Summary
Vi præsenterer en mikrofluidindretning-baserede elektrokemisk biochip for DNA hybridisering detektion. Efter ssDNA sonde funktionalisering er specificitet, sensitivitet, og detektionsgrænse den studerede med komplementære og ikke-komplementære ssDNA mål. Resultaterne viser indflydelsen af DNA-hybridisering begivenheder på den elektrokemiske system, med en detektionsgrænse på 3,8 nM.
Abstract
Miniaturisering af analytiske stationære procedurer ind i mikro-skala giver betydelige fordele i forhold til reaktionstid, omkostninger og integration af præ-procestrin. Ved hjælp af disse enheder mod analyse af DNA-hybridisering begivenheder er vigtigt, fordi det giver en teknologi til tidstro vurdering af biomarkører ved point-of-care til forskellige sygdomme. Men når enheden fodaftryk nedsætter dominans forskellige fysiske fænomener stiger. Disse fænomener påvirker fremstilling præcision og driftssikkerhed af enheden. Der er derfor et stort behov for nøjagtigt at fremstille og betjene disse enheder i en reproducerbar måde med henblik på at forbedre den samlede ydeevne. Her beskriver vi de protokoller og de metoder, der anvendes til fremstilling og drift af en mikrofluidindretning baserede elektrokemisk biochip til nøjagtig analyse af DNA-hybridisering begivenheder. Den biochippen er sammensat af to dele: en mikrofluid chip medtre parallelle mikrokanaler fremstillet af polydimethylsiloxan (PDMS), og en 3 x 3 array elektrokemisk mikrochip. De DNA-hybridisering begivenheder påvises ved hjælp af elektrokemisk impedans spektroskopi (EIS) analyse. EIS analyse muliggør overvågning variationer af egenskaberne af det elektrokemiske system, der er fremherskende på disse længdeskalaer. Med evnen til at overvåge ændringer i både ladningsoverførsel og diffusionsmodstanden med biosensoren viser vi selektiviteten komplementære ssDNA-mål, en beregnet detektionsgrænse på 3,8 nM og en 13% krydsreaktivitet med andre ikke-komplementære ssDNA efter 20 minutter inkubation. Denne metode kan forbedre ydeevnen af miniaturiserede enheder ved at belyse om adfærd diffusion på mikro-skala regime og ved at muliggøre en undersøgelse af DNA-hybridisering begivenheder.
Introduction
Mikrofluid lab-on-a-chip (LOC) enheder giver mange fordele i klinisk diagnostik, miljøovervågning og biomedicinsk forskning. Disse enheder udnytter mikrofluidkanaler at kontrollere væske flow til områder af chippen, hvor en række procedurer kan finde sted, herunder reagens blanding, affinitet baserede bindende, signaltransduktion, og celle dyrkning 1-4. Microfluidics giver mange fordele i forhold til konventionelle kliniske diagnostiske værktøjer såsom mikrobrønd pladelæsere eller elektroforetiske gel shift-assays. Mikrofluidenheder kræver 2 til 3 størrelsesordener (nanoliter modsætning til mikroliter) færre reagenser til at udføre lignende analyser. Desuden kan disse enheder øge hastigheden, hvormed visse biologiske hændelser opstår på grund af den mindre indespærring af arterne i kanalerne 5,6. For det tredje kan sensorer integreres i mikrofluide enheder ved hjælp af litografi og ætsning teknikker, som kan give etiket-fri detection. Endelig, disse enheder er billige at producere og kræver lidt arbejde på den del af tekniker til at drive 7-10.
