Abstract
En stor udfordring i neurofysiologi har været at karakterisere respons egenskaber og funktion i de mange hæmmende celletyper i hjernebarken. Vi her deler vores strategi for at opnå stabile, godt isolerede single-unit optagelser fra identificerede hæmmende interneuroner i den bedøvede mus cortex ved hjælp af en metode, der er udviklet af Lima og kolleger 1. Optagelser udføres i mus, der udtrykker Channelrhodopsin-2 (CHR2) i specifikke neuronale subpopulationer. Medlemmer af befolkningen identificeres ved deres reaktion på en kort glimt af blåt lys. Denne teknik - kaldes "PinP" eller Photostimulation-assisteret Identifikation af neuronale populationer - kan implementeres med standard ekstracellulære kontrolapparat. Det kan tjene som en billig og tilgængelig alternativ til calcium imaging eller visuelt guidet patching, med henblik på at målrette ekstracellulære optagelser til genetisk identificerede celler. Here vi leverer et sæt retningslinjer for at optimere metoden i den daglige praksis. Vi forfinet vores strategi specielt til målretning parvalbumin-positive (PV +) celler, men har fundet, at det virker for andre interneuron typer så godt, såsom somatostatin-udtrykkende (SOM +) og calretinin-udtrykkende (CR +) interneuroner.
Protocol
BEMÆRK: Følgende protokol er i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer som er godkendt af University of Oregon Animal Care og brug Udvalg.
1. Akut Kirurgi
- Bedøve dyr med en ketamin-cocktail medetomidin, via intraperitoneal (ip) injektion (tabel 1).
BEMÆRK: Musene anvendt i disse eksperimenter er genereret ved at krydse en cre-afhængig CHR2-EYFP transgene line10 at Interneuron driver linjer (Pvalb-iCre11, PV +; SST-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Viral levering af CHR2 eller relaterede opsiner bør arbejde lige så godt, forudsat opnås lignende ekspressionsniveauer. - Inden du begynder kirurgi, sikre, at dyret ikke udviser nogen reaktion på en blid tå knivspids. Re-administrere anæstetika hele forsøget nødvendigt for at opretholde denne dybde af anæstesi. Hvis du bruger injicerbare anæstetika, eventuelt implantere en ip kateter til vedligeholdelse injektioner.
- Holde dyret hydreret med saltvand eller lakteret Ringers opløsning under hele forsøget (ca. 3 ml / kg / time), for eksempel ved anvendelse af en hensigtsmæssigt fortyndet bedøvelsesmiddel cocktail for vedligeholdelse injektioner (tabel 1).
- Placer dyret i en stereotaktisk eller anden hoved-bedrift apparat. Sørg for, at kraniet er godt sikret. Dette er afgørende for at opretholde stabile encellede optagelser.
- Påfør opthalamic salve til øjnene for at forhindre tørhed. Opretholde kroppens temperatur på 36,5 til 37 ° C.
- Udfør en cisternal afløb for ekstra stabilitet optagelse. Ved hjælp af en skalpel, fjerne væv fra den bageste flade af kraniet for at blotlægge cisterna magna. Lav en lille nick i dura at dræne cerebrospinalvæske. Brug kun selve spidsen af bladet, og undgå at kontakte cerebellum eller hjernestammen.
- Ved hjælp af skalpel, udføre en lille kraniotomi (~ 2 mm 2) over den kortikale område af interesse (for auditivcortex, groft -2,3 mm posterior for bregma, 4,5 mm lateralt for midterlinien).
- Fjern dura og dækker den eksponerede cortex med et lag af varm agarose 0,5-1 mm tyk (1,5% agarose i saltvand, 0,9% NaCl; anvendelse ved ~ 37 ° C). Hold agarose fugtig hele eksperimentet ved jævnligt at anvende nogle dråber saltvand.
2. Optagelse Set-up
- Forbered en wolfram elektrode (7-14 MQ, 127 um diameter, 12 ° konisk spids, epoxy-coated). Superlim elektroden til et glas kapillarrør og tilføje varmekrymperør for greb (figur 1).
