Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

A Guide Published: November 7, 2014 doi: 10.3791/51757
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Neuroscience, University of Oregon

Abstract

Nörofizyolojideki büyük bir meydan okuma serebral kortekste çeşitli inhibitör hücre tiplerinin yanıtı özellikleri ve işlevini karakterize etmek olmuştur. Biz burada Lima ve 1 meslektaşları tarafından geliştirilen bir yöntem kullanılarak anestezi fare kortekste tespit inhibitör itibaren istikrarlı, iyi izole edilmiş tek ünite kayıtları elde etmek için strateji paylaşıyoruz. Kayıtlar spesifik sinir hücresi alt gruplarda channelrhodopsin-2 (CHR2) ifade eden farelerde gerçekleştirilmiştir. Nüfusun üyeleri mavi ışık kısa bir flaş kendi tepkisi ile tanımlanır. "PINP" olarak adlandırılan, ya da Nöronal Popülasyonlarının photostimulation destekli Kimlik - - Bu teknik, standart dışı kayıt ekipmanı ile uygulanabilir. Bu genetik olarak tanımlanan hücreler, hücre dışı kayıtları hedefleme amacıyla, kalsiyum görüntüleme veya görme güdümlü yama için ucuz ve erişilebilir bir alternatif olarak kullanılabilir. Here gündelik pratikte yöntemini optimize etmek için bir ilkeler kümesi sağlar. Bu parvalbumin pozitif (PV +) hücre hedeflenmesi için özel olarak bu strateji rafine edilmiş, ancak bu tür somatostatin salgılayan (som +) ve kalretinin salgılayan (CR +) internöronlar gibi, hem de diğer interneuron türler için geçerlidir bulduk.

Protocol

NOT: Oregon Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan aşağıdaki protokol sağlık kuralları National Institutes uygundur.

1. Akut Cerrahi

  1. Intraperitonal (ip) enjeksiyon (Tablo 1) ile, bir ketamin-medetomidin kokteyl ile hayvan anestezisi.
    Not: Bu deneylerde kullanılan fare sürücü hatları (, SST-iCre12 SOM +; * Cr iCre12, CR + Pvalb-iCre11 PV +) interneuron bir CRE bağımlı ChR2 EYFP transgenik line10 çaprazlama yoluyla üretilir. CHR2 veya ilgili opsins viral iletim benzer ekspresyon düzeyleri elde varsayarak, eşit derecede iyi çalışmasıdır.
  2. Ameliyat başlamadan önce, emin olun hayvan sergiler nazik bir ayak tutam hiçbir yanıt olduğunu. Bu anestezi derinliği korumak için gerekli olarak deney boyunca anestezi yeniden yönetmek. Enjektabl anestezikler kullanıyorsanız, isteğe bağlı olarak bakım enjeksiyonlar için ip kateter implant.
  3. Tuzlu su ya da bakım enjeksiyonlar (Tablo 1), uygun bir şekilde seyreltilir anestezik kokteyli kullanarak, örneğin, deney boyunca laktatlanmış Ringer çözeltisi (yaklaşık 3 ml / kg / saat) ile sulu hayvan tutun.
  4. Sterotaksik veya diğer baş tutma cihazında hayvan yerleştirin. Kafatası iyi korunan emin olun. Bu kararlı tek hücre kayıtları muhafaza etmek için gereklidir.
  5. Kuruluğunu önlemek için gözlerin için opthalamic merhem sürün. 36,5-37 ° C vücut ısısını korumak.
  6. Ek kayıt istikrar için bir sisternal drenaj gerçekleştirin. Bir neşter bıçak kullanarak, sisterna magna maruz kafatasının arka yüzündeki doku kaldırmak. Serebrospinal sıvı boşaltmak için, dura içinde küçük bir çentik olun. Bıçağın sadece çok uç kullanın ve beyincik veya beyin sapıyla temas kaçının.
  7. Bisturi kullanarak, işitsel için (ilgi kortikal alanı üzerinde küçük bir kranyotomiyi (~ 2 mm 2) gerçekleştirmekkorteks bregmaya kabaca -2,3 mm posterior, orta hatta 4,5 mm lateral).
  8. Dura çıkarın ve sıcak 0.5 agaroz tabakası ile maruz korteksi kapak - 1 mm kalınlığında (tuzlu su içinde% 1.5 agaroz,% 0.9 NaCl, en geçerli ~ 37 ° C). Periyodik tuz birkaç damla damlatılarak deney boyunca agaroz nemli tutmak.

