Abstract
Un défi majeur dans la neurophysiologie a été de caractériser les propriétés de réponse et la fonction de nombreux types de cellules inhibiteur dans le cortex cérébral. Nous partageons ici notre stratégie pour obtenir stables, bien isolées enregistrements unitaires de interneurones inhibiteurs identifiés dans le cortex de souris anesthésiée à l'aide d'une méthode développée par Lima et ses collègues 1. Les enregistrements sont effectués dans des souris exprimant channelrhodopsin-2 (ChR2) dans les sous-populations neuronales spécifiques. Les membres de la population sont identifiés par leur réponse à un bref éclair de lumière bleue. Cette technique - appelée «PINP", ou identification Photostimulation assistée de neurones populations - peuvent être mises en œuvre avec l'équipement d'enregistrement extracellulaire standard. Il peut servir comme une alternative peu coûteuse et accessible à l'imagerie de calcium ou patch visuellement guidé, dans le but de cibler des enregistrements extracellulaires de cellules génétiquement déterminées. Havant que nous fournissons un ensemble de lignes directrices pour l'optimisation de la méthode dans la pratique quotidienne. Nous avons affiné notre stratégie spécifiquement pour cibler des cellules de parvalbumin positif (PV +), mais nous avons trouvé que cela fonctionne pour d'autres types de interneurones ainsi, comme (CR +) interneurones Calretinin exprimant la somatostatine exprimant (SOM +) et.
Protocol
REMARQUE: Le protocole suivant est en conformité avec les Instituts nationaux de la santé des lignes directrices approuvées par l'Université de l'Oregon de protection des animaux et l'utilisation Comité.
1. Chirurgie aiguë
- Anesthésier l'animal avec un cocktail de kétamine-médétomidine, par voie intrapéritonéale (ip) injection (tableau 1).
REMARQUE: Les souris utilisées dans ces expériences sont générées par croisement d'une CHR2-EYFP transgénique ligne 10 cre dépendant de interneurone lignes d'attaque (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Livraison virale de ChR2 ou opsins connexes doit fonctionner aussi bien, en supposant que les niveaux d'expression similaires sont obtenus. - Avant de commencer la chirurgie, veiller à ce que les expositions d'animaux pas de réponse à un pincement de l'orteil douce. Re-administrer des anesthésiques pendant toute l'expérience nécessaire pour maintenir cette profondeur de l'anesthésie. Si l'utilisation d'anesthésiques injectables, éventuellement implanter un cathéter IP pour les injections d'entretien.
- Maintenir l'animal hydraté avec une solution saline ou une solution de Ringer-lactate tout au long de l'expérience (environ 3 ml / kg / h), par exemple en utilisant un cocktail anesthésiant diluée de manière appropriée pour des injections d'entretien (tableau 1).
- Placer l'animal dans un dispositif de maintien de tête stéréotaxique ou autre. Assurez-vous que le crâne est bien fixé. Cela est essentiel pour le maintien des enregistrements de cellules individuelles stables.
- Appliquer une pommade pour les yeux opthalamic pour prévenir la sécheresse. Maintenir la température du corps à 36,5 à 37 ° C.
- Effectuer une vidange cisternal pour la stabilité d'enregistrement supplémentaire. En utilisant une lame de scalpel, enlever les tissus de la face postérieure du crâne pour exposer la grande citerne. Faire une petite entaille dans la dure-mère pour drainer le liquide céphalo-rachidien. Utilisez seulement la pointe de la lame, et éviter tout contact avec la tige de cervelet ou du cerveau.
- Utilisation du scalpel, effectuer une petite craniotomie (~ 2 mm 2) sur la zone corticale d'intérêt (par auditifcortex, environ -2,3 mm postérieure du bregma, 4,5 mm latéral de la ligne médiane).
- Retirer la dure-mère et couvrir le cortex exposé avec une couche d'agarose chaud de 0,5 à 1 mm d'épaisseur (1,5% d'agarose dans une solution saline, 0,9% de NaCl; appliquer à ~ 37 ° C). Gardez le agarose humide tout au long de l'expérience en appliquant périodiquement quelques gouttes de solution saline.
