Abstract
En stor utmaning i neurofysiologi har varit att karaktärisera egenskaper respons och funktion av de många typer hämmande cell i hjärnbarken. Vi här delar vår strategi för att uppnå stabila, väl isolerade singel inspelningar från identifierade hämmande intern i sövda mus cortex med en metod som utvecklats av Lima och kollegor 1. Inspelningarna sker i möss som uttrycker channelrhodopsin-2 (ChR2) i specifika neuronala subpopulationer. Medlemmar av befolkningen identifieras genom deras svar på en kort blixt av blått ljus. Denna teknik - kallas "PINP", eller photostimulation-assisterad Identifiering av neuronala populationer - kan genomföras med standard extracellulärt färdskrivare. Det kan fungera som ett billigt och lättillgängligt alternativ till kalcium avbildning eller visuellt guidad lapp, för att rikta extracellulära inspelningar till genetiskt identifierade celler. Here vi tillhandahåller en uppsättning riktlinjer för optimering av metoden i det dagliga arbetet. Vi förfinat vår strategi specifikt för inriktning parvalbumin-positiva (PV +) celler, men har funnit att det fungerar för andra typer interneuronen också, såsom somatostatin-uttryck (SOM +) och calretinin-uttryck (CR +) interneuronen.
Protocol
OBS: Följande protokoll är enligt National Institutes of Health riktlinjer som godkändes av University of Oregon Animal Care och användning kommittén.
1. Akut kirurgi
- Söva djuret med en ketamin-medetomidin cocktail, via intraperitoneal (ip) injektion (tabell 1).
OBS: De möss som användes i dessa experiment genereras genom att korsa en cre-beroende ChR2-EYFP transgen Line10 att interneuronen drivrutins linjer (Pvalb-iCre11, PV +; Sstl-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR ^). Viral leverans av ChR2 eller liknande opsins bör fungera lika bra, förutsatt liknande uttrycksnivåer erhålls. - Innan operation, se till att djuret inte uppvisar någon respons på en mild tå nypa. Åter administrera anestetika under experimentet efter behov för att upprätthålla denna anestesidjupet. Om du använder injicerbara anestetika, eventuellt implantera en ip kateter för underhålls injektioner.
- Hålla djuret hydratiseras med koksaltlösning eller lakterad Ringers lösning under hela experimentet (cirka 3 ml / kg / h), till exempel genom användning av en lämpligt utspädd bedövningsmedel cocktail för underhålls injektioner (tabell 1).
- Placera djuret i en stereotaxisk eller annat huvud hållande anordningen. Se till att skallen är väl säkrad. Detta är nödvändigt för att upprätthålla stabila encelliga inspelningar.
- Applicera opthalamic salva till ögonen för att förhindra torrhet. Bibehålla kroppstemperaturen vid 36,5 till 37 ° C.
- Utför en cisternal avlopp för ytterligare inspelningar stabilitet. Med hjälp av en skalpell blad, ta bort vävnad från den bakre ytan av skallen att exponera cisterna magna. Gör en liten nick i dura att dränera cerebrospinalvätskan. Använd endast den yttersta spetsen av bladet, och undvika kontakt med lillhjärnan eller hjärnstammen.
- Med hjälp av skalpell, gör en liten kraniotomi (~ 2 mm 2) över den kortikala område av intresse (för hörselcortex, ungefär -2,3 mm posteriort om bregma, 4,5 mm lateralt om mittlinjen).
- Avlägsna dura och täcka den exponerade kortex med ett skikt av varm agaros 0,5-1 mm tjock (1,5% agaros i koksaltlösning, 0,9% NaCl; tillämpas vid ~ 37 ° C). Håll agaros fuktiga under hela experimentet genom att regelbundet applicera flera droppar saltlösning.
2. Inspelning Set-up
- Förbered en volframelektrod (7-14 Mohm, 127 um i diameter, 12 ° avsmalnande spets, epoxy-belagt). Superlim elektroden till ett glaskapillärrör och lägga till krympslang för grepp (Figur 1).