2. Kayıt Set-up

  1. Tungsten elektrot hazırlayın (7-14 MΩ, 127 mikron çapında, 12 ° konik ucu, epoksi kaplı). Bir cam kılcal tüp elektrodu superglue ve kavrama (Şekil 1) ısı ile büzülen boru ekleyin.
  2. Kortikal yüzeye dik seyahat için ayarlanmış bir motorlu (veya hidrolik) mikromanipülatör elektrot, monte edin. Kafatası karşı, deri altında bir tel zemin kaydırın. Onlar elektromiyografik eserler üretmek gibi baş tarafı ve boyun arkasındaki kasları ile temastan kaçının.
  3. Bir hücre dışı amfi kullanarak elektrik sinyali yükseltinTek ünite kayıt için uygun li fi er, tercihen bir empedans kontrol modu ile donatılmıştır. İki Osiloskoplara ve güçlendirilmiş hoparlör setini - devam eden spike aktivitesini (5000 Hz bant geçiren 300) izleyin. Burada, kaydedilen veriler 10 kHz örnekleme hızında sürekli sayısallaştırılmaktadır; ani çevrimdışı ayıklanır.
  4. Ucu korteks yüzeyine ulaşıncaya kadar agaroz aracılığıyla elektrot ilerlemek. Bir mikroskop aracılığıyla bu adımı gözlemleyin. "Sıfır" mikromanipülatör bu pozisyon.
  5. En iyi kayıt derinliğini tahmin etmek üzere görsel olarak penetrasyon sonunda elektrot geri çekildiği zaman, elektrot ucu sıfır derinlikte kortikal yüzeyinden çıkar olduğunu teyit etmektedir.
    Not: manipülatör okuma ve gözlenen elektrot konumu arasında bir farklılık bu dokuya göre sürüklenmiştir gösterir. Bu beyin ya da hayvan ya da manipülatör sürüklenme istikrarsızlık neden olabilir.
    1. Sağlamak için ilave bir kontrol olarakdoku ilk birkaç yüz mikrometre ile ilerletirken bu sıfır set-noktası korteks yüzeyine karşılık gelen, uyarıcı-uyarılmış alan potansiyelleri izlemek. Alan potansiyelleri izlerken, 10 Hz dışı amplifikatör alt bant geçiren filtre kesme indirin. Yerel alan potansiyelinin polaritesi tabakası I / II sınır 13 yakın, ~ 100 mikron derinliğinde etrafında tersine onaylayın. Bu işitsel korteks için güvenilir bir referans noktasıdır, ama diğer kortikal alanlar için farklı olabilir.
  6. Manuel bir mikromanipülatör üzerine bir mavi ışık kaynağı (Şekil 2) bağlı olan bir optik fiber monte edin. Mikroskop kullanarak, mümkün olan en agaroz yüzeyine yakın olarak, elyafın ucu yerleştirin. Elektrot dokuya girecek ışını Merkezlenmesi.
  7. Belirtilen genişlik ve duratio bir TTL (transistör-transistör mantığı) darbe katarı sunma yeteneğine bir kontrol ünitesi ile ışık kaynağının çıkış düzenleyenn, örneğin, bir Arduino (Şekil 3), (gösterildiği gibi), bir bilgisayar I / O kartı ya da ticari olarak temin edilebilir darbe üreteci.
    1. Her iki osiloskoplarda sinyali izleyin.
  8. Bir güç ölçer kullanarak fiber optik ucunda toplam ışık gücü (mW) ölçün. Elyaf çekirdeğin kesit alanına bölünmesi ile ışınlama (mW / mm2) hesaplamak için bu değeri kullanın. 10 aralığı içinde bir yoğunluk değeri ile başlayın - 15 mW / mm 2 ve gerekirse eserler ortadan kalkıncaya kadar aşağı doğru ayarlanır.
  9. Doku girmek için hazırlanıyor agaroz elektrot, hafif eserler için kontrol edin. Arama darbe tren başlatın (örneğin, 30 msn ışık darbeleri, 500 msn interstimulus aralığı (ISI)).
    1. Işığın açısını değiştirmek için elektrot için fiber optik göreceli konumlandırma geçici ışık eserler (Şekil 4) eleyin. Eserler devam ederse, ışık gücünü azaltmayı deneyin. The eserler tamamen (sadece minimize) elimine edilemez nadir durumda, arama darbenin süresini uzatmak. Bu doğru nöronal sivri tanınmasına yardımcı olabilir.

