Abstract
Un reto importante en la neurofisiología ha sido caracterizar las propiedades de respuesta y función de los numerosos tipos de células inhibitorio en la corteza cerebral. Estamos aquí compartimos nuestra estrategia para obtener, bien aisladas grabaciones de una sola unidad estables de interneuronas inhibitorias identificados en la corteza del ratón anestesiado utilizando un método desarrollado por Lima y sus colegas 1. Las grabaciones se realizaron en ratones que expresan canalrodopsina-2 (ChR2) en subpoblaciones neuronales específicas. Los miembros de la población se identifican por su respuesta a un breve destello de luz azul. Esta técnica - denominada "PINP", o identificación asistida Fotoestimulación de poblaciones neuronales - se pueden implementar con equipos estándar de grabación extracelular. Puede servir como una alternativa económica y accesible para imágenes de calcio o parches visualmente guiada, con el fin de apuntar a registros extracelulares a las células genéticamente identificados. HERE proporcionamos un conjunto de directrices para la optimización del método en la práctica cotidiana. Nosotros refinamos nuestra estrategia específicamente para atacar a las células parvalbúmina-positivo (VP +), pero hemos encontrado que funciona para otros tipos de interneuronas, así, como (CR +) interneuronas calretinin expresan somatostatina-expresión (SOM +) y.
Protocol
NOTA: El siguiente protocolo es de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud aprobado por la Universidad de Oregon Cuidado de Animales y el empleo Comisión.
1. Cirugía aguda
- Anestesiar al animal con un cóctel de ketamina-medetomidina, a través de inyección intraperitoneal (ip) (Tabla 1).
NOTA: Los ratones utilizados en estos experimentos se generan por el cruce de una línea 10 ChR2-eYFP transgénico cre-dependiente interneurona conductor líneas (PVALB-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Entrega viral de ChR2 o opsinas relacionados debería funcionar igual de bien, en el supuesto se obtienen los niveles de expresión similares. - Antes de comenzar la cirugía, asegúrese de que las exhibiciones de animales sin respuesta a una pizca dedo del pie suave. Re-administrar anestésicos durante todo el experimento como sea necesario para mantener esta profundidad de la anestesia. Si el uso de anestésicos inyectables, opcionalmente implantar un catéter para las inyecciones ip de mantenimiento.
- Mantenga el animal hidratado con solución salina o solución de lactato de Ringer durante todo el experimento (aproximadamente 3 ml / kg / hr), por ejemplo mediante el uso de un cóctel anestésico diluido apropiadamente para las inyecciones de mantenimiento (Tabla 1).
- Colocar el animal en un aparato de retención de la cabeza estereotáxico o de otro tipo. Asegúrese de que el cráneo está bien respaldado. Esto es esencial para el mantenimiento de registros de células individuales estables.
- Aplicar ungüento opthalamic a los ojos para evitar la sequedad. Mantener la temperatura corporal a 36,5 a 37 ° C.
- Realizar un desagüe de la cisterna para la estabilidad de grabación adicional. Uso de una hoja de bisturí, extirpar tejido de la cara posterior del cráneo para exponer la cisterna magna. Haga una pequeña incisión en la duramadre para drenar el líquido cefalorraquídeo. Utilice sólo la punta de la hoja, y evitar el contacto con el cerebelo o el tronco encefálico.
- Utilizando el bisturí, lleve a cabo una pequeña craneotomía (~ 2 mm 2) sobre la zona cortical de interés (por auditivacorteza, aproximadamente -2.3 mm por detrás del bregma, 4,5 mm lateral de la línea media).
- Retire la duramadre y cubrir la corteza expuesta con una capa de agarosa caliente 0,5-1 mm de espesor (1,5% de agarosa en solución salina, 0,9% de NaCl, aplicar a ~ 37 ° C). Mantenga la humedad de agarosa durante todo el experimento mediante la aplicación periódicamente varias gotas de solución salina.
2. Grabación de Set-up
- Prepare un electrodo de tungsteno (7-14 MΩ, 127 m de diámetro, 12 ° punta cónica, recubierta con epoxi). Superglue el electrodo a un tubo capilar de vidrio y agregar tubería de encogimiento de calor para un mejor agarre (Figura 1).
