '-indolyphosphate sel de p-toluidine (NBT / BCIP), comme décrit 18.
  7. Effectuer protéine dans le gel de repliement sur le 0,15% (p / v) de gel de CMC SDS-PAGE par incubation du gel dans 1,5% (p / v) β-cyclodextrine, le phosphate-citrate buffer 20 mM, pH 6,5, à température ambiante, avec agitation douce pendant 15 min 19.
  8. Jeter la solution de β-cyclodextrine et laver rapidement le gel avec H 2 O. Incuber à température ambiante dans 50 mM de tampon d'acétate de sodium (pH 4,8) pendant encore 15 min. Effectuer zymographie en utilisant la CMC à 0,15% CMC gel SDS-PAGE repliée en faisant incuber le gel dans 30 mM de tampon acétate de sodium pH 4,8 pendant 20 min à 50 ° C.
  9. Effectuer zymographie en utilisant la CMC repliée 0,15% (p / v) de CMC gel SDS-PAGE, le gel par incubation dans 30 mM de tampon acétate de sodium (pH 4,8) pendant 20 min à 50 ° C.
  10. Colorer le gel pendant 10 min en utilisant un 0,1% p / v de solution de rouge Congo et destain pendant 30 min ou jusqu'à ce que les bandes claires sont observées en utilisant 1 M de NaCl. Laver le gel avec 0,3% (v / v) d'acide acétique pour une imagerie plus claire.

6. 4 MUC Dosage de l'activité de TrCel5A

  1. Préparer une solution stock de 10 mM 4 MUC dans 50% (v / v) méthanol, et de le stocker dans l'obscurité à la température ambiante
  2. Immédiatement avant le dosage, préparer une solution de travail 4-MUC 2x, composé de 1 mM de 4-MUC et 60 mM d'acétate de sodium, pH 4,8.
  3. Effectuer ce test sur ​​des échantillons contenant 100 ul de protéine de feuilles (avec ou sans TrCel5A exprimée de manière inductible), 100 ul d'un mélange de cellulases disponibles dans le commerce à partir de T. 1:1000 reesei, et pur H 2 O, respectivement. Tester chaque échantillon en triple exemplaire.
  4. Ajouter 100 ul de la solution de travail 4-MUC dans des puits séparés d'une plaque de 96 puits, puis ajouter 100 ul de chaque échantillon.
  5. Déterminer 0 min timepoint de 4-MU fluorescence à travers la spectroscopie de fluorescence, en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 360 ​​nm et une longueur d'onde d'émission de 465 nm.
  6. Incuber les plaques à 20min à 50 ° C, recouvertes avec des couvercles d'adhésif pour empêcher l'évaporation. Arrêter la réaction par le gel (ou en combinant 100 pi 0,15 M de glycine, pH 10,0, et 100 ul d'échantillon dans une plaque séparée).
  7. Déterminer le point de terminaison de 4-MU fluorescence par spectroscopie de fluorescence, en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 360 ​​nm et une longueur d'onde d'émission de 465 nm. Soustraire 0 min de point de terminaison (20 min) timepoint pour obtenir le changement de valeurs de fluorescence.