3. Düz PINP-in '

  1. Yaklaşık olarak 1 mm / sn bir hızda, beyin boyunca yavaşça elektrot ilerletin. Devam eden aktivitesini izlemek için bir osiloskop kullanın. Öte yandan, lazer impulslarından tetikleyebilir.
  2. Elektrot bir ChR2 + hücre yaklaşıyor ve sık sık elektrik sinyali osiloskop belirgindir önce iyi algılanan edilebileceğini belirtir ses monitörde ışık uyarılmış başak hafif bir 'karma', dinleyin. Avans hızını yavaşlatabilir.
    NOT: Hücre elektrot doğrudan yolunda yatıyor olursa, ışık uyarılmış aktivite büyük (ve yüksek sesle) artacak. Elektrot tek bir interneuron yaklaştıkça, karma eşit boyut ve şekle sahip küçük ama iyi tanımlanmış sivri olarak çözülür.
  3. En kısa sürede li gibiGHT-uyarılmış sivri ayrı osiloskop kapalı tetiklemek için yeterince büyük, bu yüzden yapmaya başlar. Başak dalga kesin şeklini gözlemlemek için yatay eksende ölçekleme ayarlayın.
  4. Durdurmak ve doku yerleşmek için bekleyin. Yakın hücreye elektrodu taşımak için günaha karşı. Bu adım, sabit bir kayıt için çok önemlidir. Birkaç dakika sonra sinyal-gürültü oranı gelişmiş değilse - ki, doku yerleşmiş, ancak herhangi bir yakın elektrot ucu hücreyi getirmemiştir - avansı 5 ileri um ve tekrar bekleyin.
    1. Tepe ya da aksiyon potansiyelinin çukur ya güvenilir bir gürültü kat (örneğin, +/- 300 mV veya daha fazla) üzerinde iyi ayarlanmış bir gerilim eşik ile çekilebilir kadar bu işlemi tekrarlayın.
      NOT: inhibitör internöronlardan PINPing zaman yanlış pozitif veya belirsizlik az risk var. Çoğu hücreleri kolayca 30 msn süresi ve inter-pul ile bakliyat bir tren takip edebilirsinizse aralığı 2-5 msn (Şekil 5) güvenilir bir ilk başak gecikme ile 500 msn, veya daha hızlı. PV + hücrelerinin büyük bir çoğunluğu, özellikle, bir tam olarak 1 sn (Şekil 6) ateşleme sağlanabilmektedir. Bu inhibitör nöronlar Çünkü, disinaptik (dolaylı) aktivasyonu önemli bir endişe değildir.
  5. Kayıt sırasında, ilk osiloskop devam eden etkinliğini izlemek. Boyutu ve ikinci osiloskop kullanarak sivri şekline yakın bir göz tutmak. Hoparlör kendi ses kalitesine dikkat edin.
    1. Hücre ya (onu kazığa veya hasar görme riski) elektrot çok yakın çizim belirtmek ani değişiklikler için dikkatle dinleyin, ya da uzağa sürüklüyor. Ani, büyük ve bozuk hale gelirse, dışarı geri; daha küçük büyürse, elektrot ilerlemek. 2 mikron adımda yavaş hareket.
    2. Zirve veya çukur için hizalanmış tüm başak dalga formları, atma tarafından kayıt sonrası hoc kalitesini onaylayın. Voltaj thres Varytutun. Eşik değerlerin geniş bir yelpazede, sadece hiç eşit yükseklikte (Şekil 5a) tutarlı bir başak şekli olmalıdır.