2. Enregistrement Set-up
- Préparer une électrode de tungstène (7-14 MQ, 127 um de diamètre, 12 ° pointe effilée, avec revêtement époxy). Superglue l'électrode à un tube capillaire en verre et ajouter une gaine thermorétractable de chaleur pour une prise (Figure 1).
- Monter l'électrode sur un micromanipulateur motorisé (ou hydraulique), mis à voyager perpendiculaire à la surface corticale. Faites glisser un terrain de fil sous la peau, contre le crâne. Eviter le contact avec les muscles sur le côté de la tête et l'arrière du cou, car ils peuvent générer des artefacts électromyographiques.
- Amplifier le signal électrique en utilisant un ampli extracellulaireli fi cateur approprié pour l'enregistrement unitaire, de préférence équipé d'un mode de contrôle d'impédance. Surveiller l'activité de dopage en cours (passe-bande 300 - 5000 Hz) avec deux oscilloscopes et un ensemble de haut-parleurs. Ici, les données enregistrées sont numérisées en continu à un débit de 10 kHz d'échantillonnage; les pointes sont extraits hors ligne.
- Avancer l'électrode à travers l'agarose jusqu'à la pointe atteint la surface du cortex. Observez cette étape à travers un microscope. "Zéro" de cette position sur le micromanipulateur.
- Pour mieux se rapprocher de la profondeur de l'enregistrement, vérifiez visuellement que la pointe de l'électrode sort de la surface corticale à une profondeur de zéro lors du retrait de l'électrode à la fin d'une pénétration.
REMARQUE: Un décalage entre la lecture de manipulateur et la position de l'électrode observé indique qu'il a dérivé par rapport au tissu. Cela peut être causé par l'instabilité du cerveau ou de l'animal, ou la dérive de manipulateur.- Comme une vérification supplémentaire pour assurer quecette valeur de consigne de zéro correspond à la surface du cortex, surveiller les potentiels de champ évoqués stimulation tout en avançant à travers les quelques premières centaines de micromètres de tissu. Lors de la surveillance des potentiels de champ, abaisser le plus bas passe-bande de coupure du filtre de l'amplificateur extracellulaire de 10 Hz. Assurez-vous que la polarité du potentiel de champ local inverse autour d'une profondeur d'environ 100 um, à proximité de la couche I / II frontière 13. Ceci est un point de référence fiable pour cortex auditif, mais il peut être différent pour d'autres aires corticales.
- Monter une fibre optique couplée à une source de lumière bleue (figure 2) sur un micromanipulateur manuel. Utilisation du microscope, positionner l'extrémité de la fibre au plus près de la surface de l'agarose en tant que possible. Centrer le faisceau où l'électrode va entrer dans le tissu.
- Réguler la sortie de la source de lumière avec une unité de commande capable de fournir un TTL (logique transistor-transistor), le train d'impulsions de largeur et duratio spécifién-, par exemple, un Arduino (figure 3), une carte informatique d'E / S (comme illustré), ou un générateur d'impulsions disponibles dans le commerce.
- Surveiller le signal sur les deux oscilloscopes.
- Mesurer la puissance totale de la lumière (mW) à l'extrémité de la fibre optique à l'aide d'un wattmètre. Utiliser cette valeur pour le calcul de l'éclairement énergétique (mW / mm 2) en divisant par la surface de section transversale du coeur de la fibre. Commencer avec une valeur d'intensité dans la gamme de 10 à 15 mW / mm 2 et d'ajuster vers le bas, si nécessaire, jusqu'à ce que les artefacts sont éliminés.
- Vérifiez objets légers avec l'électrode dans l'agarose, prêt à entrer dans le tissu. Lancer la recherche train d'impulsions (par exemple, 30 impulsions lumineuses ms, 500 ms d'intervalle interstimulus (ISI)).
- Éliminer les artefacts lumineux transitoires (figure 4) par le repositionnement de la fibre optique par rapport à l'électrode de changer l'angle de la lumière incidente. Si artefacts persistent, essayez de diminuer la puissance lumineuse. En ee de rares cas que les objets ne peuvent pas être complètement éliminés (seulement réduit), prolonger la durée de l'impulsion de la recherche. Cela peut aider à identifier les véritables pointes neuronales.