7. Azo-carboxyméthyl cellulose Dosage de l'activité de TrCel5A

  1. Préparer un stock de 1,5% (p / v) Azo-CMC qui est stocké à la température ambiante, et une solution de précipitation contenant de l'acétate 18 mM de zinc, 0,5 M d'acétate de sodium, pH 5 et 80% d'éthanol (v / v), entreposer à manger température.
  2. Immédiatement avant le dosage, préparer une solution de CMC Azo-2x travail, composé de 1% (p / v) Azo-CMC (dans H 2 O) et de 60 mM d'acétate de sodium, pH 4,8.
  3. Moissonneuse 50 ul d'échantillon et 50 ul de travailsolution durable en tubes de 1,5 ml.
  4. Les échantillons d'essai contenant 50 ul de protéine de feuilles (avec ou sans TrCel5A exprimé de manière transitoire); 100 pl d'un mélange de cellulases disponibles dans le commerce à partir de T. reesei dilué 1:1000; et pur H 2 O. Échantillons et des normes en triple.
  5. Incuber les échantillons pendant 20 min à 50 ° C. Arrêter la réaction en ajoutant 250 ul de solution de précipitation. Vortex chaque échantillon vigoureusement pendant 10 secondes pour assurer des solutions ont été complètement combinés.
  6. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 min, puis à nouveau vortex. Centrifuger les échantillons à 1000 g pendant 10 min. Prélever 200 ul de chaque échantillon surnageant à une plaque de 96 puits, en prenant soin de ne pas perturber le culot.
  7. Dosage par spectroscopie d'absorbance à une longueur d'onde de 590 nm.

8. PAHBAH Dosage de TrCel5A

  1. Utilisez un poinçon à découper un cercle (~ de 5,5 mm de diamètre) de papier filtre. Ajouter 100 ul de 60 mM NaAc, pH 4,8, et 100 pi d'échantillons, soit contenant des protéines de feuille (avec ou sans TrCel5A exprimée de manière inductible) ou un T. commerciale mélange de cellulases reesei, dilué 1:1000, et incuber avec des cercles de papier filtre pendant 20 heures à 50 ° C avec 300 tours en secouant. Pour chaque échantillon incubé avec du papier filtre, incuber également une solution double sans papier filtre comme échantillon-commandes individuelles.
  2. Préparer un 330 mM p-hydroxy hydrazide de l'acide benzoïque (PAHBAH) solution A en dissolvant PAHBAH en H 2 O avec l'ajout de 5 ml de HCl concentré pour un total de 100 ml de solution, et conserver à la température ambiante. Nota: Les meilleurs résultats sont obtenus en ajoutant le HCl à un plus petit volume de PAHBAH suspension, c'est à dire 30 ml, que l'on agite à une température d'aider la dissolution avant d'effectuer le volume à 100 ml avec de l'H 2 O.
  3. Préparer PAHBAH solution B, contenant du citrate de sodium 50 mM, 10 mM de chlorure de calcium, et du NaOH 500 mM et stocker à température ambiante.
  4. Immediately avant le dosage, préparer une solution de travail de 1,5 x 1 ml de réactif PAHBAH à 9 ml de solution tampon, stocker sur de la glace jusqu'à utilisation (pour être utilisé dans les 4 heures).
  5. Préparer les échantillons en thermostables 0,2 ou 0,5 ml tubes. Moissonneuse 5 pi de chaque solution incubée avec un papier filtre (étape 8.1), 45 ul de H 2 O et 100 ul de solution de travail PAHBAH. contrôles d'échantillons (échantillons incubés sans papier filtre) doivent être exécutés dans les mêmes concentrations (5 échantillons de pi, 45 pi H 2 O, solution de travail de 100 pi de PAHBAH). Tester également des normes 5 (5 ul) contenant entre 0 et 0,2 g / L de glucose pur et H 2 O. Échantillons et des normes en triple.
  6. Incuber les échantillons pour exactement 10 min à 100 ° C, puis refroidir à température ambiante pendant exactement 10 min. solutions de pipette dans une plaque de 96 puits et le dosage par spectroscopie à une longueur d'onde de 410 nm. Soustraire échantillons-contrôles individuels (incubées sans papier filtre) à partir d'échantillons d'obtenir finalevaleurs.

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Representative Results

TrCel5A et TrCel5A-mCherry ont été exprimés avec succès dans des plants de tabac en utilisant le système d'expression transitoire (figures 1A et 1B). L'examen du profil d'expression de la protéine de fusion TrCel5A-mCherry révélé feuilles saines (figure 1C), qui a montré l'expression de protéines sous une lumière verte généralisée (figure 1D).