  6. Herhangi bir noktada sinyal bir komşu nöronun gelen sivri kirlenirse, hareket. Elektrot komşu hücre aralığının dışında geçer, ama hedef nöron aralığında kalacağını kapalı-şans, yavaş yavaş ilerlemek. (Bu genellikle başarısız olur.)
  7. Her penetrasyonu korteks (900+ mikron) tüm derinliği boyunca elektrot hareket ettirin. Işık-duyarlı nöronlar tersine, kayıtlar rutin komşu ChR2- hücrelerinden sivri ile kontamine birçok sızmalar veya sonra karşılaşılan, yeni bir elektrot deneyin.
    NOT: Hatta tek bir parti içinde, bireysel elektrotlar empedans ve ucu geometri önemli ölçüde değişebilir. Her iki faktör wh-ışık uyarılmış ani algılamak için yeterli büyüklükte olmalıdır elektrodun etkili "dinleme yarıçapı", katkıdaIle arama, henüz tek başına bir tek interneuron kayıt sağlayacak kadar sınırlı.
  8. Istediğiniz gibi elektrot empedansı test edin. Dokuya zarar görmesini önlemek için, iyi beyin dışında, agaroz tabakasının üst kısmında elektrodun ucu ile bunu. 7-14 MΩ aralığı içinde, tam olarak empedans bu uygulama için performans, veya verim kesin bir belirleyici değildir. Yani dinleme yarıçapı için makul bir vekil var, dedi: alt-empedanslı elektrotlar daha birimleri pick up; yüksek empedans, az.
  9. Deneyin sonunda, böyle anestezi derinliğinin düzlemi altında anestetik aşırı dozda, ya da servikal bozma gibi kurumsal onaylı vasıtasıyla, hayvan euthanize.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz burada "Lima ve ark. 1. Tablo 1 ayrıntıları önerilen anestezik kokteyl, ketamin-Medetomidin-acepromazine (tarafından geliştirilmiş bir Optogenetic yöntemi kullanılarak, anestezi fare kortekste genetik ilan inhibitör gelen tek birim kayıtları elde etmek için stratejimizi paylaşmak KMA "). Şekil 1 Şekil 4. 3 Arduino mikrodenetleyici ile ışık çıkışı yolluk için yapılandırma ve kodu içeren Şekil. 2 basit bir LED kontrol ünitesi için bir devre şeması içeren Şekil. Kayıt için hazırlanmış bir tungsten mikroelektrot, tasvir bir örneğini göstermektedir ışık kaynaklı elektrik eserler Protokolde tartıştı. Eserler bazen (sol panel) karşılaştı, ancak kolayca (sağ panel) düzeltilir. 5 optik tanımlanan internöronlar üç tip (PV + CR + ve SOM +) dan örnek kayıtları göstermektedir. Sol panel bu strateji ile elde bekleyebilirsiniz ham gerilim izleri ve uyumlu dalga formları, sinyal-gürültü oranı birinin tür temsilcisini gösterir. Spike güvenilir birkaç yüz mikrovoltluk sabit bir gerilim eşik ile yakalanır. Bir raster arsa (sağ panel) ChR2 pozitif internöronlar net tanımlanması için izin ışık uyarılmış yanıtlar, kısa gecikme ve güvenilirlik gösterir. Şekil 6 1 sn ışık darbe yanıt, üç PV + internöronlar izler gerilimi Şekil. PV + hücrelerin çoğunluğu, milisaniye yüzlerce ateş onları özellikle kolay tanınabilmesi için yüksek frekans sürdürebilir.