Label-fri detektion typisk udføres med en optisk eller elektrisk transducer. Optiske enheder kan præsentere bedre føling ydeevne på grund af lavere interferens med analytter i prøven. Ikke desto mindre er deres præstationer kompromitteret i tilfælde, hvor prøven baggrund har den samme resonans bølgelængde som sensoren 11. Der er mange fordele ved at anvende elektriske signaler til at udføre biologisk og kemisk detektion i mikrofluide systemer. Fremstillingen er i sagens natur mindre kompliceret, da disse sensorer typisk kun kræve mønstrede elektroder til at operere. Endvidere kan elektriske signaler direkte interface med de fleste måleudstyr mens andre signal modaliteter kan kræve en transducer til at konvertere signalet 12-15. Elektriske sensorer almindeligvis måle ændringer i impedance 16,17, kapacitans 18 eller redoxaktiviteten 19. Men nye udfordringer, da disse systemer er miniaturiseret. De vigtigste udfordringer at overvinde, omfatter: prøveforberedelse og blanding af væsker (på grund af den lave prøvevolumen og Reynolds-tal), fysiske og kemiske virkninger (herunder kapillarkræfter, overfladeruhed, kemiske interaktioner mellem byggematerialer og analytter), lav signal- til-støj-forhold (produceret af det reducerede overfladeareal og volumen) 20-23, og potentiel interferens fra elektro-aktive analytter i komplekse biologiske prøver (fx blod og spyt). Yderligere undersøgelse af disse virkninger vil resultere i retningslinjerne for en nøjagtig fremstilling og drift af disse enheder i en reproducerbar måde, der vil forbedre deres samlede resultater.
DNA-hybridisering påvisning benyttes i vid udstrækning til at diagnosticere genetiske sygdomme 24,25 og forskellige former for CancER 26. Hvert år bliver flere stammer af influenza identificeret i patienter, der anvender resultaterne fra DNA-hybridiseringsteknikker 27. Influenzavirus tegner sig alene for 36.000 dødsfald hvert år i USA 28. Sådanne eksempler kunne drage fordel af en bench-top mikrofluid anordning, der kan udføre de samme analyseteknikker som en pladelæser eller gel shift assay med lavt prøvevolumen og til en brøkdel af omkostningerne uden at ofre sensitivitet eller specificitet. På grund af de mange fordele ved etiket-fri elektrokemisk sensing, er det blevet brugt i udstrakt grad til påvisning af DNA-hybridisering begivenheder 29,30. En opsætning, hvor makro-skala elektroder (i millimeter området) er dyppet i bægre med opløsningen af interesse, kan bruges til at give meget følsomme data vedrørende bindingskinetik af enkeltstrengede DNA-sekvenser til deres matchende komplementære sekvenser. For nylig har der været et par fremskridt i at indarbejde elektrokemiske sensing i MICRofluidics til DNA-hybridisering. Der er lavet undersøgelser om hybridiseringskinetik 31 og integration af sensorer til detektion 15 i mikrofluidkanaler. Imidlertid eksisterer der stadig et behov for en hurtig høj gennemløb mikrofluid enhed, der kan analysere DNA-hybridisering begivenheder parallelt uden komplicerede prøveforberedelse trin.
Apparatet præsenteret i dette arbejde tilvejebringer en platform, der giver mulighed for flere interaktioner skal screenes parallelt og uden komplicerede prøveforberedelse trin. Vores protokol præsenterer hvordan mikrofluid-baserede elektrokemiske biochips er mikrofabrikerede med mikro-elektromekaniske systemer (MEMS) teknologi 32,33. Vi beskriver produktionsprocessen både mikrofluid chip, lavet af polydimethylsiloxan (PDMS), og den elektrokemiske chip, der består af et array af elektroder. Den kemiske funktionalisering af biochippen med ssDNA sonder er også rettet. Endelig Abiltet af biosensoren til specifikt at spore og analysere ssDNA mål demonstreres. Samlet mikrofluid-baserede elektrokemisk biochip er en hurtig og høj-throughput analyse teknik. Det kan bruges til at undersøge interaktioner mellem biologiske molekyler og ledende transducere, og kan anvendes i en række af lab-on-a-chip anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mikrofabrikation af Mikrofluid Chip
- Forbered Elektrokemisk Chip
- Mønster guldelektroder
- Skyl en tom 4 'siliciumskive (bedste kvalitet kvalitet) med acetone, methanol og isopropanol ("AMI" ren). Skyl isopropanol fra skiven med deioniseret vand (DI) efterfulgt af tørring med N2 pistol.
- Dyrk en 1 um tyk SiO 2 passiveringslag med værktøj plasma-forstærket kemisk dampudfældning (PECVD). Deponere en 200 Å tykt lag chrom efterfulgt af en 2.000 Å tykt lag af guld med en DC-katodeforstøvning værktøj.
- Spin "PR1" positiv fotoresist (spinning parametre: 3.000 RPM, 1000 omdr / sek, 30 sek) for at skabe en ensartet film ~ 1,6 um tyk. Forbag skiven i 1 min ved 100 ° C på en varmeplade.