- Montar el electrodo en un micromanipulador motorizado (o hidráulico), ajuste a viajar ortogonal a la superficie cortical. Deslice una planta de alambre debajo de la piel, contra el cráneo. Evitar el contacto con los músculos en el lado de la cabeza y la parte posterior del cuello, ya que pueden generar artefactos electromiográficos.
- Amplificar la señal eléctrica de usar un amplificador extracelularli fi cador adecuado para la grabación de una sola unidad, preferiblemente equipado con un modo de comprobación de la impedancia. Supervisar la actividad de clavar en curso (banda de paso 300 - 5000 Hz) con dos osciloscopios y un conjunto de altavoces con alimentación. Aquí, los datos grabados se digitaliza continuamente a una velocidad de muestreo de 10 kHz; picos se extraen fuera de línea.
- Avanzar en el electrodo a través de la agarosa hasta que la punta alcanza la superficie de la corteza. Observe este paso a través de un microscopio. "Cero" esta posición en el micromanipulador.
- Para aproximar mejor la profundidad de la grabación, confirme visualmente que la punta del electrodo sale de la superficie cortical a una profundidad de cero al retirar el electrodo al final de una penetración.
NOTA: Una discrepancia entre la lectura manipulador y la posición del electrodo observada indica que se ha desplazado con relación al tejido. Esto puede ser causado por la inestabilidad del cerebro o animal, o la deriva manipulador.- Como una comprobación adicional para asegurar queeste conjunto de punto cero corresponde a la superficie de la corteza, controlar los potenciales de campo de estímulo-evocó mientras se avanza a través de los primeros varios cientos de micrómetros de tejido. Cuando el seguimiento de los potenciales de campo, baje el filtro de paso de banda de corte inferior del amplificador extracelular a 10 Hz. Compruebe que la polaridad del potencial de campo local invierte alrededor de una profundidad de ~ 100 m, cerca de la capa de frontera I / II 13. Este es un punto de referencia fiable para la corteza auditiva, pero puede diferir de otras áreas corticales.
- Montar una fibra óptica acoplada a una fuente de luz azul (Figura 2) sobre un micromanipulador manual. Usando el microscopio, coloque la punta de la fibra tan cerca de la superficie de la agarosa como sea posible. Centre el haz en el que el electrodo entra en el tejido.
- Regular la salida de la fuente de luz con una unidad de control capaz de suministrar un TTL (lógica transistor-transistor) de tren de pulsos de anchura y duratio especificadon- por ejemplo, un Arduino (Figura 3), una tarjeta de computadora I / O (como se muestra), o un generador de impulsos disponibles comercialmente.
- Monitorear la señal en ambos osciloscopios.
- Medir la potencia total de la luz (mW) en la punta de la fibra óptica usando un medidor de potencia. Utilice este valor para calcular la irradiancia (mW / mm 2) dividiendo por el área de sección transversal del núcleo de fibra. Comenzar con un valor de intensidad en el intervalo de 10 - 15 mW / mm 2 y ajustar a la baja si es necesario, hasta que se eliminan los artefactos.
- Compruebe si hay artefactos de luz con el electrodo en la agarosa, a punto de entrar en el tejido. Iniciar la búsqueda de tren de pulsos (por ejemplo, 30 pulsos de luz ms, 500 ms intervalo inter (ISI)).
- Eliminar artefactos de luz transitorios (Figura 4) por reposicionamiento de la fibra óptica con respecto al electrodo para cambiar el ángulo de la luz incidente. Si artefactos persisten, pruebe a reducir el poder de la luz. En ªe caso raro que los artefactos no pueden ser eliminados por completo (sólo minimizado), extender la duración del pulso de búsqueda. Esto puede ayudar en la identificación de verdaderos picos neuronales.
3. Recta PINP-in '
- Avance el electrodo lentamente a través del cerebro a una velocidad de aproximadamente 1 m / seg. Utilice un osciloscopio para monitorear la actividad en curso. Por el otro, desencadenar los pulsos de láser.