Şekil 1,
Şekil 1. Bir elektrot hazırlanması.   Hazırlanmış bir elektrot (A) Diyagram. Elektrot Affi olduğuİki Süper Tutkal küçük damla ve (örneğin Zap-It gibi) hızlandırıcı kullanarak az miktarda cam bir kılcal tüp duran. Isı Sıkma lastiğini çok düşük ısı kullanılarak tutuş için ilave edilir. Elektrotlar genellikle bir elektrot tutucu monte hazırlanmış bir tungsten mikro bir konektör pimi önceden takılmış. (B) Fotoğraf ile gemi.

Şekil 2,
Şekil 2. LED kontrol ünitesi için devre şeması. Işık teslimat için basit ve ucuz bir devre. Bir süper-parlak ışık (475 nm), bir ısı dağıtma tertibatı bağlanmış ve bir fiber optik kablo (800 um çapında) diğer ucuna bağlıdır. LED çıkışı TTL darbesi ile işlenir. Kontrol ünitesi ayarlanabilir ışık yoğunluğu bir gerilim-mode güç kaynağı içermektedir. 2K POT: ışık yoğunluğunu kontrol etmek potansiyometre. P / S: DC güç supp ly (örneğin, dizüstü bilgisayar şarj cihazı). İPUCU 122: Darlington transistörü. 4N35: Optik izolatör. Burada listelenen parçalar <$ maliyeti 10.

Şekil 3,
Şekil 3. Arduino kodu ve yapılandırma. Işık çıkışı yolluk için bir TTL darbe tren Arduino mikrodenetleyici kullanılarak oluşturulabilir. Program bir döngü darbe tren için bir darbe süresi ve ISI belirtir. Tahta üzerine programın yüklenmesi için Talimatları ARDUINO en "Başlarken" sayfasında bulabilirsiniz ( http://arduino.cc/en/Guide/HomePage ). Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

igure 4 "fo: içerik-width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 51757 / 51757fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
. (; - 5000 Hz filtre sinyali, 300 sol panel) Şekil 4. Işık eserdir Metal elektrotlar başlangıcında mevcut ve bakliyat ofset ışık eserler, duyarlıdır. Genellikle ışığın açısını değiştirmek için elektrot için fiber optik göreli konumlandırma, ve / veya ışık gücü azalan tamamen (sağ panel) elimine edilebilir.

Şekil 5,
5. Örnek hücreleri Şekil. (A), optik olarak tespit internöronlar PV + (mor), CR + (yeşil), SOM + (kırmızı) için tipik bir örnek kayıtları. Hücreler arama darbe tren sivri güvenilir bir patlama ile (darbe süresi 30 ms ISI 500 ms) yanıt verir. Sağa paneli 100 kanal hizalanmış ani gösterir ve., ortalama interpolasyon dalga (10 kHz örnekleme oranından oversampled 10x) aynı dosyaları için (B) Raster araziler kısa gecikme (~ 2-5 msn) göstermektedir. ışık uyarılmış sivri ve tutarlı zamanlama (C) Ortalama ve İlk başak gecikmeleri standart sapma - 44 PV + internöronlar (ortalama ortalama ve standart sapma: 3.4 +/- 2.6 msn) bir örnek için (5 10 darbe). Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil sürekli yanıtları 6. örnekleri bunların çoğunluğu milisaniye yüzlerce ateş yüksek frekans sürdürmek gibi bir PV + internöronlardan belirlenmesinde özellikle emin olabilirsiniz -. Akımına verdikleri yanıtlara hatırlatanin vitro 14 enjeksiyonu. 1 sn ışık darbeleri yanıt Üç ChR2 / PV hücreler: darbesinin tüm süresi boyunca düzenli olarak ateş, iki, ve değil bir hücrenin olağandışı bir örnek (<karşılaştı hücrelerin% 10).