3. Droit PINP-in '
- Avancer l'électrode lentement à travers le cerveau à une vitesse d'environ 1 um / sec. Utilisez un oscilloscope pour surveiller l'activité en cours. D'autre part, déclencher les impulsions laser.
- Écoutez le «hachage» faible de pointes légères évoqués sur le moniteur audio, ce qui indique que l'électrode est proche d'une cellule ChR2 + et peut souvent être perçue bien avant que le signal électrique est apparent sur l'oscilloscope. Ralentir le rythme de l'avance.
NOTE: Si la cellule se trouve directement dans la trajectoire de l'électrode, le voyant d'activité évoqués se grandir (et fort). Comme l'électrode se rapproche d'un seul interneurones, le hachage résoudre en petits mais bien définis pointes de taille uniforme et la forme. - Dès que lipointes GHT évoqués sont assez grands pour déclencher de façon individuelle sur l'oscilloscope, commencer à le faire. Réglez l'échelle sur l'axe horizontal à observer la forme exacte de la forme d'onde de pic.
- Arrêtez-vous et attendez que le tissu à régler. Résistez à la tentation de déplacer l'électrode plus près de la cellule. Cette étape est essentielle pour un enregistrement stable. Si après plusieurs minutes, le rapport signal-sur-bruit n'a pas amélioré - ce qui est, le tissu est réglé, mais il n'a pas apporté la cellule tout près de la pointe de l'électrode - avance de 5 um et plus encore attendre.
- Répétez ce processus jusqu'à ce que le pic ou le creux de potentiel d'action peuvent être capturés de façon fiable avec un seuil de tension bien placé au-dessus du bruit de fond (par exemple, +/- 300 mV ou plus).
REMARQUE: Il ya peu de risque de faux positifs ou ambiguïté quand PINPing interneurones inhibiteurs. La plupart des cellules peuvent facilement suivre un train d'impulsions d'une durée de 30 ms et inter-pulintervalle de 500 ms ou plus rapide, avec un temps de latence fiable premier pic de 2-5 ms (Figure 5) soi. La majorité des cellules photovoltaïques +, en particulier, peut soutenir la cuisson pour un plein 1 sec (Figure 6). Parce que ce sont les neurones inhibiteurs, disynaptique activation (indirect) est pas une préoccupation majeure.
- Répétez ce processus jusqu'à ce que le pic ou le creux de potentiel d'action peuvent être capturés de façon fiable avec un seuil de tension bien placé au-dessus du bruit de fond (par exemple, +/- 300 mV ou plus).
- Pendant l'enregistrement, surveiller l'activité en cours sur le premier oscilloscope. Gardez un œil sur la taille et la forme des pointes en utilisant la deuxième oscilloscope. Notez la qualité de leur son sur le haut-parleur.
- Écoutez attentivement les changements brusques, qui indiquent que la cellule est soit tire trop proche de l'électrode (où elle risque d'être empalé ou endommagé), ou est à la dérive. Si les pointes deviennent grands et déformée, revenir en arrière; si elles poussent plus petit, avancer l'électrode. Déplacez-vous lentement en 2 étapes um.
- Confirmer la qualité de la post-hoc de l'enregistrement par superposition de toutes les formes d'onde de pic, alignés à pic ou un creux. Variez les thres de tensiontenir. Dans un large éventail de valeurs de seuil, il devrait jamais être une forme de pic cohérent de hauteur uniforme (figure 5a).
- Si à tout moment le signal est contaminée avec des pointes d'un neurone voisin, avancer. Avancer lentement, sur le peu de chance, l'électrode va passer hors de portée de la cellule voisine, mais rester à portée du neurone cible. (Cela est généralement sans succès.)
- Déplacer l'électrode à travers toute la profondeur du cortex (900 + pm) à chaque pénétration. Si aucun neurones sensibles à la lumière sont rencontrés après de nombreuses pénétrations ou, au contraire, les enregistrements sont régulièrement contaminés avec des pointes à partir de cellules ChR2- voisins, essayez une nouvelle électrode.