- Montere elektrode på en motoriseret (eller hydraulisk) mikromanipulator, indstillet til at rejse vinkelret på den kortikale overflade. Skub en wire jorden under huden mod kraniet. Undgå kontakt med musklerne på den side af hovedet og nakken, da de kan generere elektromyografiske artefakter.
- Forstærke det elektriske signal ved hjælp af et ekstracellulært ampli fi er egnet til enkelt enhed optagelse, fortrinsvis udstyret med en impedans kontrol mode. Overvåge igangværende spiking aktivitet (band pass 300 - 5.000 Hz) med to oscilloskoper og et sæt højttalere med ekstern strømforsyning. Her de indspillede data digitaliseret kontinuerligt ved en samplingfrekvens på 10 kHz; spikes er udvundet offline.
- Advance elektroden gennem agarose, indtil spidsen når overfladen af cortex. Overhold dette trin gennem et mikroskop. "Zero" denne position på mikromanipulator.
- For bedst at tilnærme dybden af optagelsen visuelt bekræfte, at elektroden spids forlader kortikale overflade i en dybde på nul, når tilbagetrækning af elektroden ved afslutningen af en penetration.
BEMÆRK: En uoverensstemmelse mellem manipulator læsning og den observerede elektrode position indikerer, at det er drevet i forhold til vævet. Dette kan være forårsaget af ustabilitet af hjernen eller dyr, eller manipulator drift.- Som en ekstra kontrol for at sikre, atdenne nul set-point svarer til overfladen af cortex, overvåge stimulus fremkaldte feltpotentialer samtidig fremme gennem de første adskillige hundrede mikrometer væv. Ved overvågning af feltpotentialer, sænke den nederste band-pass filter cutoff af den ekstracellulære forstærker til 10 Hz. Bekræfter, at polariteten af den lokale potentiale felt vender omkring en dybde på ~ 100 um, nær laget I / II grænsen 13. Dette er en pålidelig referencepunkt for cortex, men det kan variere for andre corticale områder.
- Montere en optisk fiber koblet til en blå lyskilde (figur 2) på en manuel mikromanipulator. Ved hjælp af mikroskopet, placere spidsen af fiberen så tæt på overfladen af agarosen som muligt. Centrere strålen hvor elektroden træder vævet.
- Regulere produktionen af lyskilden med en styreenhed i stand til at levere et TTL (transistor-transistor logik) pulstog af specificeret bredde og duration- fx en Arduino (figur 3), en computer I / O-kort (som vist) eller en kommercielt tilgængelig impulsgeneratoren.
- Overvåg signal på begge oscilloskoper.
- Måling af total lys effekt (mW) på spidsen af den optiske fiber ved hjælp af en energimåler. Anvende denne værdi til at beregne bestråling (mW / mm 2) ved at dividere med tværsnitsarealet af fiberkernen. Begynde med en intensitet værdi i intervallet 10 - 15 mW / mm2 og justere nedad hvis nødvendigt, indtil artefakter er elimineret.
- Tjek for lette artefakter med elektroden i agarose, klar til at komme ind i vævet. Start søgningen puls toget (f.eks 30 ms lysimpulser, 500 ms interstimulus interval (ISI)).
- Eliminere forbigående lys artefakter (figur 4) ved at flytte den optiske fiber i forhold til elektroden for at ændre vinklen af indfaldende lys. Hvis artefakter fortsætter, kan du prøve at sænke lyseffekten. I the sjældne tilfælde, at artefakter ikke helt kan elimineres (kun minimeret), forlænge varigheden af søgningen puls. Dette kan hjælpe med at identificere sande neuronale spikes.
3. Lige PinP-in '
- Advance elektroden langsomt gennem hjernen ved en hastighed på ca. 1 um / sek. Brug en oscilloskop til at overvåge igangværende aktivitet. På den anden udløse laserimpulserne.
- Lyt for svag "hash" af lys-fremkaldte pigge på audio skærmen, hvilket indikerer, at elektroden nærmer sig en CHR2 + celle og kan ofte opfattes længe før det elektriske signal er synlige på oscilloskopet. Nedsætte hastigheden på forhånd.