Tablo 1. Ketamin-Medetomidin-acepromazine ("KMA"). Knock-down hidrasyon korumak için sulandırılmış bir yetişkin fare, ve idame dozunun. Gerekirse, 90 dakika - kokteyl her 40-uygulanır re.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PINP kavramsal olarak basit olmasına rağmen, pratikte zor olabilir. Başarının önemli bir belirleyici elektrot seçimdir. Elektrik dinleme çapı kritik bir parametredir. Bu ucu bazı mesafe uzakta bir ChR2 + hücreden hala zaman bir doğrultuda ilerleme hızını ayarlayabilirsiniz, böylece ışık-uyarılmış ani algılamak için yeterince büyük olmalıdır. Aynı zamanda, iyi bir tek birim izolasyonu sağlayacak kadar kısıtlanmalıdır. Bu elektrot da komşu ChR2- birimlerinden ani almak, olmamalıdır. Dinleme yarıçapı açısından doğru dengeyi herhangi bir hedef hücre tipi için bir meydan okuma olabilir, ama nispeten büyük bir ekstraselüler var, seyrek, küçük ve sık sık hücreleri piramidal yakın bulunan inhibitör internöronlar, için özellikle doğrudur olacak fırlar. Burada bile önerilen stratejileri kullanarak, beklenen verim yüksek değildir. Bizim tipik verim bizim criter verilen, 0-2 PV + nöronlar / hayvan oldumükemmel tek ünite tecrit ia ve kayıtları yarım saatten fazla süren.

Inhibitör nöronlar PINPing zaman inhibitör nöronlar dolaylı postsinaptik hücreleri aktive nispeten olası değildir, çünkü, disinaptik (dolaylı) aktivasyonu, büyük bir endişe değildir. Uyarıcı nöronlar PINPing için disinaptik aktivasyon yaygındır; ışığa tepki olarak ateş çok nöronlar ChR2 ifade ziyade yapmak olanlardan güçlü sinaptik uyarma almıyorsunuz. Dolaylı olarak aktive nöronlardan ayırt direk olarak stratejileri Lima ve diğerleri. 1 'de ayrıntılı olarak ele alınmaktadır.

Elektrot Hususlar

Biz sistematik elektrotlar ve kayıt çeşitli teknikler araştırdı: farklı boyutlarda ipuçları ile cam yama pipetler, empedans ve uç geometrisi ve çok kanallı diziler (örneğin, tetrodes) değişen tungsten Mikroelektronlar. Açısal, yüksek-empedans tungsten Mikroelektronlar(Burada önerilen), bugüne kadar, en iyi verim verdi. Bu tekniklerin her biri ile karşılaşılan sorunların bir tartışma izler.

Düşük empedanslı tetrode dizileri ve çok kanallı problar kullanılarak, rutin ışık uyarılmış ani tespit; Ancak, güvenilir bir sıralamak için nadiren yeterince büyük. Diğer bir deyişle, sinyal-gürültü oranı (SNR), tatmin edici değildi. Biz bazen tetrodes ile mükemmel kayıtları aldın, ama asimptotik verim tek tungsten mikroelektrotla yüksek olduğu ve kayıtların kalitesi çok daha iyi oldu. Tetrode ipuçları hayvan başına mümkün geçişlerin sayısını sınırlı yanı sıra, hangi nispeten künt vardır. Çok kanallı problar ile karşılaşılan sorunlar büyük olasılıkla geniş yüzeyi aydınlatma kullanımı sonucunda şiddetlenmiştir. Implante bir lif hedeflenen, düşük güç uyarılması aksine, yüzey aydınlatma bindirilmiş başak dalga biçimleri lider, kayıt alanının ötesinde ChR2 + nöronların eşzamanlı ateşleme neden olursıralamak daha güçtür.