- Montera elektroden på en motordriven (eller hydraulisk) mikromanipulator, inställd resa vinkelrät mot den kortikala ytan. Skjut ett trådbotten under huden mot skallen. Undvik kontakt med musklerna på sidan av huvudet och nacken, eftersom de kan generera elektromyografiska artefakter.
- Förstärk den elektriska signalen med hjälp av ett extracellulärt förstärkareli fi er lämplig för enstyckstillverkning inspelning, företrädesvis utrustad med en impedans check mode. Övervaka pågående tillsatta aktivitet (bandpass 300 - 5.000 Hz) med två oscilloskop och en uppsättning av aktiva högtalare. Här är inspelade data digitaliseras kontinuerligt med en samplingsfrekvens på 10 kHz; spikar utvinns offline.
- Advance elektroden genom agarosen tills spetsen når ytan av cortex. Observera detta steg genom ett mikroskop. "Zero" denna position på mikromanipulator.
- För att bäst approximera djup av inspelning, visuellt bekräfta att elektrodspetsen utträder den kortikala ytan på ett djup av noll när man tar ut elektroden vid slutet av en penetrering.
ANMÄRKNING: En avvikelse mellan manipulatorn behandlingen och den observerade elektrod position indikerar att den har förskjutits i förhållande till vävnaden. Detta kan orsakas av instabilitet i hjärnan eller djur, eller manipulator drift.- Som en extra kontroll för att säkerställa attdetta noll börvärde motsvarar ytan av cortex, övervaka stimulus framkallade fält potentialer samtidigt avancera genom de första flera hundra mikrometer vävnad. Vid övervakning av fältpotentialer, sänka den nedre bandpassfilter cutoff av den extracellulära förstärkaren till 10 Hz. Bekräfta att polariteten hos den lokala fältpotential reverserar runt ett djup av ~ 100 | im, i närheten av skiktet I / II-gränsen 13. Detta är en pålitlig referenspunkt för hörselbarken, men det kan variera för andra kortikala områden.
- Montera en optisk fiber kopplad till en blå ljuskälla (figur 2) på en manuell mikromanipulator. Användning av mikroskopet, placera spetsen på fibern så nära ytan av den agaros som möjligt. Centrera strålen där elektroden kommer in i vävnaden.
- Reglera utsignalen från ljuskällan med en styrenhet som kan leverera en TTL (transistor-transistorlogik) pulståg med specificerad bredd och duration- t.ex. en Arduino (figur 3), en dator-I / O-kort (som visas), eller en kommersiellt tillgänglig pulsgeneratorn.
- Övervaka signalen på båda oscilloskop.
- Mäta total ljuseffekt (mW) vid spetsen av den optiska fibern med användning av en kraftmätare. Använd detta värde för att beräkna irradians (mW / mm2) genom att dividera med den tvärsnittsarea av fiberkärnan. Börja med ett intensitetsvärde i intervallet 10 till 15 mW / mm 2 och justera ner om så behövs, tills artefakter elimineras.
- Kontrollera för lätta artefakter med elektroden i agaros, redo att gå in i vävnaden. Starta sökningen pulståget (t.ex. 30 msek ljuspulser, 500 msek interstimulus intervall (ISI)).
- Eliminera gående ljus artefakter (Figur 4) genom att flytta den optiska fibern i förhållande till elektroden för att ändra vinkeln på det infallande ljuset. Om artefakter kvarstår kan du försöka minska ljuseffekt. I the sällsynta fall då artefakter inte helt kan elimineras (endast minimeras), förlänga sökpulsen. Detta kan hjälpa till att identifiera verkliga neuronala spikar.
3. Raka PINP-in "
- Advance elektroden långsamt genom hjärnan med en hastighet av ca 1 ^ m / sek. Använd ett oscilloskop för att övervaka pågående verksamhet. Å andra, utlösa laserpulserna.
- Lyssna för svag "hash" av ljus framkallade spikar på ljudskärmen, vilket tyder på att elektroden närmar sig en ChR2 + cell och kan ofta uppfattas i god tid innan den elektriska signalen framgår på oscilloskopet. Sakta hastigheten förväg.
