Abstract
Una sfida importante in neurofisiologia è stato quello di caratterizzare le proprietà di risposta e la funzione dei numerosi tipi di cellule inibitoria nella corteccia cerebrale. Siamo qui condividiamo la nostra strategia per l'ottenimento di stabili, ben isolate-single-unit registrazioni da interneuroni inibitori identificati nel topo corticale anestetizzato utilizzando un metodo sviluppato da Lima e colleghi 1. Le registrazioni vengono eseguite in topi che esprimono channelrhodopsin-2 (ChR2) in specifiche sottopopolazioni neuronali. I membri della popolazione sono identificati dal loro risposta ad un breve lampo di luce blu. Questa tecnica - chiamata "PINP", o Identificazione Fotostimolazione-assistita di popolazioni neuronali - possono essere implementati con equipaggiamento di serie di registrazione extracellulare. Può servire come un'alternativa economica e accessibile per l'imaging calcio o patch visivamente guidato, al fine di indirizzare registrazioni extracellulari alle cellule geneticamente identificati. Here mettiamo a disposizione una serie di linee guida per l'ottimizzazione del metodo nella pratica di tutti i giorni. Abbiamo raffinato la nostra strategia specifica per il targeting (PV +), le cellule parvalbumin-positivo, ma abbiamo trovato che funziona per altri tipi di interneuroni, nonché, come ad esempio (CR +) interneuroni-calretinina esprimono-somatostatina che esprimono (SOM +) e.
Protocol
NOTA: Il seguente protocollo è conforme con il National Institutes of linee guida per la salute, come approvato dalla University of Oregon Animal Care and Use Committee.
1. Chirurgia acuta
- Anestetizzare l'animale con un cocktail di ketamina-medetomidina, via intraperitoneale (ip) iniezione (Tabella 1).
NOTA: I topi utilizzati in questi esperimenti sono generati attraversando un cre-dipendente ChR2-EYFP transgenico line10 di interneuroni linee conducente (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Consegna virale di ChR2 o opsine correlati dovrebbe funzionare altrettanto bene, assumendo livelli di espressione simili si ottengono. - Prima di iniziare l'intervento, in modo che le esibizioni di animali non risposta ad un pizzico punta dolce. Ri-somministrare anestetici durante l'esperimento come necessario per mantenere questa profondità dell'anestesia. Se si utilizza anestetici iniettabili, eventualmente impiantare un catetere ip per preparazioni iniettabili di manutenzione.
- Mantenere l'animale idratato con soluzione salina o di Ringer lattato durante l'esperimento (circa 3 ml / kg / ora), per esempio usando un cocktail anestetico opportunamente diluito per preparazioni iniettabili manutenzione (Tabella 1).
- Posto l'animale in un apparato porta-teste stereotassico o altro. Assicurarsi che il cranio è ben protetto,. Ciò è essenziale per mantenere registrazioni monocellulari stabili.
- Applicare una pomata opthalamic agli occhi per prevenire la secchezza. Mantenere la temperatura corporea a 36,5-37 ° C.
- Eseguire uno scarico della cisterna per la stabilità ulteriore registrazione. Usando un bisturi, rimuovere il tessuto dalla faccia posteriore del cranio per esporre la cisterna magna. Fare un piccolo nick nella dura per drenare il liquido cerebrospinale. Utilizzare solo la punta della lama, ed evitare qualsiasi contatto il gambo cervelletto o del cervello.
- Utilizzando il bisturi, eseguire una piccola craniotomia (~ 2 mm 2) sopra la zona corticale di interesse (per l'acusticacorteccia, circa -2.3 mm posteriormente di bregma, 4,5 millimetri laterale della linea mediana).
- Rimuovere la dura e coprire la corteccia esposta con uno strato di agarosio calda 0,5 - spessore di 1 mm (1,5% agarosio in soluzione salina, 0,9% di NaCl; applicare a ~ 37 ° C). Mantenere l'umido agarosio tutto l'esperimento applicando periodicamente alcune gocce di soluzione salina.
2. Registrazione Set-up
- Preparare un elettrodo di tungsteno (7-14 MW, 127 micron di diametro, 12 ° punta affusolata, rivestimento epossidico). Superglue l'elettrodo di un tubo capillare di vetro e aggiungere termorestringente per una presa (figura 1).