NOTE: Même à l'intérieur d'un seul lot, l'impédance et pointe géométrie des électrodes individuelles peut varier considérablement. Ces deux facteurs contribuent à la "rayon écoute" efficace de l'électrode, qui doit être suffisamment grande pour détecter des pics de lumière évoqués while recherche, mais suffisamment restreint pour permettre l'enregistrement d'un seul interneurones dans l'isolement. - Tester l'impédance d'électrodes comme vous le souhaitez. Pour éviter d'endommager le tissu, le faire avec la pointe de l'électrode dans la partie supérieure de la couche d'agarose, bien en dehors du cerveau. Dans la gamme de 7-14 MQ, l'impédance exact est pas un indicateur sûr de la performance, ou rendement, pour cette application. Cela dit, il est une approximation raisonnable de rayon écoute: électrodes à faible impédance ramasser plusieurs unités; de plus grande impédance, moins.
- A la fin de l'expérience, euthanasier l'animal au moyen institutionnel approuvées, comme surdose d'un anesthésique ou la dislocation cervicale sous un plan d'anesthésie profonde.
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Representative Results
Nous ici partageons notre stratégie pour obtenir des enregistrements unitaires de interneurones inhibiteurs génétiquement petites dans le cortex de souris anesthésiée, en utilisant une méthode optogenetic développé par Lima et al. Tableau 1 détaille le cocktail anesthésie suggéré, la kétamine-médétomidine-acépromazine (1. " KMA "). La figure 1 illustre une micro-électrode de tungstène, préparée pour l'enregistrement. La figure 2 présente un schéma de principe d'une unité de commande de diode simple. La figure 3 contient la configuration et un code pour déclencher la sortie de lumière avec un microcontrôleur Arduino. La figure 4 montre un exemple de les artefacts électriques induite par la lumière discutés dans le Protocole. Les artefacts sont parfois observées (panneau de gauche), mais facilement corrigées (panneau de droite). La figure 5 montre un exemple des enregistrements à partir de trois types d'interneurones optiquement identifiés (PV +, CR +, et + SOM). Le pa gauchenel montre des traces de tension premières et formes d'onde alignés, représentant du type de signal-sur-bruit, on peut espérer obtenir avec cette stratégie. Spikes sont capturés de manière fiable avec un seuil de tension fixe de plusieurs centaines de microvolts. Une parcelle de trame (à droite) montre le court temps de latence et la fiabilité des réponses claires évoqués, qui permettent d'identifier sans équivoque les interneurones ChR2-positifs. La figure 6 montre la tension traces de trois PV + interneurones, en réponse à une impulsion de lumière 1 sec. La majorité des cellules photovoltaïques + peut soutenir à haute fréquence de tir pour des centaines de millisecondes, ce qui les rend particulièrement facile à identifier.
Figure 1. Préparation d'une électrode. (A) Schéma d'une électrode préparée. L'électrode est affixé à un tube capillaire en verre à l'aide de deux petites gouttes de Super Glue et une quantité minimale d'accélérateur (tel que Zap-It). gaine thermorétractable de chaleur est ajouté pour une meilleure adhérence, utilisant une basse température. Électrodes sont généralement livrés avec un. (B) Photographie broches du connecteur pré-assemblées d'une micro-électrode de tungstène prêt monté dans un porte-électrode.
La figure 2. Schéma de principe d'une unité de contrôle LED. Un circuit simple et bon marché pour la livraison de la lumière. Une LED super-lumineux (475 nm) est fixée à un dissipateur de chaleur et couplé à l'autre extrémité d'un câble à fibre optique (800 um de diamètre). La sortie de la DEL est déclenché par une impulsion de durée de vie. L'unité de commande comprend une alimentation en tension de mode pour l'intensité lumineuse réglable. 2K POT: potentiomètre pour contrôler l'intensité lumineuse. P / S: DC supp ment (par exemple, chargeur de portable). TIP 122: transistor Darlington. 4N35: isolateur optique. Les pièces mentionnées ici coûtent <10 $.
Figure 3. Code Arduino et la configuration. Un train d'impulsions TTL pour déclencher la production de lumière peuvent être générés en utilisant un microcontrôleur Arduino. Le programme spécifie une durée d'impulsion et l'ISI pour un train d'impulsions en boucle. Instructions pour charger le programme sur la carte peuvent être trouvés sur "Getting Started" la page de Arduino ( http://arduino.cc/en/Guide/HomePage ). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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. Figure 4. artefact Lumière électrodes métalliques sont sensibles à la lumière, des objets présents à l'apparition et le décalage d'impulsions (panneau de gauche; signal filtré, 300 - 5000 Hz). Ils peuvent généralement être éliminés complètement (à droite) en repositionnant la fibre optique par rapport à l'électrode de changer l'angle de la lumière incidente, et / ou la diminution de la puissance lumineuse.