- Bring wafer med 190 mJ / cm 2 ved 405 nm gennem en fotomaske. Udvikle wafer i 30 sek i 352 developer og skyl wafer med DI og tørt med N2 pistol.
- Etch guld med guld ætsemiddel i 1,5 min. Etch chrom med chrom ætsemiddel for ~ 30 sek. Skyl wafer med DI og tørt med N2 pistol.
- Fratage fotoresist med "AMI" ren procedure.
BEMÆRK: stærkt brandnærende og potentielt eksplosiv. - Rengør wafer med 4: 1 H 2 SO 4: H2O 2-blanding ("Piranha" ren) i 1 min. Skyl wafer med DI og tørt med N2 pistol.
- Mønster Platinelektroder
- Spin "PR2" positiv fotoresist (spinning parametre: 3.000 RPM, 1000 omdr / sek, 30 sek) for at skabe en ensartet film ~ 1,4 um tyk. Forbag skiven i 1 min ved 100 ° C på en varmeplade.
- Bring wafer med 30 mJ / cm 2 ved 405 nm gennem en fotomaske. Bag skiven i 45 sekunder ved 125 ° C på en varmeplade. Flood eksponerewafer med 1000 mJ / cm2 ved 405 nm uden en fotomaske. Udvikle wafer i 2 min i 6: 1 AZ400K udvikler og skyl wafer med DI og tørt med N2 pistol.
- Deponere en 400 Å tykt lag af titan, efterfulgt af en 1.600 Å tykt lag af platin ved hjælp af en e-stråle fordampningssystem.
- Løft fotoresist i et ultralydbehandles acetonebad i 5 minutter efterfulgt af skylning med acetone og isopropanol. Skyl wafer med DI og tørt med N2 pistol.
- Mønster guldelektroder
- Forbered Assay Kanaler
- Forbered Mold til analyse Kanaler
- Skyl en tom 4 '' silicium wafer (test grade kvalitet) med "AMI" ren procedure. Skyl isopropanol fra wafer med DI efterfulgt af tørring med N2 pistol.
- Spin "PR3" negativ fotoresist (2-trins spinding parametre:. Step One - 600 omdrejninger i minuttet, 120 omdr / sek, 10 sek Trin to - 1.150 omdrejninger i minuttet, 383 omdr / sek,27 sek) for at skabe en ensartet film ~ 100 um tyk. Pre-bage wafer på en varmeplade (2-trins bagning parametre:. Trin et - rampe op fra stuetemperatur til 65 ° C til 300 ° C / time og hold temperatur i 10 minutter Trin 2 - rampe op til 95 ° C ved 300 ° C / time og holde temperaturen i 30 minutter).
- Bring wafer med 2.500 mJ / cm 2 ved 405 nm gennem en fotomaske. Post-bage skiven med at rampe op til 95 ° C til 300 ° C / time og holde temperaturen i 10 minutter på en varmeplade. Udvikle wafer i 10 min i propylenglycolmonomethylether acetat (PGMEA) udvikler. Skyl wafer med isopropanol og tørt med N2 pistol.
- Fabrikere Assay Kanaler
- Forbered 10: 1 polydimethylsiloxan (PDMS) blanding (20 g elastomer, 2 g hærder) og helt afgasses i et vakuumkammer i 20 min.
- Definer en indhegning omkring formen wafer med alufolie og langsomt hæld uhærdede PDMSover formen.
- Bag formen med PDMS i en kasse ovn (2-trins bagning parametre:. Step One - 5 min rampe op fra stuetemperatur til 80 ° C Trin 2 - hold ved 80 ° C i 17 min).
- Peel væk PDMS fra formen og sted på aluminiumsfolie. Skær assay chips med en kirurg kniv definerer huller med en biopsi stanseværktøj.
- Forbered Mold til analyse Kanaler
2. Saml Enhed
- Justere PDMS assay kanaler med de arbejdende elektroder på den elektrokemiske chip manuelt. PDMS klæber godt til den elektrokemiske chip, forsegling kanalerne og forhindre lækage.
- Slut en fleksibel slange (OD 0,087 'og id 0,015') til en plastik albue eller lige stik ved hjælp af et kort fleksibelt rør som en adapter (OD 0,1875 '' og ID 0,0625 ''). Vedhæft stik til hver af de hole-hullede indløb ind i enheden.