- Montare l'elettrodo su un micromanipolatore motorizzato (o idraulico), impostare viaggiare ortogonale alla superficie corticale. Far scorrere un filo di terra sotto la pelle, contro il cranio. Evitare il contatto con i muscoli sul lato della testa e la parte posteriore del collo, in quanto possono generare artefatti elettromiografici.
- Amplificazione del segnale elettrico utilizzando un amplificatore extracellulareli fi catore adatto per la registrazione singola unità, preferibilmente dotata di una modalità di controllo dell'impedenza. Monitorare l'attività chiodare in corso (banda passante di 300 - 5.000 Hz) con due oscilloscopi e un set di altoparlanti amplificati. Qui, i dati registrati vengono digitalizzate continuo ad una frequenza di campionamento di 10 kHz; picchi vengono estratti in linea.
- Avanzare l'elettrodo attraverso l'agarosio finché la punta raggiunge la superficie della corteccia. Osservare questo passaggio attraverso un microscopio. "Zero" questa posizione sul micromanipolatore.
- Per meglio approssimare la profondità della registrazione, confermare visivamente che la punta dell'elettrodo esce dalla superficie corticale ad una profondità di zero quando ritirare l'elettrodo al termine di una penetrazione.
NOTA: Una discrepanza tra la lettura manipolatore e la posizione dell'elettrodo osservato indica che è spostata rispetto al tessuto. Questo può essere causato da instabilità del cervello o animale, o manipolatore deriva.- Come un ulteriore controllo per garantire chequesto set-punto zero corrisponde alla superficie della corteccia, monitorare potenziali di campo evocati stimolo mentre avanza attraverso le prime diverse centinaia di micrometri di tessuto. Durante il monitoraggio potenziali di campo, abbassare il più basso filtro passa-banda di taglio dell'amplificatore extracellulare a 10 Hz. Verificare che la polarità del potenziale campo locale inverte intorno una profondità di circa 100 micron, in prossimità dello strato di confine I / II 13. Questo è un punto di riferimento affidabile per la corteccia uditiva, ma può essere diverso per le altre aree corticali.
- Montare una fibra ottica accoppiata ad una sorgente di luce blu (figura 2) su un micromanipolatore manuale. Utilizzando il microscopio, posizionare la punta della fibra più vicino alla superficie del agarosio possibile. Centrare il fascio in cui l'elettrodo si entra il tessuto.
- Regolare l'uscita della sorgente di luce con una unità di controllo in grado di erogare un TTL (transistor-transistor logic) treno di impulsi di larghezza e duratio specificaton- esempio, un Arduino (figura 3), una scheda PC I / O (come mostrato), o un generatore di impulsi disponibile in commercio.
- Monitorare il segnale su entrambi oscilloscopi.
- Misurare potenza luminosa totale (mW) sulla punta della fibra ottica utilizzando un misuratore di potenza. Utilizzare questo valore per calcolare irradianza (mW / mm 2) dividendo per l'area della sezione trasversale del nucleo della fibra. Iniziare con un valore di intensità nell'intervallo 10 - 15 mW / mm 2 e regolare verso il basso se necessario, fino artefatti sono eliminati.
- Verificare la presenza di manufatti leggeri con l'elettrodo nella agarosio, pronta a entrare nel tessuto. Avviare la ricerca treno di impulsi (ad esempio, 30 impulsi di luce msec, 500 msec intervallo interstimulus (ISI)).
- Eliminare manufatti leggeri transitori (Figura 4) per riposizionare la fibra ottica rispetto all'elettrodo per cambiare l'angolo della luce incidente. Se artefatti persistono, provare a diminuire la potenza luminosa. In the caso raro che gli artefatti non possono essere completamente eliminati (solo ridotto al minimo), estendere la durata dell'impulso di ricerca. Questo può aiutare a identificare i veri picchi neuronali.
3. Dritto PINP-in '
- Avanzare l'elettrodo lentamente attraverso il cervello ad una velocità di circa 1 micron / sec. Utilizzare un oscilloscopio per monitorare l'attività in corso. Dall'altro, scatenare gli impulsi laser.
- Attendere il 'hash' deboli di picchi luce evocata sul monitor audio, che indica che l'elettrodo si avvicina una cella ChR2 + e spesso può essere percepito ben prima del segnale elettrico risulta sull'oscilloscopio. Rallentare la velocità di avanzamento.