Standart gevşek hücre bağlı kayıtları için kullanılan, cam gibi yama elektrotlar, ayrıca görev için çok uygundur, ancak farklı nedenlerden dolayı değil. Düşük direnci (<5 MΩ) yama elektrotlar kuvvetle zor inhibitör internöronlardan hedef kılan, piramidal hücrelere karşı önyargılı. Bu yüksek direnci (küçük uç) elektrotlar, onların son derece kısıtlı dinleme yarıçapı patch elektrodlar ile büyük bir sorun kullanarak bir ölçüde düzeltilebilir iken. Hücreye bağlı yama kayıtlar çok yüksek SNR sağlamakla birlikte, açık-responsif hücreler, hücre bağlı modunun dışında tespit edilemez. Patch elektrodlar ile strateji kaçınılmaz, rastgele ve sırayla inhibitör internöronlardan ChR2 ifade edilir çok az olan hücre bağlı kayıtları, elde etmek, olduğunu.

Yüksek empedans tungsten elektrotlar bir kova ilehem mesafeden ışık uyarılmış sivri algılamak ve iyi tek ünite izolasyonu sağlamak. Ucunun geometrisi belki de en önemli faktördür. 5-12 ° 14 MΩ, ve uç açıları - Biz 2 arasında değişen empedanslarda, iki üreticilerin tungsten elektrotları çalıştı. Biz 12 ° uç açıları daha üstün olduğunu gördük, ama kesin empedans 7 aralığında, daha az önemli olduğunu - 14 MΩ. Biz cam kaplı elektrotlar epoksi kaplı elektrotlara kıyasla hafif eserler daha duyarlı bulundu, bu yüzden ikinci öneririz. Biz kendi özel tungsten elektrotları yapmak girişimi yoktu. Elektrot herhangi bir tür olduğu gibi, yaygın hata modları izolasyonunu kaybetmek ya da bir nöron yaralama. Farklı uç parametreler bu üzerinde fazla etkiye sahip görünmemektedir. Aksine, yerleşmek için doku bekleyen yüksek kaliteli kayıtlar muhafaza daha önemli bir faktördür.

Işık Teslimat

Işık sadece bir kullanılır çünküyerine özel bir şekilde kendi çıkış düzenleyen - - sa ChR2 pozitif hücrelerin belirlenmesi anlamına gelir, bu deney için kullanılabilir yoğunluklarının aralığı geniştir. Bir alt sınır yoğunluk ilgi hücrelerin maksimum derinlikte ChR2 pozitif hücrelerini aktive etmek için yeterli olmalıdır gerçeği ile ayarlanır. Biz ucu Irradiances> 5 mW / mm 2 beyin memeli doğrudan ölçümlere dayalı bir hesap makinesi kullanılarak tahmin edilebilir içinde belirli derinliklerde derin Layer 6. irradiance sağlam PV yanıtlar + hücreleri ortaya çıkarmak için yeterli idi (470 nm'de ölçülen) bulundu beyin dokusu (örneğin, http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php ), ama biz güçlü (düşük empedans mikroelektrot kullanarak, ampirik kendi deneyleri için asgari belirlenmesi 1 tavsiye - 3 MΩ) Multiünit aktivitesi için. Üst sınır gerçeği ile ayarlanmış yüksek niyetlerininversiteler uyarılmış başak algılama zorlaştırıp ışık eserler neden olabilir. Transgenik hayvanlarda yüksek yoğunluklar ayrıca boyun ve baş maruz pv + kas ChR2 aktive ederek elektromyografik eserler neden olabilir.