Figure 5. Exemple cellules. (A) Exemple enregistrements typiques de interneurones optiquement identifiés, PV + (violet), le CR + (vert), SOM + (rouge). Les cellules répondent à train d'impulsions de recherche (durée d'impulsion de 30 ms, 500 ms) de l'ISI avec une rafale fiable de pointes. Le panneau de droite montre 100 pointes de creux alignés et. la forme d'onde moyenne interpolée (10x échantillonné à partir d'un taux de 10 kHz d'échantillonnage) (B) de parcelles de trame pour les mêmes fichiers montrent la courte latence (~ 2 - 5 ms). et le calendrier cohérent de pointes légères évoqués (C) moyenne et écart-type de latences premier pic (5 - 10 secs) pour un échantillon de 44 PV + interneurones (moyenne moyenne et écart-type: 3,4 +/- 2,6 ms). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Exemples de réponses durables On peut être particulièrement confiant dans l'identification des PV + interneurones comme la majorité d'entre eux peut soutenir à haute fréquence de tir pour des centaines de millisecondes -. Rappellent leurs réponses à courantinjection in vitro 14. Trois cellules ChR2 / PV qui répondent à des impulsions lumineuses d'une sec: deux qui tirent régulièrement pendant toute la durée de l'impulsion, et un exemple inhabituel d'une cellule qui ne fait pas (<10% de cellules rencontrées).
| KMA (20,0 ml) | |||
| 2 ml de 100 mg / ml de kétamine (10 mg / ml, une fois dilué) | |||
| 0,4 ml de 1 mg / ml DEXDOMITOR (médétomidine; 0,02 mg / ml, une fois dilué) | |||
| 0,05 ml de 100 mg / ml acépromazine (0,25 mg / ml, une fois dilué) | |||
| 17,55 ml de solution saline 0,9% | |||
| Dosage, souris adulte (15-40 g) | |||
| Knock-down: 0,012 ml / g * masse corporelle (kétamine = 120 mg / kg) | |||
| Entretien: 0,0025 ml / g * masse corporelle (kétamine = 25 mg / kg) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChR2-EYFP Line | Jackson Colonies | 12569 | |
| Pvalb-iCre (PV) Line | Jackson Colonies | 8069 | |
| Sst-iCre (SOM) Line | Jackson Colonies | 13044 | |
| Cr-iCre (CR) Line | Jackson Colonies | 10774 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | Type III-A, High EEO |
| Micro Point (dural hook) | FST | 10066-15 | |
| Surgical Scissors | FST | 14084-09 | |
| Scalpel | FST | 10003-12 (handle), 10011-00 (blades) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Foster & Smith | 9N-76855 | |
| Homeothermic Blanket | Harvard Apparatus | 507220F | |
| Tungsten Microelectrodes | A-M Systems | 577200 | 12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated |
| Capillary Glass Tubing | Warner Instruments | G150TF-3 | |
| Heat Shrink Tubing | DigiKey | A332B-4-ND | |
| Zapit Accelerator | DVA | SKU ZA/ZAA | Use with standard Super Glue. |
| Microelectrode AC Amplifier 1800 | AM Systems | 700000 | |
| MP-285 Motorized Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| 4-channel Digital Oscilloscopes | Tektronix | TDS2000C | |
| Powered Speakers | Harman | Model JBL Duet | |
| Manual Manipulator | Scientifica | LBM-7 | |
| 800 µm Fiber Optic Patch Cable | ThorLabs | FC/PC BFL37-800 | |
| Power Meter | ThorLabs | PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor) | |
| 475 nm Cree XLamp XP-E | DigiKey | XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND | LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com). |
| Arduino UNO | DigiKey | 1050-1024-ND |
References
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Neuroscience Numéro 93 Optogenetics channelrhodopsin ChR2 cortex,
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