OBS: Om cellen ligger direkt i vägen för elektroden, kommer ljuset-framkallade verksamhet växa sig större (och högre). Eftersom elektroden närmar sig ett enda interneuronen kommer hash lösa i små men väldefinierade spikar av enhetlig storlek och form. - Så snart som liGHT-framkallade spikar är tillräckligt stor för att utlösa av individuellt på oscilloskopet, börja att göra så. Justera skalning på den horisontella axeln för att observera den exakta formen på dubben vågformen.
- Stoppa och vänta på att vävnaden sedimentera. Motstå frestelsen att flytta elektroden närmare cellen. Detta steg är kritiskt för en stabil inspelning. Om efter flera minuter signal-till-brus-förhållandet inte har förbättrats - det vill säga vävnaden har lagt sig, men det har inte fört cellen närmare till spetsen på elektroden - förhands 5 pm längre och vänta igen.
- Upprepa denna process tills antingen topp eller tråget av aktionspotentialen tillförlitligt kan fångas med en spänningströskel satts långt över brusgolvet (t.ex. +/- 300 μV eller mer).
OBS: Det finns lite risk för falskt positiva eller tvetydighet PINPing hämmande intern. De flesta celler kan enkelt följa en följd av pulser med varaktigheten 30 msek och inter-pulse intervallet 500 ms eller snabbare, med en pålitlig första spik latens på 2-5 ms (Figur 5). Majoriteten av PV + celler, i synnerhet, kan upprätthålla bränning för en full 1 sek (Figur 6). Eftersom dessa är hämmande nervceller, är disynaptic (indirekt) aktivering inte ett stort problem.
- Upprepa denna process tills antingen topp eller tråget av aktionspotentialen tillförlitligt kan fångas med en spänningströskel satts långt över brusgolvet (t.ex. +/- 300 μV eller mer).
- Under inspelningen, övervaka pågående verksamhet på den första oscilloskopet. Håll ett vakande öga på storleken och formen på spikar genom att använda andra oscilloskop. Notera kvaliteten på deras sound på högtalaren.
- Lyssna uppmärksamt för plötsliga förändringar, som visar att cellen antingen rita för nära elektroden (där den riskerar att spetsas eller skadad), eller driver iväg. Om spikarna blir stora och förvrängd, backa ut; om de växer mindre, avancera elektroden. Rör långsamt i 2 ^ m steg.
- Bekräfta kvaliteten på inspelningen post hoc genom att överlagra alla spik vågformer, inriktade till topp eller tråg. Variera spännings threshåll. Inom ett brett spektrum av tröskelvärden bör det alltid bara finnas en konsekvent spik form av enhetlig höjd (figur 5a).
- Om det vid något tillfälle signalen blir förorenad med spikar från en närliggande neuron, gå vidare. Förskotts långsamt, på off-chansen att elektroden kommer att passera utom räckhåll för den angränsande cellen, men finns kvar i avståndet till målet neuron. (Detta är oftast misslyckas.)
- Flytta elektroden genom hela djupet av cortex (900+ im) i varje penetration. Om inga ljuskänsliga nervceller påträffas efter många genomföringar eller, omvänt, är inspelningar rutinmässigt kontaminerade med spikar från angränsande ChR2- celler, prova en ny elektrod.
OBS: Även inom ett enda parti, kan impedansen och dricks geometri enskilda elektroder variera avsevärt. Båda dessa faktorer bidrar till den effektiva "lyssnar radie" av elektroden, vilket måste vara tillräckligt stor för att upptäcka ljus framkallade spikar while söka, men begränsas tillräckligt för att spela in en enda interneuronen isolerat. - Testa impedansen av elektroder som önskat. För att undvika att skada vävnad, göra detta med spetsen på elektroden i den övre delen av den agaros skiktet, väl utanför hjärnan. Inom intervallet 7-14 Mohm, är den exakta impedansen inte en säker prediktor för prestation, eller avkastning, för denna applikation. Som sagt, det är en rimlig proxy för att lyssna radie: lägre impedans elektroder plocka upp fler enheter; högre impedans, färre.