- Tilslut en sprøjte på den anden ende afslangen og placere sprøjten i en sprøjtepumpe. Alternativt ændre sættet af en sprøjte, et rør, og en konnektor ifølge den krævede procedure trin i afsnit 3 og dens tilsvarende løsning.
3. Analyser DNA-hybridisering
BEMÆRK: Indførelse hver opløsning langsomt ind i kanalen ved en strømningshastighed på 200 gl / time, indtil hele kanalen er fyldt.
- Funktionalisere hver lodret mikrokanalplade med en anden ssDNA sonde sekvens (udføre parallelt med de 3 separate lodrette microchannels):
- Fyld hver mikrokanalplade med en anden ssDNA probe inkubation opløsning (10 mM phosphatpuffer, 100 mM NaCI, 10 uM tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) og 1 uM sonde ssDNA), og der inkuberes i 1 time efterfulgt af skylning mikrokanalplade med PBS.
- Fyld mikrokanalplade med en opløsning indeholdende 1 mM 6-mercapto-1-hexanol (MCH) i en puffer af 10 mM PBS, 100 mM NaCI og 1,395 mM TCEP, og INCUpyr i 1 time efterfulgt af skylning mikrokanalplade med PBS.
- Løft PDMS, roteres 90 ° til en vandret orientering, og placere ned for at blotlægge separate rækker af reaktionskamre med hver række indeholder en unik tæller og reference elektrode (figur S1).
- Fyld microchannels med kontrolmåling løsning på 4x koncentreret saltvand-natriumcitrat (SSC) buffer, og der inkuberes i 20 min.
- Baggrund måling: Fyld microchannels med 5 mM ferricyanid / 5 mM ferrocyanid i PBS-opløsning og optage impedans værdier af elektrokemiske system til forskellige frekvenser (elektrokemisk impedans spektroskopi; EIS) ved hjælp af en potentiostat tilsluttet til arbejderklassen, tæller, og reference elektroder ( EIS parametre: frekvensområde fra 1 MHz til 0,1 Hz, 10 frekvens datapunkter pr årti, 25 mV amplitude, 5 mV polarisering versus reference elektrode). Gentag denne måling for hver arbejdsdag elektrode i microchannels. Måling af DNA-hybridisering (udføre for hver ikke-komplementær og supplerende ssDNA mål).
- Fyld mikrokanaler med target ssDNA måling opløsning af 4x koncentreret SSC buffer indeholdende 1 uM af målet ssDNA og inkuberes i 20 min. Mål DNA ifølge trin 3.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et styrbart og præcis fremstillingsproces for den eksperimentelle anordning er afgørende i forskningen. Det gør det muligt for forskerne at opnå reproducerbare og høj eksperimenter. Her har vi vist et højt udbytte, høj reproducerbarhed mikrofabrikation proces en mikrofluid baseret elektrokemisk biochip (figur 1). Med en lav dumpeprocent, har kun få enheder vist bonding problemer, der fører til løsning lækage. For at validere den elektrokemiske aktivitet af biochip er cykliske voltammetri målinger udført i mikrokanaler fyldt med en elektro-aktiv redoxpar ferricyanid / ferrocyanid. Figur 2 viser reproducerbar elektrokemiske reaktion af ni forskellige arbejdselektrode på chippen. Disse resultater viser, at den elektrokemiske aktivitet er den samme i alle ni kamre biochip tillader high-throughput målinger.