NOTA: Se la cella si trova direttamente nel percorso dell'elettrodo, l'attività di luce evocata crescerà più grande (e più forte). Come l'elettrodo si avvicina un singolo interneuroni, l'hash risolverà in piccoli ma ben definiti picchi di forma e dimensione uniformi. - Appena lipicchi GHT-evocato sono grandi abbastanza per innescare della singolarmente sull'oscilloscopio, cominciano a farlo. Regolare la scala sull'asse orizzontale per osservare la forma esatta della forma d'onda di picco.
- Fermarsi e attendere per il tessuto di stabilirsi. Resistete alla tentazione di spostare l'elettrodo più vicino alla cella. Questo passaggio è fondamentale per una registrazione stabile. Se dopo alcuni minuti il rapporto segnale-rumore non è migliorata - cioè, il tessuto è costante, ma non ha portato la cella più vicino alla punta dell'elettrodo - avanzamento 5 micron ulteriormente e attendere.
- Ripetere questo processo fino a quando la punta o la depressione del potenziale d'azione possono essere catturati in modo affidabile con una soglia di tensione impostata ben al di sopra del rumore di fondo (ad esempio, +/- 300 mV o superiore).
NOTA: C'è poco rischio di falsi positivi o ambiguità quando PINPing interneuroni inibitori. La maggior parte delle cellule in grado di seguire facilmente un treno di impulsi di durata di 30 msec e inter-pulIntervallo SE 500 msec, o più veloce, con una certa latenza primo picco di 2-5 msec (Figura 5). La maggior parte delle cellule fotovoltaiche +, in particolare, può sostenere cottura per un totale di 1 sec (Figura 6). Perché questi sono neuroni inibitori, disynaptic attivazione (indiretto) non è una preoccupazione importante.
- Ripetere questo processo fino a quando la punta o la depressione del potenziale d'azione possono essere catturati in modo affidabile con una soglia di tensione impostata ben al di sopra del rumore di fondo (ad esempio, +/- 300 mV o superiore).
- Durante la registrazione, monitorare l'attività in corso sul primo oscilloscopio. Tieni d'occhio le dimensioni e la forma del picchi utilizzando il secondo oscilloscopio. Si noti la qualità del loro suono sull'altoparlante.
- Ascoltate con attenzione per i cambiamenti improvvisi, che indicano che la cella è sia volge troppo vicino all'elettrodo (dove rischia di essere impalato o danneggiato), o è alla deriva. Se le punte si allargano e distorta, tornare indietro; se crescono più piccolo, far avanzare l'elettrodo. Si muovono lentamente in 2 micron passi.
- Verificare la qualità della registrazione post-hoc sovrapponendo tutte le forme d'onda di picco, allineati a picco o depressione. Variare le THRES tensionetenere. Attraverso una vasta gamma di valori di soglia, ci dovrebbe essere solo una forma coerente picco di altezza uniforme (figura 5a).
- Se in qualsiasi momento il segnale venga contaminato con punte da un neurone vicino, andare avanti. Avanza lentamente, sulla remota possibilità che l'elettrodo passerà fuori dalla portata della cella vicina, ma rimanere nel raggio d'azione del neurone bersaglio. (Questo è di solito senza successo.)
- Spostare l'elettrodo attraverso l'intera profondità della corteccia (900 + micron) in ogni penetrazione. Se non ci sono i neuroni di luce-sensibili si incontrano dopo molti penetrazioni o, al contrario, le registrazioni sono regolarmente contaminati con punte di cellule ChR2- vicini, provare un nuovo elettrodo.
NOTA: Anche all'interno di una stessa partita, la geometria impedenza e punta di singoli elettrodi può variare considerevolmente. Entrambi i fattori contribuiscono alla effettiva "ascolto raggio" dell'elettrodo, che deve essere sufficientemente grande per rilevare i picchi di luce evocati whricerca ile, ma limitato sufficiente per permettere la registrazione di un singolo interneuroni in isolamento. - Testare l'impedenza degli elettrodi lo desideri. Per evitare di danneggiare il tessuto, farlo con la punta dell'elettrodo nella parte superiore dello strato di agarosio, ben al di fuori del cervello. All'interno della gamma di 7-14 MW, l'impedenza esatta non è un sicuro indicatore delle prestazioni, o cedere, per questa applicazione. Detto questo, si tratta di un proxy ragionevole per l'ascolto radio: elettrodi più bassa impedenza raccogliere più unità; elevata impedenza, meno.