- Escuchar para el 'de hash' débiles de picos de luz evocado en el monitor de audio, que indica que el electrodo se aproxima a una célula ChR2 + y, a menudo puede ser percibido mucho antes de que la señal eléctrica es aparente en el osciloscopio. Disminuya la velocidad de avance.
NOTA: Si la celda se encuentra directamente en la trayectoria del electrodo, la actividad de la luz-evocó crecerá más grande (y más fuerte). A medida que el electrodo se acerca un solo interneurona, el hash resolverá en pequeños pero bien definidos picos de tamaño uniforme y forma. - Tan pronto como lipicos GHT-evocado son lo suficientemente grandes como para desencadenar de forma individual en el osciloscopio, comienzan hacerlo. Ajuste la escala en el eje horizontal para observar la forma exacta de la forma de onda de pico.
- Parar y esperar a que el tejido se asiente. Resista la tentación de mover el electrodo más cerca de la celda. Este paso es crítico para una grabación estable. Si después de varios minutos, la relación señal-ruido no ha mejorado - es decir, el tejido se ha asentado, pero no ha llevado a la celda más cerca de la punta del electrodo - avance 5 m más allá y esperar de nuevo.
- Repita este proceso hasta que el pico o el comedero del potencial de acción se pueden capturar de forma fiable con un umbral de tensión fijado muy por encima del ruido de fondo (por ejemplo, +/- 300 mV o más).
NOTA: Hay poco riesgo de falsos positivos o ambigüedad cuando PINPing interneuronas inhibitorias. La mayoría de las células se pueden seguir fácilmente un tren de pulsos con una duración de 30 ms e inter-Pulintervalo de 500 ms sí, o más rápido, con un fiable primera latencia pico de 5.2 ms (Figura 5). La mayoría de las células PV +, en particular, puede sostener la cocción durante 1 seg completo (Figura 6). Porque éstas son las neuronas inhibitorias, disynaptic activación (indirecta) no es una preocupación importante.
- Repita este proceso hasta que el pico o el comedero del potencial de acción se pueden capturar de forma fiable con un umbral de tensión fijado muy por encima del ruido de fondo (por ejemplo, +/- 300 mV o más).
- Durante la grabación, supervisar la actividad en curso en el primer osciloscopio. Mantenga una estrecha vigilancia sobre el tamaño y la forma de los picos utilizando el segundo osciloscopio. Tenga en cuenta la calidad de su sonido en el altavoz.
- Escuchar con atención los cambios bruscos, que indican que la célula está bien llegando demasiado cerca del electrodo (donde el riesgo de ser empalado o dañado), o se deriva. Si los picos se hacen grandes y distorsionada, retroceder; si crecen más pequeño, avanzar el electrodo. Mueva lentamente en 2 micras pasos.
- Confirme la calidad de la grabación post-hoc mediante la superposición de todas las formas de onda de pico, alineados a pico o valle. Varíe los Thres tensióncelebrar. A través de una amplia gama de valores de umbral, sólo debe haber siempre una forma consistente pico de altura uniforme (Figura 5a).
- Si en algún momento la señal se contamina con los puntos de una neurona vecina, seguir adelante. Avanza lentamente, en la remota posibilidad de que el electrodo pasará fuera del rango de la celda vecina, pero permanecerá en el rango de la neurona diana. (Esto es por lo general sin éxito.)
- Mueva el electrodo a través de toda la profundidad de la corteza (900+ micras) en cada penetración. Si no se encuentran las neuronas-luz de respuesta después de muchas penetraciones o, por el contrario, las grabaciones están contaminados de forma rutinaria con picos de células ChR2- vecinos, trate de un nuevo electrodo.