De fleste DNA-hybridisering sensorer immobilisere ssDNAprober onto en sensor overflade. Som guld bruges til mønster følerelektroderne for mikrofluidenheder, thioler er gode kandidater til at danne stærke kovalente bindinger med sensoren overflader 34. En almindelig konjugation teknik involverede tilsætning af en funktionel thiol (-SH) gruppe ved den ene ende af ssDNA. SS disulfidbinding beskytter fri thiolgruppe mod oxidation, indtil det er klar til at blive brugt. Når disulfidet er reduceret med tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) tilsætning, den frie thiol (SH) bliver tilgængelig til at binde DNA til en guldoverflade. Uden TCEP vil disulfidbindingerne i ssDNA'et også samle på elektroden, men obligationen er meget svagere end thiol- guld obligation og vil ikke forblive stabil under hele forsøget. I dette arbejde har en stabil ssDNA monolag til hybridisering detektion blevet opnået med inkubationstider mellem en og to timer. Når ssDNA prober er blevet samlet på elektroden, er 6-mercapto-1-hexanol (MCH), der anvendes til at passivere eny udsatte områder på overfladen for at reducere ikke-specifikke bindende virkning 35. MCH er thiolgruppe tillader selvsamling på guld og hydroxylgruppen reducerer ikke-specifik adsorption af ssDNA i opløsning. Den høje TCEP koncentration anvendes til at mindske thiolgrupper, der kan have oxideret til dannelse af disulfidbindinger. Uden høj TCEP indholdet i bufferen, ville MCH danne ustabile monolag og impedansdata vil variere i overensstemmelse hermed som følge af variationer med overfladeladning. MCH har en anden vigtig funktion, når du bruger det som passivering med ssDNA molekyler. Den oxidative adsorptionsproces MCH injicerer elektroner i elektroden og reducerer risikoen overflade. Dette bevirker en elektrostatisk effekt med den anioniske sonde ssDNA'et allerede immobiliseret og ssDNA står oprejst væk fra elektroden 36. Opretstående sonder i høj grad øge hybridisering effektivitet, idet målet ssDNA tråde har meget lettere adgang til entire længden af proben sekvens. Denne passivering skridt er afgørende for at skabe en stabil impedans basismåling af sensoren, hvilket reducerer falske positive signaler og fjerne eventuelle svagt bundne molekyler fra overfladen.
Den biosensorer mekanisme DNA hybridiseringsbetingelser arrangementer er baseret på frastødningskræfter mellem negativt ladet DNA og andre elektro-aktive molekyler. Når en hybridisering begivenhed indtræffer, stærkere frastødningskræfter mellem hybridiserede DNA og de elektro-aktive molekyler gøre det sværere for de elektro-aktive arter at diffundere mod elektroden 37. Her bruger vi en ferricyanid / ferrocyanid par som redox arter indikator for disse frastødningskræfter, der måles ved hjælp af elektrokemisk impedans spektroskopi (EIS). Vi udnytter denne biosensorer mekanisme i mikrofluid-baserede elektrokemisk biochip, og vise sin evne til at opdage DNA-hybridisering begivenheder 33. Figur 3 viserselektiviteten af biosensoren ved at illustrere impedansvariationer som følge af hybridiseringsbetingelser begivenheder mellem tre ssDNA prober og deres komplementære ssDNA målet. En 13% krydsreaktivitet med andre ikke-komplementære ssDNA efter 20 minutters inkubation er blevet påvist. Disse resultater viser gennemførligheden af den microfabrikeret anordning til måling af DNA-hybridisering begivenheder i en reproducerbar og højkapacitetsidentifikation måde. Vi har også vist, at følsomheden af biosensoren ved at indføre forskellige koncentrationer af komplementære ssDNA mål til sensorens. Figur 4 viser funktionaliteten af biosensoren med en tendens til stigende impedansværdier for højere målkoncentrationer ssDNA. Efter beregninger af den begrænsede diffusionsmodstanden 33 for forskellige koncentrationer af komplementære ssDNA mål, en lineær regressionsanalyse resulterede i en teoretisk detektionsgrænse på 3,8 nM ved beregningen af den tilsvarende ssDNA koncentration mål for baggrunden signal. Generelt biochip viser evnen til at fornemme hurtigt tilstedeværelsen af DNA hybridiseringsbetingelser begivenheder.
Figur 1. Foto af emballeret enhed under test (chip dimensioner: 3,5 cm x 3,5 cm; mikrokanalplade højden er 100 um og 500 um i bredden).
Figur 2. Elektrokemisk validering. Cykliske voltammogrammer af 9 (3 x 3 gitter) arbejder elektroder i nærværelse af ferrocyanid / ferricyanid redoxpar. Reproducerbarheden blandt de mønstrede elektroder fremgår af lignende form, tophøjder og topadskillelse for alle elektroder."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51797/51797fig2highres.jpg" target = "_blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Specificitet af biosensoren. Virkningen af hybridiseringsbetingelser begivenheder mellem forskellige ssDNA mål og tre forskellige ssDNA prober på modstanden ladningsoverførsel. Ved DNA-hybridisering begivenhed, jo stærkere frastødning kraft mellem den negativt ladede dobbeltstrenget DNA og de negativt ladede ferrocyanid / ferricyanid molekyler resulterer i højere afgift overførsel modstand.