Extraction des protéines solubles totales a été effectué sur des plants de tabac qui ont des feuilles qui contenaient la protéine exprimée de manière transitoire TrCel5A et SDS-PAGE a montré une grande variété de protéines étaient présentes (figure 2A, piste 1). L'échantillon total soluble de protéines à partir de plantes exprimant TrCel5A et un échantillon de protéine soluble totale provenant de NTEPs, ont été incubées pendant 10 min à 55 ° C. TrCel5A reste stable et active à 55 ° C tandis que de nombreuses autres protéines natives (du tabac) ne sont pas stables à cette température. Ainsi, de nombreux non-essentiprotéines al ont été précipités par ce traitement, laissant un échantillon partiellement purifié de TrCel5A. Après cette étape de précipitation thermique, une bande de protéine a été observée à forte ~ 40 kDa (Figure 2A, piste 1). Ceci est susceptible d'être le domaine catalytique (CD) de la TrCel5A, qui a été montré précédemment pour fonctionner avec cette taille lorsqu'il est exprimé dans des plantes 4. L'échantillon de contrôle négatif et positif (figure 2A, pistes 3 ​​et 4, respectivement) ont montré de faibles concentrations de protéines restantes du tabac thermo-tolérants de NTEPs (contrôle négatif, la figure 2A, piste 3) et de multiples bandes indiquant un mélange de T. protéines reesei (contrôle positif, la figure 2A, piste 4).

La taille de la TrCel5A a été confirmée par coloration à l'anticorps dirigé à l'His-6tag intégrée à l'extrémité C-terminale TrCel5A, qui a été considéré comme absent à la fois pour les témoins (figure 2B). Le TrCel5A a été démontré queconserver une activité d'endoglucanase par zymographie CMC (Figure 2C, les voies 1 et 2), où la protéine repliée a créé une aire dégagée forte, ce qui indique une dégradation CMC, à la même hauteur que dans le gel coloré au Coomassie de SDS-PAGE et Western blot. Aucune activité n'a été observée pour les protéines non-mélanges de cellulase de NTEPs (Figure 2C, piste 3), et le mélange de T. protéines reesei courir comme un contrôle positif ont montré une activité endoglucanase de plusieurs composants (figure 2C, piste 4).

Pour quantifier l'activité cellulolytique de TrCel5A trois dosages ont été utilisés. Tout d'abord, la dégradation de MUC-4 a été analysée en observant l'augmentation de l'émission de fluorescence à 465 nm (excitation à 360 nm) de la 4-MU libéré. TrCel5A a été montré pour dégrader 4MUC, tout comme une dilution de 1:1000 d'un mélange disponible dans le commerce de T. cellulases reesei (figure 3A).

Une analyse quantifiablede l'activité de TrCel5A contre CMC a été fait en mesurant la libération d'un colorant azoïque à 590 nm de Azo-CMC. TrCel5A activité dans ces conditions, l'activité était équivalent à une dilution de 1:1000 du mélange de cellulase mentionné ci-dessus (figure 3B).

La capacité de TrCel5A de dégrader le papier filtre a été également analysée. Pour ce dosage, un dosage initial de saccharification a été effectuée (par exemple avec la solution TrCel5A dégrader le papier filtre), puis le surnageant a été analysée par le test de PAHBAH de déterminer la quantité de sucres réducteurs libérés (Figure 3B).

Figure 1
Cassettes d'expression de l'usine Figure 1. Des constructions TrCel5A et expression hétérologue de TrCel5A-mCherry dans detabac laisse visualisés par fluorescence sous la lumière verte. représentations schématiques de la cassette d'expression de la plante utilisée pour TrCel5A (A) et TrCel5A-mCherry (B) sont représentés. Après expression transitoire TrCel5A-mC, feuilles de tabac ont été examinés dans des conditions normales (C) ou feu vert (D). Pour les panneaux (A) et (B) le promoteur CaMV (P35SS) et le signal de terminaison (pA35S) sont indiqués en bleu clair. 5'-UTR de chalcone synthase (CHS), et la séquence codant His6 (His6) sont indiqués en bleu. Le peptide leader de codon optimisé plante (LPH) dérivée de la chaîne lourde de l'mAb24 murin est représentée en vert. LPH réalise la sécrétion de la protéine recombinante à l'apoplaste, après quoi un signal KDEL C-terminal, indiqué en rouge, retarde la protéine vers le RE. Les flèches marquent le site de liaison pour l'amorce pour amplifier la cassette d'expression CaMV 35SS. Pour les panneaux (C) et (D) le feu vert avait une excitation 515 nm.Les images ont été prises sans grossissement.