BEMÆRK: Hvis cellen ligger direkte i vejen for elektroden, vil lyset fremkaldte aktivitet vokse sig større (og højere). Da elektroden nærmer sig en enkelt interneuron, vil hash løse i små men veldefinerede pigge af ensartet størrelse og form. - Så snart liGHT fremkaldte spikes er store nok til at udløse af individuelt på oscilloskopet, begynde at gøre det. Juster skaleringen på den vandrette akse for at iagttage den nøjagtige form af spike bølgeform.
- Stop og vent til væv bundfælde sig. Modstå fristelsen til at flytte elektroden tættere på cellen. Dette trin er afgørende for en stabil optagelse. Hvis der efter flere minutter signal-til-støj-forhold ikke er forbedret - der er vævet har bundfældet sig, men det har ikke bragt cellen tættere på spidsen af elektroden - forhånd 5 um længere og vente igen.
- Gentag denne proces, indtil enten spids eller truget af virkningspotentialet pålideligt kan indfanges med en spænding tærskel sat godt over støj gulvet (f.eks +/- 300 μV eller mere).
BEMÆRK: Der er en lille risiko for falsk positive eller tvetydighed når PINPing hæmmende interneuroner. De fleste celler kan nemt følge et tog af impulser med en varighed på 30 ms og inter-pulSE interval 500 ms, eller hurtigere, med en pålidelig første spike latenstid på 2-5 ms (figur 5). Størstedelen af PV + celler, i særdeleshed, kan opretholde fyring for en fuld 1 sek (figur 6). Fordi disse er hæmmende neuroner, disynaptic (indirekte) aktivering er ikke en stor bekymring.
- Gentag denne proces, indtil enten spids eller truget af virkningspotentialet pålideligt kan indfanges med en spænding tærskel sat godt over støj gulvet (f.eks +/- 300 μV eller mere).
- Mens du optager, overvåge igangværende aktivitet på den første oscilloskop. Hold et vågent øje med størrelsen og formen af pigge ved hjælp af anden oscilloskop. Bemærk kvaliteten af deres lyd på højttaleren.
- Lytte opmærksomt for bratte ændringer, som indikerer, at cellen er enten at trække for tæt på elektroden (hvor det risikerer at blive spiddet eller beskadiget), eller drive væk. Hvis spikes bliver store og forvrænget, bakke ud; hvis de bliver mindre, fremme elektroden. Bevæg langsomt i 2 um trin.
- Bekræfte kvaliteten af optagelsen post-hoc ved at sammenføje alle spike kurver, opstillet til at toppe eller trug. Variere spænding threshold. På tværs af en bred vifte af tærskelværdier bør der kun være én sammenhængende spike form af ensartet højde (figur 5a).
- Hvis der på noget tidspunkt signalet bliver forurenet med pigge fra en nærliggende neuron, gå videre. Advance langsomt på off-chance for, at elektroden vil passere uden for rækkevidde af den nabocelle, men forbliver i området målneuronen. (Dette er normalt forgæves.)
- Bevæge elektroden gennem hele dybden af cortex (900 + um) i hver penetration. Hvis der ikke lys-responsive neuroner er stødt på efter mange gennemføringer, eller omvendt, er optagelser rutinemæssigt forurenet med pigge fra tilstødende ChR2- celler, så prøv en ny elektrode.
BEMÆRK: Selv inden for et enkelt parti, kan impedansen og drikkepenge geometri af de enkelte elektroder variere betydeligt. Begge faktorer bidrager til den effektive "lytter radius" af elektroden, som skal være stor nok til at detektere lys-fremkaldte spikes while søgning, endnu begrænset nok til, at du optager et enkelt interneuron i isolation. - Test impedans af elektroder som ønsket. At undgå at beskadige væv, gøre dette med spidsen af elektroden i den øvre del af agarose lag, godt uden for hjernen. I intervallet 7-14 MQ den nøjagtige impedans er ikke en sikker indikator for ydeevne eller udbytte for denne ansøgning. Når det er sagt, er det en rimelig proxy for at lytte radius: lavere impedanselektroder afhente flere enheder; højere impedans, færre.
