Abstract
भ्रूण आंत में अधिकांश Morphogenetic प्रक्रियाओं विकास के चरणों में परिवर्तन के फोटो उपलब्ध कराने, तय ऊतकों की पतली वर्गों से inferred किया गया है. पतली धारावाहिक वर्गों से तीन आयामी जानकारी क्योंकि पूरी तरह से धारावाहिक वर्गों के पुनर्निर्माण और धारावाहिक वर्गों पर ऊतक की उचित उन्मुखीकरण बनाए रखने की कठिनाई की व्याख्या करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है. द्वारा ग्रोस्से एट अल. हाल के निष्कर्षों, 2011 आंत 1 की विकासशील विल्ली के morphogenesis को समझने में तीन आयामी जानकारी के महत्व पर प्रकाश डाला. अकेले लेबल आंतों की कोशिकाओं के तीन आयामी पुनर्निर्माण आंतों उपकला कोशिकाओं के बहुमत दोनों शिखर और बेसल सतहों कि संपर्क का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, उपकला के शिखर सतह पर actin cytoskeleton की तीन आयामी पुनर्निर्माण आंतों लुमेन निरंतर है और कहा कि माध्यमिक lumens के एक विरूपण साक्ष्य हैं कि प्रदर्शनectioning. उन दो अंक, आंतों उपकला में interkinetic परमाणु प्रवास के प्रदर्शन के साथ साथ, एक pseudostratified उपकला के रूप में विकसित करने आंतों उपकला परिभाषित और पहले 1 के रूप में सोचा स्तरीकृत नहीं. उपकला तीन dimensionally पालन करने की क्षमता इस बात का प्रदर्शन और भ्रूण आंत में उपकला morphogenesis पुनर्परिभाषित करने के लिए लाभदायक था. बहु फोटॉन इमेजिंग तकनीक और तीन आयामी पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के विकास के साथ, क्षमता तेजी से सुधार आ रहा है अंगों के विकास, अक्षत कल्पना करने के लिए. दो photon उत्तेजना उच्च संकल्प के साथ ऊतकों में कम हानिकारक पैठ गहरी अनुमति देता है. दो photon इमेजिंग और वाल्टन एट अल. में पूरे भ्रूण माउस आंतों के 3D पुनर्निर्माण, 2012 अंकुर परिणाम 2 के पैटर्न को परिभाषित करने में मदद की. यहाँ हम अनुमति देने के लिए है कि संस्कृति प्रणाली के विल्ली और एक्सटेंशन के पूर्व vivo विकास की अनुमति देता है कि एक पूरे अंग संस्कृति प्रणाली का वर्णनआंतों तीन dimensionally उनके विकास के दौरान imaged किया जाना है.
Protocol
नोट: सभी चूहों प्रयोगशाला पशु चिकित्सा के लिए मिशिगन मेडिकल स्कूल यूनिट के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित और पशुओं के उपयोग और देखभाल पर विश्वविद्यालय समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रोटोकॉल का उपयोग नम्रता से संभाल रहे थे.
1 पूरे अंग संस्कृति के लिए सिस्टम
- मीडिया और संस्कृति प्लेटों की तैयारी
- एक टिशू कल्चर हुड में, शेयर बोतल से BGJb मीडिया के 5 एमएल हटाने और पेन / Strep के 5 मिलीलीटर जोड़ें. 5 मिलीग्राम / (पेन / Strep के साथ) BGJb मीडिया के 49 मिलीलीटर मिलीलीटर एस्कॉर्बिक एसिड की 1 मिलीलीटर जोड़कर, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में मीडिया का एक काम कर रहे स्टॉक तैयार करें.
- Transwells में से प्रत्येक के नीचे 1 मिलीलीटर जोड़कर एक 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली तैयार करें.
नोट: सभी 6 transwells इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, बाद में उपयोग के लिए एक ताजा बाँझ 6 अच्छी तरह से थाली में अतिरिक्त transwells चाल है. तीन 10 सेमी बाँझ पेट्री डिश में से प्रत्येक के लिए BGJb मीडिया काम कर के 3 मिलीलीटर जोड़ें.
- विच्छेदन के लिए तैयार
- 70% etha में विदारक उपकरण भिगोएँऔर NOL काम करते हुए साफ औजार रखने के लिए सुनिश्चित हो.
- एक बड़े बर्फ बाल्टी के साथ विदारक क्षेत्र सेट और 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली और बर्फ पर BGJb मीडिया के साथ 10 सेमी पेट्री डिश जगह है. विदारक और संस्कृति के लिए आंतों की तैयारी करते हुए जितना संभव बर्फ पर काम करते हैं.