Figure 2
. Figure 2 Taille et l'activité de TrCel5A montré par SDS-PAGE, transfert de Western, et la CMC zymographie Séparation des protéines totales solubles. À partir de plantes de tabac, où TrCel5A a été exprimé de manière transitoire avant (1) et après (2) purification par précipitation thermique; à partir de plants de tabac, où TrCel5A n'était pas présent, également après la précipitation thermique (3); ou d'un mélange disponible dans le commerce de T. cellulases reesei (4). Protéines séparées par SDS-PAGE sont visualisés au bleu de Coomassie coloration (A), Western blot contre la région His-tag de TrCel5A (B), et l'activité de la cellulase montré par zymographie en utilisant CMC visualisés à l'aide de rouge Congo (C). PageRuler plus(Fermentas) a été utilisé comme marqueur de poids moléculaire (M).

Figure 3
Figure 3. L'activité enzymatique quantification de TrCel5A. TrCel5A a été incubé avec du 4-MUC (A), Azo-CMC (B), et un papier filtre (C) et la dégradation du substrat mesurée par la libération du fluorophore 4-MU (A), un colorant azoïque (B), ou par la quantification des sucres réducteurs, en surveillant le changement de couleur de PAHBAH (C). Chaque essai montre les résultats pour trois répétitions. Les barres d'erreur indiquent l'écart type. Dans les trois essais les échantillons analysés étaient le tampon seul, TrCel5A après purification par précipitation thermique, PFEN (WT Nt) après purification par précipitation thermique, et d'un mélange disponible dans le commerce de T. cellulases reesei.

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Discussion

L'expression recombinante de cellulases est un domaine de grand intérêt, en raison de la volonté de plus efficaces les systèmes de production de biocarburants 1. Plantes offrent de nombreuses possibilités pour la réussite de la production de cellulases, avec des fonctionnalités telles que les techniques de récolte économique et les méthodes de autohydrolyse étant des propriétés très souhaitables pour la production de biocarburants à grande échelle. En outre, l'utilisation de différentes localisations de production de protéines permet, si nécessaire, des modifications post-traductionnelles 20. La modification des plantes afin de permettre l'expression constitutive de cellulases, tout en offrant des avantages évidents, est un procédé qui prend du temps, qui peuvent ou peuvent ne pas être couronnée de succès. Des techniques telles que la séquestration des protéines exprimées et les mécanismes d'expression inductibles augmentent la probabilité de succès la production de cellulases dans les plantes, mais ceux-ci prennent encore de nombreux mois à établir. Ici, les procédés d'expression transitoire sont mises en évidence, pour illustrer le potentiel d'une cellulase spécifiqueêtre produite au moyen de systèmes de plantes en quelques jours.