- Ved afslutningen af eksperimentet aflive dyret ved institutionelt godkendt midler, såsom anæstetiske overdosering eller cervikal dislokation under en dyb plan af anæstesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi her deler vores strategi for at opnå single-unit optagelser fra genetisk klassificerede hæmmende interneuroner i den bedøvede mus cortex, ved hjælp af en optogenetic metode udviklet af Lima et al. 1.. Tabel 1 detaljer den foreslåede bedøvelsesmiddel cocktail, Ketamin-Medetomidin-acepromazin (" KMA "). Figur 1 afbilder en wolfram mikroelektrode fremstillet til optagelse. Figur 2 indeholder et kredsløbsdiagram for en simpel LED styreenhed. Figur 3 indeholder konfigurationen og kode for gating lysoutput med en Arduino microcontroller. Figur 4 viser et eksempel på lys-induceret elektriske artefakter drøftet i protokollen. Artefakter er lejlighedsvis stødt (venstre panel), men let korrigeret (højre panel). Figur 5 viser eksempel optagelser fra tre typer af optisk identificerede interneuroner (PV +, CR +, og SOM +). Den venstre panel viser rå spænding spor og tilpasset kurver, repræsentant for den form for signal-til-støj-forhold kan man forvente at opnå med denne strategi. Spikes er pålideligt fanget med en fast spænding tærskel på flere hundrede mikrovolt. Et raster plot (højre panel) viser den korte ventetid og pålideligheden af lys-fremkaldte reaktioner, der muliggør entydig identifikation af CHR2 positive interneuroner. Figur 6 viser spænding spor fra tre PV + interneuroner, reagerer på en 1 sek lys puls. Størstedelen af PV + celler kan opretholde højfrekvente fyring for hundreder af millisekunder, hvilket gør dem særligt let at identificere.
Figur 1. Forberedelse af en elektrode. (A) Diagram af en forberedt elektrode. Elektroden affiXED til et glas kapillarrør ved hjælp af to små dråber af Super Glue og en minimal mængde af accelerator (såsom Zap-It). Tilsættes varmekrymperør for greb, ved hjælp af meget lav varme. Elektroder sendes typisk med konnektorstift pre-attached. (B) Fotografi af en forberedt wolfram mikroelektrode monteret i en elektrode holder.
Figur 2. Kredsløbsdiagram for en LED styreenhed. En enkel og billig kredsløb for lys levering. En super-lysende LED (475 nm) er fastgjort til en varmeveksler og koblet til den anden ende af et fiberoptisk kabel (800 um diameter). Udgangen af LED er gated med en TTL puls. Styreenheden omfatter en spænding-mode strømforsyning til justerbar lysintensitet. 2K POT: potentiometer til at styre lys intensitet. P / S: DC power supp ly (fx bærbare oplader). TIP 122: Darlington transistor. 4N35: Optisk isolator. De dele, der er anført her koste <$ 10.
Figur 3. Arduino kode og konfiguration. En TTL puls toget til gating lysudbytte kan genereres ved hjælp af en Arduino microcontroller. I programmet præciseres en puls varighed og ISI for en looping puls tog. Instruktioner til indlæsning af programmet på bordet kan findes på Arduino s "Introduktion" side ( http://arduino.cc/en/Guide/HomePage ). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
igur 4 "fo: content-width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 51757 / 51757fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
. Figur 4. Light artefakt metalelektroder er modtagelige for lys artefakter, til stede ved starten og modregning af bælgfrugter (venstre panel, filtrerede signal, 300 - 5.000 Hz). De kan normalt elimineres fuldstændigt (højre panel) ved at flytte den optiske fiber i forhold til elektroden for at ændre vinklen af indfaldende lys og / eller nedsætte lyseffekten.
Figur 5. Eksempel celler. (A) Typisk eksempel optagelser fra optisk identificerede interneuroner, PV + (lilla), CR + (grøn), SOM + (rød). Celler reagerer på søgningen puls toget (impulsvarighed 30 ms, ISI 500 ms) med en pålidelig byge af spikes. Panelet til højre viser 100 trough alliancefrie pigge og. den gennemsnitlige interpoleret bølgeform (10x oversamplet fra en samplingfrekvens på 10 kHz) (B) Raster grunde til de samme filer viser den korte ventetid (~ 2. - 5. ms). og konsekvent timing af lys-fremkaldte pigge (C) Mean og standardafvigelse af første spike latenstider (5 - 10 pulser) for en stikprøve på 44 PV + interneuroner (gennemsnitlig middelværdi og standardafvigelse: 3,4 +/- 2,6 ms). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. Eksempler på vedvarende reaktioner Man kan især være sikker på at identificere PV + interneuroner som de fleste af dem kan opretholde højfrekvente fyring for hundreder af millisekunder -. Minder om deres svar på aktuelleinjektion in vitro 14. Tre CHR2 / solceller responderer på 1 sek lysimpulser: to, der ild regelmæssigt i løbet af hele varigheden af pulsen, og en usædvanlig eksempel på en celle, der ikke gør det (<10% af stødt celler).