- Alla fine dell'esperimento, eutanasia dell'animale mediante istituzionalmente approvati, quali overdose di anestetico, o dislocazione cervicale sotto un profondo piano di anestesia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siamo qui condividiamo la nostra strategia per ottenere registrazioni singola unità da interneuroni inibitori geneticamente classificati nel topo corticale anestetizzato, utilizzando un metodo optogenetic sviluppato da Lima et al. Tabella 1 i dettagli cocktail anestetico suggerito, Ketamina-Medetomidina-acepromazina (1. " KMA "). La Figura 1 illustra un microelettrodo di tungsteno, preparato per la registrazione. La figura 2 contiene uno schema circuitale di una semplice unità di controllo LED. La figura 3 contiene la configurazione e il codice per gating potenza di illuminazione con un microcontrollore Arduino. Figura 4 mostra un esempio di i manufatti elettrici di luce indotta discusso nel protocollo. Gli artefatti sono a volte incontrano (pannello di sinistra), ma facilmente corretti (pannello di destra). La Figura 5 mostra esempi di registrazioni da tre tipi di interneuroni otticamente-identificati (PV +, CR + e + SOM). Il pa sinistraNel presenta tracce di tensione prima e forme d'onda allineate, rappresentativo del tipo di rapporto segnale-rumore si può sperare di ottenere con questa strategia. Picchi sono catturati in modo affidabile con una soglia di tensione fissa di diverse centinaia di microvolt. Una trama raster (pannello di destra) mostra la breve latenza e l'affidabilità delle risposte di luce evocata, che consentono l'identificazione univoca degli interneuroni ChR2-positivi. La figura 6 mostra la tensione tracce da tre PV + interneuroni, rispondendo a un impulso di luce 1 sec. La maggior parte dei + celle fotovoltaiche in grado di sostenere ad alta frequenza di emissione per centinaia di millisecondi, che li rende particolarmente facile da identificare.
Figura 1. Preparazione di un elettrodo. (A) Schema di un elettrodo preparato. L'elettrodo è affisso ad un tubo capillare di vetro utilizzando due piccole gocce di colla eccellente e una quantità minima di acceleratore (come Zap-E). Guaina termorestringente viene aggiunto per la presa, con fuoco molto basso. Gli elettrodi vengono spediti con la. (B) Fotografia pin del connettore precedentemente montate di un microelettrodo di tungsteno preparato montato in un portaelettrodo.
Figura 2. Schema elettrico per un'unità di controllo LED. Un circuito semplice ed economico per la consegna della luce. Un LED super luminoso (475 nm) è collegato a un dissipatore di calore ed accoppiato all'altra estremità di un cavo a fibre ottiche (800 micron di diametro). L'uscita del LED è recintato con un impulso TTL. L'unità di controllo comprende un alimentatore di tensione-mode per intensità di luce regolabile. 2K POT: potenziometro per controllare l'intensità della luce. P / S: DC supp potere mente (ad esempio, caricatore del computer portatile). SUGGERIMENTO 122: transistor Darlington. 4N35: isolatore ottico. Le parti elencate qui costano <$ 10.
Figura 3. Codice e la configurazione Arduino. Un treno di impulsi TTL per gating emissione di luce possono essere generati utilizzando un microcontrollore Arduino. Il programma specifica una durata dell'impulso e ISI per un treno di impulsi loop. Le istruzioni per il caricamento del programma sulla scheda possono essere trovati nella pagina di Arduino "Getting Started" ( http://arduino.cc/en/Guide/HomePage ). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
IGURA 4 "fo: content-width =" "src =" 6in / file / ftp_upload / 51757 / 51757fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
. Figura 4. manufatto Luce elettrodi metallici sono suscettibili di manufatti leggeri, presenti al momento della comparsa e l'offset di impulsi (pannello di sinistra, segnale filtrato, 300 - 5.000 Hz). In genere possono essere completamente eliminati (pannello destro) riposizionando la fibra ottica rispetto all'elettrodo per cambiare l'angolo della luce incidente e / o diminuendo la potenza luminosa.