NOTA: Incluso dentro de un solo lote, la geometría de la impedancia y la punta de electrodos individuales puede variar considerablemente. Ambos factores contribuyen a la efectiva "radio de escucha" del electrodo, que debe ser lo suficientemente grande para detectar picos de luz evocados while búsqueda, pero lo suficientemente restringido para permitir la grabación de una sola interneuron en el aislamiento. - Prueba de la impedancia de los electrodos si lo deseas. Para evitar dañar el tejido, hacer esto con la punta del electrodo en la parte superior de la capa de agarosa, así fuera del cerebro. Dentro de la gama de 7-14 MΩ, la impedancia exacta no es un predictor seguro de rendimiento, o el rendimiento, para esta aplicación. Dicho esto, es una aproximación razonable para el radio escucha: electrodos de baja impedancia recoger más unidades; de mayor impedancia, menos.
- Al final del experimento, la eutanasia al animal por medio aprobado institucionalmente, tales como sobredosis de anestesia, o dislocación cervical bajo un plano de profundidad de la anestesia.
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Representative Results
Estamos aquí compartimos nuestra estrategia para la obtención de grabaciones de una sola unidad de interneuronas inhibitorias genéticamente clasificados en la corteza del ratón anestesiado, utilizando un método de optogenética desarrollado por Lima et al. Tabla 1 detalla el cóctel anestésico sugerido, ketamina-medetomidina-Acepromazina (1. " KMA "). La Figura 1 representa un microelectrodo de tungsteno, preparado para la grabación. La Figura 2 contiene un diagrama de circuito de una unidad de control LED simple. La Figura 3 contiene la configuración y el código para conmutar la salida de luz con un microcontrolador Arduino. La Figura 4 muestra un ejemplo de los artefactos eléctricos inducidos por la luz discuten en el Protocolo. Los artefactos se encuentran de vez en cuando (panel izquierdo), pero fácilmente corregidos (panel derecho). La figura 5 muestra ejemplos de las grabaciones a partir de tres tipos de interneuronas ópticamente identificados (PV +, CR + y + SOM). El pa la izquierdanel muestra rastros de tensión prima y formas de onda alineadas, representante de la clase de relación señal a ruido se puede esperar obtener con esta estrategia. Picos son capturados de forma fiable con un umbral de tensión fijo de varios cientos de microvoltios. Una parcela de trama (panel derecho) muestra la latencia corta y la fiabilidad de respuestas de la luz evocada, que permiten la identificación inequívoca de interneuronas ChR2-positivos. La Figura 6 muestra el voltaje de huellas de tres PV + interneuronas, en respuesta a un pulso de luz 1 seg. La mayoría de las células fotovoltaicas + puede mantener de alta frecuencia para disparar cientos de milisegundos, lo que son especialmente fáciles de identificar.
Figura 1. Preparación de un electrodo. (A) Diagrama de un electrodo preparado. El electrodo es Affifijado a un tubo capilar de vidrio utilizando dos pequeñas gotas de pegamento y una cantidad mínima de acelerador (tales como Zap-It). Tubería de encogimiento de calor se añade para mayor agarre, con muy pocas calorías. Los electrodos envían normalmente con un pin conector armada previamente. (B) Fotografía de un microelectrodo de tungsteno preparada montado en un soporte del electrodo.
La Figura 2. Esquema de conexiones para una unidad de control LED. Un circuito sencillo y de bajo costo para la entrega de la luz. Un LED super brillante (475 nm) se une a un disipador de calor y acoplado al otro extremo de un cable de fibra óptica (800 m de diámetro). La salida del LED está cerrada con un pulso TTL. La unidad de control incorpora una fuente de alimentación de modo de tensión por la intensidad de luz ajustable. 2K POT: potenciómetro para controlar la intensidad de la luz. P / S: supl alimentación de CC mente (por ejemplo, cargador portátil). TIP 122: Darlington transistor. 4N35: aislador óptico. Las piezas que se indican aquí cuestan <$ 10.
La Figura 3. Código y la configuración Arduino. Un tren de pulsos TTL para conmutar la salida de luz se pueden generar utilizando un microcontrolador Arduino. El programa especifica una duración de pulso y el ISI para un tren de pulsos de bucle. Las instrucciones para cargar el programa en la placa se pueden encontrar en la página "Getting Started" de Arduino ( http://arduino.cc/en/Guide/HomePage ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
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. Figura 4. artefacto Luz electrodos de metal son susceptibles a artefactos de luz, presente en el inicio y el desplazamiento de los impulsos (panel de la izquierda, la señal filtrada, 300 - 5000 Hz). Por lo general, se pueden eliminar por completo (panel de la derecha) mediante el reposicionamiento de la fibra óptica con respecto al electrodo para cambiar el ángulo de la luz incidente, y / o disminuyendo la potencia de la luz.