| KMA (20,0 ml) | |||
| 2 ml 100 mg / ml ketamin (10 mg / ml, når fortyndet) | |||
| 0,4 ml af 1 mg / ml Dexdomitor (medetomidin; 0,02 mg / ml, når fortyndet) | |||
| 0,05 ml 100 mg / ml acepromazin (0,25 mg / ml, når fortyndet) | |||
| 17.55 ml 0,9% saltvand | |||
| Dosering, voksne mus (15-40 g) | |||
| Knock-down: 0,012 ml / g * kropsmasse (Ketamin = 120 mg / kg) | |||
| Vedligeholdelse: 0,0025 ml / g * kropsmasse (Ketamin = 25 mg / kg) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChR2-EYFP Line | Jackson Colonies | 12569 | |
| Pvalb-iCre (PV) Line | Jackson Colonies | 8069 | |
| Sst-iCre (SOM) Line | Jackson Colonies | 13044 | |
| Cr-iCre (CR) Line | Jackson Colonies | 10774 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | Type III-A, High EEO |
| Micro Point (dural hook) | FST | 10066-15 | |
| Surgical Scissors | FST | 14084-09 | |
| Scalpel | FST | 10003-12 (handle), 10011-00 (blades) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Foster & Smith | 9N-76855 | |
| Homeothermic Blanket | Harvard Apparatus | 507220F | |
| Tungsten Microelectrodes | A-M Systems | 577200 | 12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated |
| Capillary Glass Tubing | Warner Instruments | G150TF-3 | |
| Heat Shrink Tubing | DigiKey | A332B-4-ND | |
| Zapit Accelerator | DVA | SKU ZA/ZAA | Use with standard Super Glue. |
| Microelectrode AC Amplifier 1800 | AM Systems | 700000 | |
| MP-285 Motorized Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| 4-channel Digital Oscilloscopes | Tektronix | TDS2000C | |
| Powered Speakers | Harman | Model JBL Duet | |
| Manual Manipulator | Scientifica | LBM-7 | |
| 800 µm Fiber Optic Patch Cable | ThorLabs | FC/PC BFL37-800 | |
| Power Meter | ThorLabs | PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor) | |
| 475 nm Cree XLamp XP-E | DigiKey | XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND | LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com). |
| Arduino UNO | DigiKey | 1050-1024-ND |
References
- Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, (2009).
- Moore, A. K., Wehr, M. Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency. J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).
- Merchant, H., de Lafuente, V., Pena-Ortega, F., Larriva-Sahd, J. Functional impact of interneuronal inhibition in the cerebral cortex of behaving animals. Prog Neurobiol. 99, 163-178 (2012).
- Markram, H., et al. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nat Rev Neurosci. 5, 793-807 (2004).
- Atallah, B. V., Bruns, W., Carandini, M., Scanziani, M. Parvalbumin-expressing interneurons linearly transform cortical responses to visual stimuli. Neuron. 73, 159-170 (2012).
- Wilson, N. R., Runyan, C. A., Wang, F. L., Sur, M. Division and subtraction by distinct cortical inhibitory networks in vivo. Nature. 488, 343-348 (2012).
- Letzkus, J. J., et al. A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex. Nature. 480, 331-335 (2011).
- Pi, H. J., et al. Cortical interneurons that specialize in disinhibitory control. Nature. 503, 521-524 (2013).
- Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. A neural circuit for spatial summation in visual cortex. Nature. 490, 226-231 (2012).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3, 159 (2005).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
- Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex. J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8, 70553 (2013).
Tags
Neuroscience optogenetics Channelrhodopsin CHR2 cortex,
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