Figura 5. Esempio cellule. (A) Esempio registrazioni tipici interneuroni otticamente-identificati, PV + (viola), CR + (verde), SOM + (rosso). Le cellule rispondono al treno di impulsi di ricerca (durata dell'impulso 30 ms, ISI 500 ms) con una raffica affidabile di punte. Il pannello di destra mostra 100 picchi di valle-allineati e. la forma d'onda media interpolato (10x sovracampionato da una frequenza di campionamento di 10 kHz) (B) Trame raster per gli stessi file mostrano la breve latenza (~ 2-5 msec). e la tempistica coerente di picchi di luce evocata (C) Media e deviazione standard delle latenze di prima Spike (5 - 10 impulsi) per un campione di 44 PV + interneuroni (media media e deviazione standard: 3.4 +/- 2.6 msec). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Esempi di risposte sostenuta Si può essere particolarmente fiducioso per identificare PV + interneuroni come la maggior parte di loro in grado di sostenere ad alta frequenza di emissione per centinaia di millisecondi -. Che ricorda le loro risposte a correnteiniettabile in vitro 14. Tre cellule ChR2 / PV rispondono a impulsi di luce 1 sec: due che sparano regolarmente durante tutta la durata dell'impulso, ed una insolita esempio di una cella che non è così (<10% delle cellule incontrate).
| KMA (20.0 ml) | |||
| 2 ml di 100 mg / ml di ketamina (10 mg / ml, una volta diluito) | |||
| 0,4 ml di 1 mg / ml DEXDOMITOR (medetomidina; 0,02 mg / ml, una volta diluito) | |||
| 0,05 ml di 100 mg / ml Acepromazine (0,25 mg / ml, una volta diluito) | |||
| 17,55 ml di soluzione salina allo 0,9% | |||
| Dosaggio, topo adulto (15 - 40 g) | |||
| Knock-down: 0.012 ml / g * massa corporea (ketamina = 120 mg / kg) | |||
| Manutenzione: 0,0025 ml / g * massa corporea (ketamina = 25 mg / kg) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChR2-EYFP Line | Jackson Colonies | 12569 | |
| Pvalb-iCre (PV) Line | Jackson Colonies | 8069 | |
| Sst-iCre (SOM) Line | Jackson Colonies | 13044 | |
| Cr-iCre (CR) Line | Jackson Colonies | 10774 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | Type III-A, High EEO |
| Micro Point (dural hook) | FST | 10066-15 | |
| Surgical Scissors | FST | 14084-09 | |
| Scalpel | FST | 10003-12 (handle), 10011-00 (blades) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Foster & Smith | 9N-76855 | |
| Homeothermic Blanket | Harvard Apparatus | 507220F | |
| Tungsten Microelectrodes | A-M Systems | 577200 | 12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated |
| Capillary Glass Tubing | Warner Instruments | G150TF-3 | |
| Heat Shrink Tubing | DigiKey | A332B-4-ND | |
| Zapit Accelerator | DVA | SKU ZA/ZAA | Use with standard Super Glue. |
| Microelectrode AC Amplifier 1800 | AM Systems | 700000 | |
| MP-285 Motorized Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| 4-channel Digital Oscilloscopes | Tektronix | TDS2000C | |
| Powered Speakers | Harman | Model JBL Duet | |
| Manual Manipulator | Scientifica | LBM-7 | |
| 800 µm Fiber Optic Patch Cable | ThorLabs | FC/PC BFL37-800 | |
| Power Meter | ThorLabs | PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor) | |
| 475 nm Cree XLamp XP-E | DigiKey | XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND | LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com). |
| Arduino UNO | DigiKey | 1050-1024-ND |
References
- Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, (2009).
- Moore, A. K., Wehr, M. Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency. J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).
- Merchant, H., de Lafuente, V., Pena-Ortega, F., Larriva-Sahd, J. Functional impact of interneuronal inhibition in the cerebral cortex of behaving animals. Prog Neurobiol. 99, 163-178 (2012).
- Markram, H., et al. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nat Rev Neurosci. 5, 793-807 (2004).
- Atallah, B. V., Bruns, W., Carandini, M., Scanziani, M. Parvalbumin-expressing interneurons linearly transform cortical responses to visual stimuli. Neuron. 73, 159-170 (2012).
- Wilson, N. R., Runyan, C. A., Wang, F. L., Sur, M. Division and subtraction by distinct cortical inhibitory networks in vivo. Nature. 488, 343-348 (2012).
- Letzkus, J. J., et al. A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex. Nature. 480, 331-335 (2011).
- Pi, H. J., et al. Cortical interneurons that specialize in disinhibitory control. Nature. 503, 521-524 (2013).
- Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. A neural circuit for spatial summation in visual cortex. Nature. 490, 226-231 (2012).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3, 159 (2005).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
- Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex. J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8, 70553 (2013).
Tags
Neuroscienze Numero 93 Optogenetics channelrhodopsin ChR2 corteccia,
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