- Vid slutet av experimentet, avliva djuret genom institutionellt-godkända medel, såsom bedövningsmedel överdos eller cervikal dislokation under ett djup plan av anestesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi här delar vår strategi för att få en enda enhet inspelningar från genetiskt klassificerade hämmande intern i sövda mus cortex, med hjälp av en optogenetic metod utvecklad av Lima et al. 1. Tabell 1 detaljer den föreslagna narkos cocktail, Ketamin-Medetomidin-acepromazin (" KMA "). Figur 1 visar en volframmikroelektrod, framställd för inspelning. Figur 2 innehåller ett kretsschema för en enkel LED-styrenhet, fig. 3 innehåller den konfiguration och kod för att grinda ljusflöde med en Arduino mikrokontroller. Figur 4 visar ett exempel på ljusframkallade elektriska artefakter diskuteras i protokollet. Artefakter ibland stött på (till vänster), men lätt korrigeras (högra panelen). Figur 5 visar exempel på inspelningar från tre typer av optiskt identifierade interneuronen (PV +, CR +, och SOM +). Den vänstra panel visar rå spännings spår och inriktade vågformer, representativ för den typ av signal-till-brus-förhållande kan man förvänta sig att få med denna strategi. Spikes tillförlitligt fångas med en fast spänning på flera hundra mikrovolt. Ett raster plot (högra panelen) visar kort latens och tillförlitlighet ljus framkallade svar, som möjliggör entydig identifiering av ChR2-positiva interneuronen. Figur 6 visar spännings spår från tre PV + interneuronen, svara på en 1 sek ljuspuls. Majoriteten av PV + celler kan upprätthålla högfrekventa bränning för hundratals millisekunder, vilket gör dem särskilt lätt att identifiera.
Figur 1. Preparering av en elektrod. (A) Diagram av en preparerad elektrod. Elektroden är Affixed till ett glas kapillärrör med användning av två små droppar av superlim och en minimal mängd av accelerator (såsom Zap-It). Krympslang läggs för grepp, med hjälp av mycket låg värme. Elektroder skickas normalt med en anslutningsstift förmonterad. (B) Fotografera av en förberedd volfram mikroelektrod monterad i en elektrodhållare.
Figur 2. Kretsschema för en LED-styrenhet. Ett enkelt och billigt krets för lätta leverans. En super-ljusstark LED (475 nm) är fäst vid en värmesänka och som är kopplad till den andra änden av en fiberoptisk kabel (800 | j, m diameter). Utgången av LED är gated med en TTL puls. Styrenheten innehåller en spännings nätaggregat för justerbar ljusintensitet. 2K POT: potentiometer för att styra ljusintensiteten. P / S: DC supp ly (t.ex. laptop laddare). Tips 122: Darlington transistor. 4N35: Optisk isolator. De delar som anges här kostar <$ 10.
Figur 3. Kan genereras Arduino kod och konfigurering. En TTL pulståget för att grinda ljus med hjälp av en Arduino mikrokontroller. I programmet redovisas en pulslängd och ISI för en looping pulståg. Instruktioner för laddning av programmet på brädet finns på Arduinos "Komma igång" sida ( http://arduino.cc/en/Guide/HomePage ). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
igure 4 "fo: innehålls width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 51757 / 51757fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
. Figur 4. Ljus artefakt Metall elektroder är känsliga för ljus artefakter, närvarande vid starten och den förskjutna pulser (vänstra panelen, filtrerad signal, 300 - 5.000 Hz). De kan vanligen elimineras fullständigt (högra panelen) genom att flytta den optiska fibern i förhållande till elektroden för att ändra vinkeln av infallande ljus, och / eller minskning av ljuseffekten.
Figur 5. Exempel celler. (A) Typiska exempel inspelningar från optiskt identifierade interneuronen, PV + (lila), CR + (grön), SOM + (röd). Celler svarar på sökningen pulståg (pulslängd 30 ms, ISI 500 ms) med en pålitlig explosion av spikar. Panelen till höger visar 100 tråg inriktade spikar och. den genomsnittliga interpolerade vågformen (10x översamplas från en samplingsfrekvens på 10 kHz) (B) Raster tomter för samma filer visar kort latens (~ 2-5 msek). och konsekvent tidpunkten för ljus framkallade spikar (C) Medel och standardavvikelse av första spik latenser (5-10 pulser) för ett urval av 44 PV + interneuronen (genomsnittlig medelvärde och standardavvikelse: 3,4 +/- 2,6 msek). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Exempel på ihållande svar Man kan vara särskilt säker på att identifiera PV + interneuronen eftersom majoriteten av dem kan upprätthålla högfrekventa bränning för hundratals millisekunder -. Påminner om deras svar på ströminjektion in vitro 14. Tre ChR2 / solceller svarar på 1 sek ljuspulser: två som eld regelbundet under hela den tid som pulsen, och ett ovanligt exempel på en cell som inte (<10% av stött celler).