Une fusion avec la protéine fluorescente mCherry a été utilisé ici pour démontrer le succès des procédés d'expression de protéines transitoires. TrCel5A-mCherry a été clairement réparties entre la majorité des feuilles qui avaient été infiltrées par le Agrobacteria contenant le vecteur. La localisation dans le réticulum endoplasmique permet des modifications post-traductionnelles de la protéine exprimée. La capacité d'un système d'expression afin de permettre par exemple la glycosylation est particulièrement important pour les cellulases qui sont initialement dérivés d'organismes fongiques, telles que T. reesei 21. systèmes d'expression de levure, qui sont de plus en plus populaire pour l'expression de la cellulase hétérologue, entraînent souvent hyper-glycosylation des enzymes, qui est l'objet de débats à être un obstacle potentiel à la pleine activité de cellulase 22. glycosylation des plantes mécanismes dere sans l'inconvénient de l'hyper-glycosylation. En outre, l'expression dans des systèmes végétaux permet pour la localisation de zones qui permettent ou ne permettent pas de modifications post-traductionnelles, permettant ainsi l'adaptation à la source de la protéine. Le système montré ici peut également être utilisé, par l'application de différentes séquences de signaux 14, pour la localisation de l'apoplaste, les chloroplastes, l'appareil de Golgi ou des vésicules de cytosol. L'utilisation de fusions de protéines fluorescentes, telles que TrCel5A-mCherry, peut établir la réussite de l'expression de la protéine ainsi que la localisation de la protéine. Cependant, de tels conjugués ne sont pas tenus pour des tests d'activité. Ainsi, il est recommandé une construction non-mCherry TrCel5A être utilisé pour tous les autres tests, comme l'a montré ici, pour obtenir des données sur les activités plus précises de la cellulase exprimé. En ce qui concerne les contrôles pour d'autres expériences, des échantillons de plantes non-transitoire infiltrés sont souvent considérés comme des contrôles adéquats.

5. analyse de Zymographie d'activité contre les CMC a indiqué que le peptide restant était actif comme une endoglucanase. Bien SDS-PAGE et Western blot sont des tests très communs, CMC zymographie est un test beaucoup plus précis pour cellulase (et en particulier endoglucanase) l'activité. Parmi les facteurs importants à garder à l'esprit les résultats de zymographie succès sont: a) que le substrat (dans ce cas CMC) doit être complètement solubilisé et uniformément répartis sur le gel; b) que la protéine a besoin d'être repliée avec succès, de préférence dans une courte période pour limiter la quantité de diffusion de la protéine dans le gel; et c) quele dosage de l'activité devrait être à la température optimale de l'enzyme à doser (pour TrCel5A entre 50 et 60 ° C) et doit être bref pour permettre aux bandes nettes de dégradation.

L'analyse quantitative de l'activité de la cellulase de TrCel5A exprimé a démontré que l'enzyme était active contre une gamme de substrats, y compris le 4-MUC, la CMC et le papier filtre. Chacun des substrats a été examinée en utilisant un essai spectroscopique différent, soit par un fluorophore (4-MU) ou par analyse de la diffusion de la lumière d'une réaction colorée (Azo-colorant ou PAHBAH). Tous les trois substrats et les dosages sont largement utilisés pour l'évaluation de l'activité cellulase, et les dosages sont relativement droites de marche avant. 4-MUC est utilisé en tant que substrat de base pour déterminer l'activité glycosyl hydrolase, comme une grande variété de ces enzymes (endoglucanases, les exoglucanases et les β-glucosidases) sont actifs contre elle. La vitesse de l'essai, un nombre limité de conditions, de sensibilitéet la capacité de nombreux cellulases à cliver le substrat, en fait un test utile pour le dépistage général pour des cellulases, ou pour sonder le succès d'une course d'expression. Un point à garder à l'esprit lors de l'utilisation de 4 MUC est que ce substrat est particulièrement adapté à l'activité de β-glucosidases, rendant l'activité de endoglucanases (comme TrCel5A) ou exoglucanases semble faible en comparaison de β-glucosidases ou mélanges d'enzymes qui contenir des β-glucosidases. Lors de la réalisation d'un dosage de 4-MUC avec de faibles concentrations de protéines ou les niveaux d'activité par ailleurs faible, il est recommandé d'utiliser l'addition de glycine (pH 10) en tant que solution d'arrêt, que la modification du pH améliore la fluorescence de la 4-MU. CMC est un substrat plus spécifique de l'enzyme exprimée ici, car il est seulement dégradé par des endoglucanases. Le dosage Azo-CMC est plus compliquée que celle de MUC-4, en raison de la nécessité d'une précipitation de la cellulose (et de méthanol) par du zinc. Le principal avantage de ce substrat, et donc dosage, Est qu'elle est spécifique d'une activité endoglucanase, ce qui rend très utiles pour déterminer la nature de la cellulase produite. Filtre dégradation du papier est un autre test commun pour établir une activité cellulase. La quantité de dégradation observée varie de manière significative dépend des propriétés de la cellulase en cours d'évaluation, et il est un substrat préféré pour l'examen de l'activité des mélanges d'enzymes. Le dosage de PAHBAH, utilisé ici pour examiner filtre dégradation du papier, reconnaît la quantité de sucres libérés après saccharification et est donc également applicable à une large gamme de substrats modèles pas démontré ici, y compris CMC, lichénane, β-glucane, α-cellulose, AVICEL , le xylane et le xyloglucane. Pour ce test, il faut veiller à inclure des normes sur la même plaque (ou dans la même série) que les échantillons en cours d'évaluation, comme la variation dans les temps d'incubation peut conduire à des différences dans les résultats. Il est donc également important de répéter l'essai pour assurer l'exactitude. Plus, Un contrôle de l'échantillon doit toujours être exécuté, où l'échantillon est incubé sans le substrat cellulosique, de contrôler pour tous les sucres naturellement présents dans les échantillons qui peuvent être identifiés par l'PAHBAH réductrices, et aurait par ailleurs donner des résultats faussement positifs.