Figur 4. Funktionalitet af biosensoren. Nyquist plotelektrokemiske impedans spektroskopi målinger efter indførelsen af 0,01, 0,1, 1, og 1 uM mål ssDNA (pil angiver stigende ssDNA- målkoncentrationer). De øgede impedansværdier ved lave frekvenser (~ 15 Hz) højere mål ssDNA koncentrationer skyldes de stærkere frastødningskræfter mellem dsDNA og ferrocyanid / ferricyanid molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores procedurer demonstrere fremstilling af en mikrofluidindretning-baserede elektrokemisk biochip og dens anvendelse til DNA-hybridisering begivenheder analyse. Gennem et højt udbytte kontrolleret mikrofabrikation proces udvikler vi en enhed bestående af mikroskala kanaler er integreret med et array af elektrokemiske transducere. Vi har udtænkt kontrollerede procesparametre for fotolitografi proceduren for den elektrokemiske chip og mikrofluid kanal formen gennem en iterativ fremgangsmåde. Disse trin giver retningslinjer for en fremtidig etablering af andre miniaturiserede analytiske enheder. Vigtigere er det, de giver en metode til at optimere forskellige biosensorer parametre såsom signal-støj-forhold, stabilitet og følsomhed. Efter anordning fabrikation, vi funktionalisere de elektrokemiske transducere med ssDNA sonde som bioreceptor, giver en unik analytisk formål. Selv om disse procedurer demonstrere lav anordning dumpeprocent, løsning lækage viser sig at være en major spørgsmål efter montering af enheden og under udførelsen af DNA hybridiseringsassayet. Yderligere undersøgelse af limning svigt i disse anordninger ville forbedre udbyttet af processen og gør den ideel til mikro-bio-systemer undersøgelse.
I vores undersøgelser viser vi evne biochip til præcist og specifikt mærke DNA-hybridisering begivenheder. Som en del af design parametre for en ny analytisk mikro-enhed, bør man tage hensyn til fremstillingen af den enhed, som kræver en iterativ tilgang til at optimere fabrikation parametre (f.eks, fotolitografiske parametre mikrokanalplader dimensioner, type i den deponerede metal). For effektivt at påvise DNA-hybridisering begivenheder, ssDNA sondekonstruktionen og hybridiseringsbetingelser skal optimeres så godt (f.eks., Inkubationstid, koncentration puffer, probekoncentration, forebyggelse af ikke-specifik adsorption).
Evnen til hurtigt at screene FOr bestemte DNA-sekvenser er meget gavnligt på områderne kræftforskning, afsløring influenza og genteknologi. Mest array påvisningsmetoder anvender en etiket til frembringelse af signalet og bruge flere vaske og inkubationstrin. Ved hjælp af de foreslåede mikrofluide anordninger, vil DNA-hybridisering udføres med et stort antal af DNA-sekvenser i den samme enhed uden behov for etiketter af enhver art. Vi forestiller kortsigtede applikationer integrerer mere avancerede funktioner til biochippen at forbedre sine præstationer og modularitet. For eksempel, ventil-baserede mikrofluidik har potentialet til at give biochip med automatiske og kontrolleret analyse evner. Et andet eksempel er funktionalisere enhed med andre bioreceptors, der giver unikke sensing egenskaber, der kan anvendes i en bredere vifte af applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkender Robert W. Deutsch Foundation, Defense Threat Reduction Agency (DTRA) og National Science Foundation Emerging Frontiers i forskning og innovation (EFRI) om økonomisk støtte. Forfatterne takker også Maryland Nanocenter og dets FabLab til renrum støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | 0.015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | 0.0625" |
| 1 ml syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 | |
References
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
- Xu, Y., Yang, X., Wang, E. Review: aptamers in microfluidic chips. Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).
- Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
- Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
- Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
- Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. Microfluidic whole-blood immunoassays. Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).
- Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).
- Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
- Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
- Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
- Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
- Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
- Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
- Cai, H., Lee, T. M. -H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
- Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
- Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
- Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
- Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
- Bhushan, B. Springer handbook of nanotechnology. , 3rd ed, Springer. (2010).
- Ghallab, Y. H., Badawy, W. Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , Artech House. (2010).
- Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
- Ma, K. -S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
- Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
- Kao, L. T. -H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
- Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
- Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
- Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
- Kim, J. H. -S., Marafie, A., Jia, X. -Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
- Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
- Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
- Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43R-50R (1997).
- McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
- Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
- Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).