Kendi ışık dağıtım sistemi inşa ederken, bir fiber optik LED bir bağlantı, bir beyin üzerinden doğrudan LED yerleştirerek daha nihayetinde daha uygun olduğunu gördük. İkinci ışık sağlamak için çok etkili bir yoldur, ancak bazı pratik dezavantajları vardır. Cihaz üzerinden akan akım korumalı olmalıdır elektrik eserler üreten ve LED büyük bir ısı bloğu ile atılması gereken önemli ısı üretir. Ayrıca, (fotovoltaik ve elektromiyografik hem de) hafif eserler çok daha zor LED geniş aydınlatma deseni ile kontrol etmek içindir. Fiber bağlantı, bütün bu meselelerin çözer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

KMA (20.0 mi)
100 mg 2 ml / ml Ketamin (10 mg / ml bir defa seyreltildi)
1 mg, 0.4 ml / ml Dexdomitor (medetomidin, 0.02 mg / ml bir defa seyreltildi)
100 mg, 0.05 ml / ml asepromazin (0.25 mg / ml bir defa seyreltildi)
% 0.9 tuzlu su 17,55 mi
Dozaj, yetişkin fare (15-40 gr)
Knock-down: 0.012 ml / g * vücut kitle (ketamin = 120 mg / kg)
Bakım: 0.0025 ml / g * vücut kütlesi (Ketamin 25 mg / kg),
Name Company Catalog Number Comments
ChR2-EYFP Line Jackson Colonies 12569
Pvalb-iCre (PV) Line Jackson Colonies 8069
Sst-iCre (SOM) Line Jackson Colonies 13044
Cr-iCre (CR) Line Jackson Colonies 10774
Agarose Sigma-Aldrich A9793 Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook) FST 10066-15
Surgical Scissors FST 14084-09
Scalpel FST 10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic Ointment Foster & Smith 9N-76855
Homeothermic Blanket Harvard Apparatus 507220F
Tungsten Microelectrodes A-M Systems 577200 12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass Tubing Warner Instruments G150TF-3
Heat Shrink Tubing DigiKey A332B-4-ND
Zapit Accelerator DVA SKU ZA/ZAA Use with standard Super Glue. 
Microelectrode AC Amplifier 1800 AM Systems 700000
MP-285 Motorized Micromanipulator Sutter MP-285
4-channel Digital Oscilloscopes Tektronix TDS2000C
Powered Speakers Harman Model JBL Duet
Manual Manipulator Scientifica LBM-7
800 µm Fiber Optic Patch Cable ThorLabs FC/PC BFL37-800
Power Meter ThorLabs PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-E DigiKey XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).
Arduino UNO DigiKey 1050-1024-ND

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, (2009).
  2. Moore, A. K., Wehr, M. Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency. J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).
  3. Merchant, H., de Lafuente, V., Pena-Ortega, F., Larriva-Sahd, J. Functional impact of interneuronal inhibition in the cerebral cortex of behaving animals. Prog Neurobiol. 99, 163-178 (2012).
  4. Markram, H., et al. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nat Rev Neurosci. 5, 793-807 (2004).
  5. Atallah, B. V., Bruns, W., Carandini, M., Scanziani, M. Parvalbumin-expressing interneurons linearly transform cortical responses to visual stimuli. Neuron. 73, 159-170 (2012).
  6. Wilson, N. R., Runyan, C. A., Wang, F. L., Sur, M. Division and subtraction by distinct cortical inhibitory networks in vivo. Nature. 488, 343-348 (2012).
  7. Letzkus, J. J., et al. A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex. Nature. 480, 331-335 (2011).
  8. Pi, H. J., et al. Cortical interneurons that specialize in disinhibitory control. Nature. 503, 521-524 (2013).
  9. Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. A neural circuit for spatial summation in visual cortex. Nature. 490, 226-231 (2012).
  10. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  11. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3, 159 (2005).
  12. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  13. Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex. J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).
  14. Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8, 70553 (2013).

Tags

Nörobilim Sayı 93 Optogenetik channelrhodopsin ChR2 korteks, dışı parvalbumin interneuron fare elektrofizyoloji
A Guide<em&gt; In vivo</emOptogenetically Belirlenen Kortikal inhibitör dan&gt; Tek birim Kayıt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moore, A. K., Wehr, M. A Guide to… More

Moore, A. K., Wehr, M. A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons. J. Vis. Exp. (93), e51757, doi:10.3791/51757 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter