Abstract
Одна из основных задач в области нейрофизиологии в том, чтобы охарактеризовать свойства реагирования и функции многочисленных видов ингибирующее клеток в коре головного мозга. Мы здесь поделиться нашим стратегии получения устойчивых, хорошо изолированные единичные записи с определенных ингибирующих интернейронов в наркозом коры мыши с помощью метода, разработанного Лиме и 1 коллегами. Записи выполняются в мышей, экспрессирующих Channelrhodopsin-2 (ChR2) в конкретных нейронных групп населения. Члены населения идентифицируются по их реакции на короткой вспышке синего света. Эта техника - называют "PINP", или Фотостимуляция-помощь идентификации нейрональных популяций - могут быть реализованы с помощью стандартного оборудования внеклеточной записи. Она может служить в качестве недорогой и доступной альтернативы визуализации кальция или визуально-управляемой коммутации, с целью ориентации внеклеточные записи на генетически определенных клеток. Hпрежде чем мы предоставляем набор руководящих принципов для оптимизации метода в повседневной практике. Мы усовершенствовали нашу стратегию специально для таргетинга парвальбумина-положительным (PV +) клеток, но обнаружили, что это работает для других типов интернейронов, а, например, соматостатин-выражающей (SOM +) и calretinin-выражения (CR +) интернейронов.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: следующий протокол в соответствии с Национальными Институтами принципов здравоохранения, утвержденным университета штата Орегон уходу и использованию животных комитета.
1. Острый хирургии
- Обезболить животное смесью кетамина-медетомидин коктейль, с помощью внутрибрюшинного (IP) инъекции (Таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, используемые в этих экспериментах генерируются путем скрещивания CRE-зависимых ChR2-EYFP трансгенной LINE10 к интернейрон линии драйверов (Pvalb-iCre11, PV +; SST-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Вирусный доставка ChR2 или смежных опсинов должен одинаково хорошо работать, предполагая аналогичные уровни экспрессии получаются. - Перед началом операции убедитесь, что экспонаты животных не реагирует на нежной пальца щепоткой. Повторно вводить обезболивающие в течение всего эксперимента по мере необходимости, чтобы поддерживать эту глубину анестезии. При использовании инъекционных анестетиков, возможно имплантировать IP катетер для инъекций обслуживания.
- Держать животное гидратированный физиологическим раствором или раствором лактата Рингера в течение всего эксперимента (примерно 3 мл / кг / час), например, с помощью соответствующим образом разбавленного обезболивающий коктейль для инъекций обслуживания (таблица 1).
- Поместите животное в стереотаксической или другой головной холдинговой аппарата. Убедитесь, что череп хорошо закреплены. Это очень важно для поддержания стабильных записи одной ячейки.
- Применить opthalamic мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость. Поддерживать температуру тела в 36.5-37 ° C.
- Выполните цистерн для слива дополнительной устойчивости записи. Используя лезвие скальпеля, удалить ткань от задней поверхности черепа, чтобы выставить большой цистерны. Сделайте небольшой ник в твердой мозговой оболочке, чтобы слить спинномозговую жидкость. Используйте только самый кончик лезвия, и избежать контакта мозжечка или ствола мозга.
- Используя скальпель, выполнить небольшую трепанацию черепа (~ 2 мм 2) по сравнению с кортикальной области, представляющей интерес (для слуховогокора, примерно -2,3 мм кзади от темени, 4,5 мм сбоку от средней линии).
- Удалить твердую мозговую оболочку и покрытия подвергаются кору со слоем теплой агарозы 0,5 - 1 мм (1,5% агарозы в физиологическом растворе, 0,9% NaCl; применяют при ~ 37 ° C). Держите агарозном влажной в течение эксперимента, периодически применяя несколько капель физиологического раствора.
2. Запись Set-до
- Подготовьте вольфрамовым электродом (7-14 МОм, 127 мкм в диаметре, 12 ° коническая наконечник, с эпоксидным покрытием). Суперклей электрод к стеклянной капиллярной трубки и добавить термоусадочной трубки для захвата (рисунок 1).
- Установите электрод на моторизованной (или гидравлического) микроманипулятором, установите путешествовать ортогональна поверхности коры. Слайд проволочную основу под кожу, против черепа. Избегать контакта с мышц на стороне головы и задней части шеи, поскольку они могут генерировать электромиографические артефакты.
- Amplify электрический сигнал, используя внеклеточный усилительЛи фантастические э подходит для одной единицы записи, предпочтительно оснащен режиме проверки сопротивления. Монитор постоянный пики активности (полосовой 300 - 5000 Гц) с двумя осциллографов и набор активных акустических систем. Здесь, записанные данные оцифрованы постоянно с частотой дискретизации 10 кГц; шипы извлекаются форума.
- Предварительный электрод через агарозы, пока наконечник достигает поверхности коры. Соблюдайте этот шаг через микроскоп. "Ноль" эта позиция на микроманипулятором.
- Чтобы лучше аппроксимируют глубину записи, визуально подтвердить, что кончик электрода выходит из поверхности коры на глубине нулю при снятии электрода в конце проникновения.
ПРИМЕЧАНИЕ: несоответствие между показаниями манипулятора и наблюдаемого положения электрода указывает, что он дрейфовал по отношению к ткани. Это может быть вызвано нестабильностью мозга или животного или манипулятора дрейфа.- В качестве дополнительной проверки, чтобы обеспечить, чтоэтот нуль уставка соответствует поверхности коры, контролировать стимул-вызывала потенциалов поля при продвижении через первые несколько сотен микрометров ткани. При мониторинге полевых потенциалов, опустите нижнюю полосовой фильтр отсечки внеклеточной усилителя 10 Гц. Подтверждение, что полярность локального потенциала поля вокруг изменяет глубину ~ 100 мкм, вблизи слоя I / II пограничного 13. Это является надежным ориентиром для слуховой коры, но она может отличаться для других областей коры.
- Установите оптического волокна, соединенный с источником света синего (рисунок 2) на ручном микроманипулятором. Использование микроскопа, позиционировать кончик волокна как можно ближе к поверхности агарозы, как это возможно. Сосредоточьте луч, где электрод будет проникать в ткань.
- Регулировать выход источника света с блоком управления, способным обеспечить доставку TTL (транзисторно-транзисторной логики) импульсов указанной ширины и ДлительностиN- например, Ардуино (фиг.3), компьютер ввода / вывода карты (как показано), или коммерчески доступным генератор импульсов.
- Контролировать сигнал на обоих осциллографов.
- Измерение полной мощности света (Mw) на конце оптического волокна с использованием измерителя мощности. Используйте это значение для расчета освещенности (мВт / мм 2) путем деления на площади поперечного сечения сердечника волокна. Начинают с величиной интенсивности в диапазоне 10 - 15 мВт / мм 2 и отрегулировать вниз, если это необходимо, до тех пор, артефакты не будут устранены.
- Проверка на легких артефактов с электродом в агарозы, на пороге ткани. Начните поиск импульсов (например, 30 мс импульсы света, 500 мс межстимульный интервал (ISI)).
- Исключите переходные легкие артефакты (рисунок 4) путем перестановки оптического волокна по отношению к электроду для изменения угла падающего света. Если артефакты сохраняются, попробуйте уменьшить силу света. В гое редкий случай, что артефакты не могут быть полностью устранены (только свести к минимуму), продлить срок поисковой импульса. Это может помочь в выявлении истинных нервных шипы.
3. Прямо ПИЯФ-в "
- Предварительный электрод медленно через мозг со скоростью примерно 1 мкм / сек. Используйте один осциллограф для контроля текущей деятельности. С другой стороны, провоцировать лазерных импульсов.
- Прислушайтесь к слабым "хэш" легких-вызвала шипами на звуковой монитор, который показывает, что электрод приближается ячейку ChR2 + и часто могут быть восприняты задолго до того, электрический сигнал очевидно на экране осциллографа. Медленная скорость заранее.
Примечание: Если ячейка находится непосредственно на пути электрода, светло-вызывала активность будет расти больше (и громче). Как электрод приближается один интернейрон, хэш будет решить в небольших, но четко определенных шипы размером единой и формы. - Как только LiGHT-вызывала всплески являются достаточно большими, чтобы вызвать офф индивидуально на экране осциллографа, начинают это делать. Регулировка масштабирования на горизонтальной оси, чтобы наблюдать точную форму шипа сигнала.
- Остановитесь и ждите ткани урегулировать. Не поддавайтесь искушению, чтобы переместить электрод ближе к камере. Этот шаг является критическим для стабильной записи. Если через несколько минут отношение сигнал-шум не улучшилась - то есть, ткани осела, но это не принесло клетку ближе к кончику электрода - продвижение 5 мкм дальше и ждать снова.
- Повторите этот процесс, пока либо пик или впадина потенциала действия не может быть достоверно захватили с порога напряжения, установленным значительно выше уровня шума (например, +/- 300 мкВ или более).
ПРИМЕЧАНИЕ: Там мало риск ложных срабатываний или двусмысленности, когда PINPing ингибирующие интернейроны. Большинство клеток может легко следовать серию импульсов с длительностью 30 мс и интер-Пульсебе интервал 500 мс, или быстрее, с надежным первой задержки шип 2-5 мс (рисунок 5). Большинство PV + клеток, в частности, может выдержать стрельбу на полный 1 сек (рисунок 6). Потому что эти тормозящие нейроны, disynaptic (косвенные) активация не является основной проблемой.
- Повторите этот процесс, пока либо пик или впадина потенциала действия не может быть достоверно захватили с порога напряжения, установленным значительно выше уровня шума (например, +/- 300 мкВ или более).
- Во время записи, контролировать текущую деятельность на первом осциллографа. Следите от размера и формы шипов с помощью второй осциллограф. Обратите внимание на качество их звука на динамик.
- Слушайте внимательно к резким изменениям, которые указывают, что клетка либо рисунок слишком близко к электроду (где он рискует пронзил или поврежденного), или отходит. Если шипы становятся большими и искажены, отступать; если они растут меньше, продвигать электрод. Двигайтесь медленно в 2 мкм шагов.
- Подтвердите качество записи ретроспективном путем наложения все шипованные сигналов, выравнивание по пик или впадина. Вары Thres напряжениядержать. В широком диапазоне пороговых значений, не должно быть только когда один шип соответствует форма одинаковой высоты (рис 5а).
- Если в любой момент сигнал становится загрязненной с шипами из соседнего нейрона, двигаться дальше. Авансовые медленно, на всякий случай, что электрод пройдет вне зоны соседней камере, но остаются в пределах целевого нейрона. (Это, как правило, неудачными.)
- Перемещение электрода через всю глубину коры (900 + мкм) в каждой проникновения. Если нет света проблематику нейроны не встречаются через много проникновений или, наоборот, записи обычно загрязненных с шипами из соседних ChR2- клеток, попробовать новый электрод.
ПРИМЕЧАНИЕ: Даже в пределах одной партии, импеданс и наконечник геометрия отдельных электродов могут значительно различаться. Оба фактора способствуют эффективному "прослушивания радиуса» электрода, который должен быть достаточно большим, чтобы обнаружить легкие, вызвали шипы белыйИль поиск, пока ограничивается достаточно для того, чтобы записи одного интернейрон в изоляции. - Испытание на сопротивление электродов, как требуется. Во избежание повреждения ткани, сделать это с кончиком электрода в верхней части слоя агарозы, а вне мозга. В диапазоне 7-14 МОм, точное сопротивление не уверен предсказатель эффективности или доходности, для этого приложения. Тем не менее, это разумный прокси для радиуса прослушивания: меньше импеданса электродов подобрать более единиц; выше импеданс, меньше.
- В конце эксперимента, эвтаназии животных по организационно-одобренных средств, таких как анестезирующего передозировки, или цервикальной дислокации под глубокой анестезией плоскости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы здесь поделиться нашей стратегии для получения одной единицы записи с генетически-секретных тормозных интернейронов в наркозом коры мыши, с помощью optogenetic метод, разработанный Лиме и др. Таблица 1 детали предложил анестетик коктейль, кетамин-Медетомидин-ацепромазина (1 ». КМА "). На рисунке 1 показана вольфрама микроэлектрода, приготовленные для записи. Рисунок 2 содержит схему для простого блока управления СИД. Рисунок 3 содержит конфигурацию и код для стробирования световой поток с Arduino микроконтроллер. Рисунок 4 показывает пример светоиндуцированные электрические артефакты обсудили в Протоколе. Артефакты иногда встречаются (слева), но легко исправить (правая панель). Рисунок 5 показывает пример записи с тремя типами оптически выявленных интернейронов (PV +, Cr +, и SOM +). Левый годовыхнель показывает следы сырой напряжения и выровненные сигналов, представитель рода сигнал-шум, можно рассчитывать на получение с этой стратегией. Шипы надежно захвачена с фиксированным пороговым напряжением нескольких сотен микровольт. Растр участок (правая панель) показывает короткое время ожидания и надежность легких, вызвали ответы, которые позволяют однозначно идентифицировать ChR2-положительных интернейронов. На рисунке 6 показан напряжение следы от трех фотоэлектрических + интернейронов, отвечая на световой импульс в 1 сек. Большинство PV + клеток может выдержать высокую частоту стрельбы для сотен миллисекунд, что делает их особенно легко определить.
Рисунок 1. Подготовка электрода. (А) Схема подготовленном электрода. Электрод аффификсировано в стеклянной капиллярной трубки с помощью двух небольших капель супер клей и минимальное количество ускорителя (например, Зап-It). Термоусадочной трубки добавляется для захвата, используя очень медленном огне. Электроды обычно поставляются с контактным разъемом предварительно прилагается. (B) Фотография подготовленном вольфрама микроэлектродом установленного в держатель электрода.
Рисунок 2. Принципиальная схема для светодиодного блока управления. Простым и недорогим схема для легкой доставки. Супер-яркий светодиод (475 нм) прикреплен к радиатору и соединен с другим концом волоконно-оптического кабеля (диаметр 800 мкм). Выход светодиода закрытого типа с TTL импульса. Блок управления включает в себя напряжение режима питания для регулируемой интенсивностью света. 2K ПОТ: потенциометр для контроля интенсивности света. P / S: Источник питания постоянного зирр лы (например, ноутбук зарядное устройство). СОВЕТ 122: транзистор Дарлингтона. 4N35: Оптический изолятор. Части, перечисленные здесь стоят <$ 10.
Рисунок 3. Arduino код и конфигурация. TTL импульсов стробирования светоотдачу могут быть получены с помощью Arduino микроконтроллер. Программа определяет длительность импульса и ISI для перекручивания импульсов. Инструкция по загрузке программы на борту можно найти на странице "Начало работы" Arduino (в http://arduino.cc/en/Guide/HomePage ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
igure 4 "л: контент-ширина =" 6in "SRC =" / файлы / ftp_upload / 51757 / 51757fig4highres.jpg "ширина =" 600 "/>
. Рисунок 4. Свет артефакт Металлические электроды чувствительны к освещенности артефактов, присутствующих в начале и смещение импульсов (левой панели; отфильтрованный сигнал, 300 - 5000 Гц). Они, как правило, могут быть устранены полностью (правая панель) путем перестановки оптического волокна по отношению к электроду, чтобы изменить угол падающего света, и / или уменьшения силы света.
Рисунок 5. Пример клетки. (А) типичный пример записи с оптически-определенных интернейронов, PV + (фиолетовый), CR + (зеленый), SOM + (красный). Клетки реагируют на поиск импульсов (длительность импульса 30 мс, ISI 500 мс) с надежной порыве шипами. Панель справа показывает 100 корыто краю шипы и. Средняя интерполироваться сигнала (10x выборка из частотой дискретизации 10 кГц) (B) Растровые участки для одних и тех же файлов показывают короткое время ожидания (~ 2 - 5 мс). и последовательную сроки светло-вызвала шипами (C) Среднее и стандартное отклонение первого шип задержки (5 - 10 импульсов) для образца 44 PV + интернейронов (средняя среднего и стандартного отклонения: 3,4 +/- 2,6 мс). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Примеры устойчивых ответов Один может быть особенно уверен в идентификации PV + интернейроны как большинство из них могут выдержать высокую частоту стрельбы для сотен миллисекунд -. Напоминает своих ответах на токинъекции в пробирке 14. Три ChR2 / фотоэлементы реагируют на световых импульсов 1 сек: два, которые регулярно вести огонь по всей длительности импульса, и один необычный пример клетке, которая не (<10% встречающихся клеток).
| КМА (20,0 мл) | |||
| 2 мл 100 мг / мл кетамина (10 мг / мл, один раз разбавили) | |||
| 0,4 мл 1 мг / мл Dexdomitor (медетомидина; 0,02 мг / мл, один раз разбавили) | |||
| 0,05 мл 100 мг / мл ацепромазина (0,25 мг / мл, один раз разбавили) | |||
| 17,55 мл 0,9% физиологического раствора | |||
| Дозировка для взрослых мышь (15 - 40 г) | |||
| Knock-вниз: 0,012 мл / г * масса тела (Кетамин = 120 мг / кг) | |||
| Техническое обслуживание: 0,0025 мл / г * масса тела (Кетамин = 25 мг / кг) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChR2-EYFP Line | Jackson Colonies | 12569 | |
| Pvalb-iCre (PV) Line | Jackson Colonies | 8069 | |
| Sst-iCre (SOM) Line | Jackson Colonies | 13044 | |
| Cr-iCre (CR) Line | Jackson Colonies | 10774 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | Type III-A, High EEO |
| Micro Point (dural hook) | FST | 10066-15 | |
| Surgical Scissors | FST | 14084-09 | |
| Scalpel | FST | 10003-12 (handle), 10011-00 (blades) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Foster & Smith | 9N-76855 | |
| Homeothermic Blanket | Harvard Apparatus | 507220F | |
| Tungsten Microelectrodes | A-M Systems | 577200 | 12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated |
| Capillary Glass Tubing | Warner Instruments | G150TF-3 | |
| Heat Shrink Tubing | DigiKey | A332B-4-ND | |
| Zapit Accelerator | DVA | SKU ZA/ZAA | Use with standard Super Glue. |
| Microelectrode AC Amplifier 1800 | AM Systems | 700000 | |
| MP-285 Motorized Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| 4-channel Digital Oscilloscopes | Tektronix | TDS2000C | |
| Powered Speakers | Harman | Model JBL Duet | |
| Manual Manipulator | Scientifica | LBM-7 | |
| 800 µm Fiber Optic Patch Cable | ThorLabs | FC/PC BFL37-800 | |
| Power Meter | ThorLabs | PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor) | |
| 475 nm Cree XLamp XP-E | DigiKey | XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND | LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com). |
| Arduino UNO | DigiKey | 1050-1024-ND |
References
- Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, (2009).
- Moore, A. K., Wehr, M. Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency. J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).
- Merchant, H., de Lafuente, V., Pena-Ortega, F., Larriva-Sahd, J. Functional impact of interneuronal inhibition in the cerebral cortex of behaving animals. Prog Neurobiol. 99, 163-178 (2012).
- Markram, H., et al. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nat Rev Neurosci. 5, 793-807 (2004).
- Atallah, B. V., Bruns, W., Carandini, M., Scanziani, M. Parvalbumin-expressing interneurons linearly transform cortical responses to visual stimuli. Neuron. 73, 159-170 (2012).
- Wilson, N. R., Runyan, C. A., Wang, F. L., Sur, M. Division and subtraction by distinct cortical inhibitory networks in vivo. Nature. 488, 343-348 (2012).
- Letzkus, J. J., et al. A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex. Nature. 480, 331-335 (2011).
- Pi, H. J., et al. Cortical interneurons that specialize in disinhibitory control. Nature. 503, 521-524 (2013).
- Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. A neural circuit for spatial summation in visual cortex. Nature. 490, 226-231 (2012).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3, 159 (2005).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
- Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex. J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8, 70553 (2013).
Tags
Neuroscience выпуск 93 Оптогенетика Channelrhodopsin ChR2 кора,
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