| KMA (20,0 ml) | |||
| 2 ml av 100 mg / ml ketamin (10 mg / ml, en gång efter utspädning) | |||
| 0,4 ml av 1 mg / ml DEXDOMITOR (medetomidin; 0,02 mg / ml, en gång efter utspädning) | |||
| 0,05 ml av 100 mg / ml Acepromazin (0,25 mg / ml, en gång efter utspädning) | |||
| 17,55 ml 0,9% saltlösning | |||
| Dosering, vuxen mus (15-40 g) | |||
| Knock-down: 0,012 ml / g * kroppsmassa (Ketamin = 120 mg / kg) | |||
| Underhåll: 0,0025 ml / g * kroppsmassa (Ketamin = 25 mg / kg) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChR2-EYFP Line | Jackson Colonies | 12569 | |
| Pvalb-iCre (PV) Line | Jackson Colonies | 8069 | |
| Sst-iCre (SOM) Line | Jackson Colonies | 13044 | |
| Cr-iCre (CR) Line | Jackson Colonies | 10774 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | Type III-A, High EEO |
| Micro Point (dural hook) | FST | 10066-15 | |
| Surgical Scissors | FST | 14084-09 | |
| Scalpel | FST | 10003-12 (handle), 10011-00 (blades) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Foster & Smith | 9N-76855 | |
| Homeothermic Blanket | Harvard Apparatus | 507220F | |
| Tungsten Microelectrodes | A-M Systems | 577200 | 12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated |
| Capillary Glass Tubing | Warner Instruments | G150TF-3 | |
| Heat Shrink Tubing | DigiKey | A332B-4-ND | |
| Zapit Accelerator | DVA | SKU ZA/ZAA | Use with standard Super Glue. |
| Microelectrode AC Amplifier 1800 | AM Systems | 700000 | |
| MP-285 Motorized Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| 4-channel Digital Oscilloscopes | Tektronix | TDS2000C | |
| Powered Speakers | Harman | Model JBL Duet | |
| Manual Manipulator | Scientifica | LBM-7 | |
| 800 µm Fiber Optic Patch Cable | ThorLabs | FC/PC BFL37-800 | |
| Power Meter | ThorLabs | PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor) | |
| 475 nm Cree XLamp XP-E | DigiKey | XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND | LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com). |
| Arduino UNO | DigiKey | 1050-1024-ND |
References
- Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, (2009).
- Moore, A. K., Wehr, M. Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency. J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).
- Merchant, H., de Lafuente, V., Pena-Ortega, F., Larriva-Sahd, J. Functional impact of interneuronal inhibition in the cerebral cortex of behaving animals. Prog Neurobiol. 99, 163-178 (2012).
- Markram, H., et al. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nat Rev Neurosci. 5, 793-807 (2004).
- Atallah, B. V., Bruns, W., Carandini, M., Scanziani, M. Parvalbumin-expressing interneurons linearly transform cortical responses to visual stimuli. Neuron. 73, 159-170 (2012).
- Wilson, N. R., Runyan, C. A., Wang, F. L., Sur, M. Division and subtraction by distinct cortical inhibitory networks in vivo. Nature. 488, 343-348 (2012).
- Letzkus, J. J., et al. A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex. Nature. 480, 331-335 (2011).
- Pi, H. J., et al. Cortical interneurons that specialize in disinhibitory control. Nature. 503, 521-524 (2013).
- Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. A neural circuit for spatial summation in visual cortex. Nature. 490, 226-231 (2012).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3, 159 (2005).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
- Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex. J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8, 70553 (2013).
Tags
Neurovetenskap optogenetik channelrhodopsin ChR2 cortex,
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