En conclusion, les méthodes pour l'expression transitoire et la caractérisation d'une cellulase recombinante sont clairement démontrés. Ces techniques offrent un moyen simple de générer des quantités suffisantes de protéines pour un examen plus approfondi d'un ou plusieurs cellulases, en utilisant des tests d'activité comme celles mises en évidence ici. En particulier, ces méthodes fournissent un moyen rapide pour examiner le potentiel de cellulases désignés pour la production de plantations.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 - Forschung für die Nutzung von Biomasse" et le pôle d'excellence "carburants sur mesure à partir de la biomasse", qui est financé par l'Initiative d'excellence par les gouvernements fédéral et de l'Etat allemand pour promouvoir la science et de la recherche dans les universités allemandes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside SIGMA-ALDRICH M6018
Acetic acid ROTH 3738
Acetosyringon (concentrated) ROTH 6003
Antibiotic - kanamycin ROTH T832
Antibiotic - rifampicin ROTH 4163
Antibiotic - carbenicillin ROTH 6344
Antibody - rabbit anti His(6) pAb ROCKLAND 600-401-382
Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb DIANOVA 111-055-008
Azo-carboxymethyl cellulose MEGAZYME S-ACMC
β-cyclodextrin SIGMA-ALDRICH C4805
Calcium chloride dihydrate SIGMA-ALDRICH C5080
Carboxymethyl cellulose ROTH 3333.1
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 SIGMA-ALDRICH C2730
Congo red SIGMA-ALDRICH 75768
Coomasie brilliant blue G 250 ROTH 9598.2
D(+)-glucose ROTH 8337
Ethanol ROTH K928
Filter paper - Rotilabo blotting paper ROTH CL67
NBT/BCIP SIGMA-ALDRICH 72091
MES buffer ROTH 4256
Methanol ROTH 8388
Sodium citrate ROTH 3580
Sodium dodecylsulfate SERVA 20765
Sodium hydroxide ROTH 6771
Soil, Einheitserde classic  PATZER GMBH
Spectrometer - Infinite M200 TECAN
Sucrose SIGMA-ALDRICH S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide  SIGMA-ALDRICH H9882
Phosphate buffered saline ROTH 1058
UV light source - BLAK RAY UVP
Vibratome - VT1000S Leica

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References

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Expression de recombinant cellulase Cel5A de<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Dans les usines de tabac
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Garvey, M., Klinger, J., Klose, H., Fischer, R., Commandeur, U. Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants. J. Vis. Exp. (88), e51711, doi:10.3791/51711 (2014).

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