Figura 5. Ejemplo células. (A) ejemplo grabaciones típicas de interneuronas ópticamente identificados, PV + (púrpura), CR + (verde), SOM + (rojo). Las células responden a la búsqueda de tren de pulsos (duración del pulso de 30 ms, 500 ms ISI) con una ráfaga fiable de los picos. El panel de la derecha muestra 100 picos cilindro-alineados y. la forma de onda promedio interpolado (10x sobremuestreo de una velocidad de muestreo de 10 kHz) (B) parcelas de mapa de bits para los mismos archivos muestran la latencia corta (~ 2 - 5 mseg). y el tiempo coherente de picos de luz evocado (C) y Mean desviación estándar de las latencias de primer pico (5-10 pulsos) para una muestra de 44 PV + interneuronas (media promedio y desviación estándar: 3,4 +/- 2,6 ms). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 6. Ejemplos de respuestas sostenidas Uno puede ser especialmente confianza en la identificación de PV + interneuronas ya que la mayoría de ellos puede sostener de alta frecuencia de disparo para cientos de milisegundos -. Reminiscencia de sus respuestas a actualinyección in vitro 14. Tres células ChR2 / PV que responden a los impulsos de luz 1 seg: dos que disparan regularmente a lo largo de toda la duración del pulso, y un ejemplo inusual de una célula que no lo hace (<10% de las células encontradas).
| KMA (20,0 ml) | |||
| 2 ml de 100 mg / ml de ketamina (10 mg / ml, una vez diluida) | |||
| 0,4 ml de 1 mg / ml DEXDOMITOR (medetomidina; 0,02 mg / ml, una vez diluida) | |||
| 0,05 ml de 100 mg / ml acepromazina (0,25 mg / ml, una vez diluida) | |||
| 17,55 ml de solución salina al 0,9% | |||
| Dosificación, ratón adulto (15-40 g) | |||
| Knock-down: 0,012 ml / g * de masa corporal (ketamina = 120 mg / kg) | |||
| Mantenimiento: 0,0025 ml / g * de masa corporal (= ketamina 25 mg / kg) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChR2-EYFP Line | Jackson Colonies | 12569 | |
| Pvalb-iCre (PV) Line | Jackson Colonies | 8069 | |
| Sst-iCre (SOM) Line | Jackson Colonies | 13044 | |
| Cr-iCre (CR) Line | Jackson Colonies | 10774 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | Type III-A, High EEO |
| Micro Point (dural hook) | FST | 10066-15 | |
| Surgical Scissors | FST | 14084-09 | |
| Scalpel | FST | 10003-12 (handle), 10011-00 (blades) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Foster & Smith | 9N-76855 | |
| Homeothermic Blanket | Harvard Apparatus | 507220F | |
| Tungsten Microelectrodes | A-M Systems | 577200 | 12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated |
| Capillary Glass Tubing | Warner Instruments | G150TF-3 | |
| Heat Shrink Tubing | DigiKey | A332B-4-ND | |
| Zapit Accelerator | DVA | SKU ZA/ZAA | Use with standard Super Glue. |
| Microelectrode AC Amplifier 1800 | AM Systems | 700000 | |
| MP-285 Motorized Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| 4-channel Digital Oscilloscopes | Tektronix | TDS2000C | |
| Powered Speakers | Harman | Model JBL Duet | |
| Manual Manipulator | Scientifica | LBM-7 | |
| 800 µm Fiber Optic Patch Cable | ThorLabs | FC/PC BFL37-800 | |
| Power Meter | ThorLabs | PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor) | |
| 475 nm Cree XLamp XP-E | DigiKey | XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND | LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com). |
| Arduino UNO | DigiKey | 1050-1024-ND |
References
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Neurociencia Número 93 optogenética canalrodopsina ChR2 corteza,
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