- भ्रूण आंतों की कटाई के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से isofluorane (100 μl) पूर्व euthanization करने के साथ एक कक्ष में वयस्क मादा चूहों anesthetize.
- उनकी मां से भ्रूण कटाई के बाद, प्रत्येक भ्रूण ध्यान से चार्ट 13 मचान Theiler के अनुसार मंच. नियमित रूप से एक ही कूड़े के भीतर मनाया जाता है विकास के चरण में अप करने के लिए 24 घंटे की विविधताओं के रूप में प्रत्येक भ्रूण की उम्र का निर्धारण करने के बाद सहवास दिनों पर भरोसा मत करो.
- भ्रूण आंतों का विच्छेदन
- आंतों को हटाने के लिए पहले कत्ल द्वारा भ्रूण euthanize.
- पीएलए तो 1x Dulbecco फॉस्फेट buffered खारा (DPBS) में प्रत्येक आंत काटना औरBGJb मीडिया काम करने के साथ एक 10 सेमी पेट्री थाली में CE.
- ध्यान से पेट से तिल्ली और पेट और ऊपरी ग्रहणी से अग्न्याशय को हटा दें.
- धीरे आंत सीधा करने की अनुमति के लिए संभव है और केवल पर्याप्त कनेक्शन को अलग करने के रूप में ज्यादा के रूप में संलग्न omentum छोड़ने का ख्याल रख रही omentum अलग.
नोट:, धीरे luminal सामग्री आंत के माध्यम से प्रवाह और कटौती छोर से निष्कासित किया जा के लिए अनुमति देने के लिए 3 बराबर खंडों में आंत अलग आंतों E14.5 से अधिक उम्र के या उन अब 24 घंटे से अधिक सुसंस्कृत होने के लिए. हालांकि, संस्कृतियों के लिए E13.5 से पहले, serosa ठीक से आंत की लंबाई से अधिक विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए आंत के 3 खंडों को अलग करने से पहले संवर्धन की जब तक के बाद 24 घंटा इंतजार करना शुरू कर दिया. - संस्कृति प्लेट (1.1.2) के transwells पर आंतों टुकड़े स्थानांतरित करने के लिए एक मुंह pipet का प्रयोग करें.
- वे transwel भर में सीधे हैं कि ताकि जरूरत के रूप में धीरे आंतों का स्थानएल.
नोट: आंतों ट्यूब के माध्यम से luminal सामग्री बढ़ शुरू एक बार, आंत में किसी भी सनक आंत के लिए एक बैकअप और नुकसान का कारण बन जाएगा.
- संस्कृति और उपचार
- , Transwell के नीचे से मीडिया को दूर transwell तहत (जोड़े पुनः संयोजक प्रोटीन या औषधीय inhibitors के साथ मीडिया से काम कर) उपचार मीडिया के 700 μl जोड़ें.
- आंतों के शीर्ष पर उपचार मीडिया बूंद के लिहाज से 300 μl जोड़ें और यह transwell के माध्यम से सोख करने के लिए अनुमति देते हैं. आवश्यक के रूप में आंतों का स्थान बदलें.
- उपचार अभिकर्मक के आधा जीवन के आधार पर कम से कम एक बार दैनिक या अधिक बार इलाज मीडिया बदलें.
- उपचार अभिकर्मक की एक स्थानीय स्रोत के लिए प्रोटीन लथपथ agarose मोती की तैयारी
- उनके भंडारण कंटेनर में agarose मोती Resuspend और एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में agarose मोती के 100 μl हस्तांतरण.
- बाँझ 1x पीएच के साथ ट्यूब की शेष मात्रा भरेंosphate buffered खारा (पीबीएस) और उन्हें धोने के लिए मोती मिश्रण. कुछ ही मिनटों के मोती नीचे करने के लिए व्यवस्थित और फिर मोती के ऊपर से पीबीएस बंद pipet करने की अनुमति के लिए एक रैक में microfuge ट्यूब रखें. बाँझ 1x पीबीएस के साथ microfuge ट्यूब भरना और दो बार अधिक धोने की प्रक्रिया को दोहराएँ.
- दो बार इलाज के लिए वांछित एकाग्रता पर ब्याज की प्रोटीन तैयार करें.
- 2x प्रोटीन शेयर की 5 μl से धोया agarose मोती के 5 μl मिक्स और धीरे प्रोटीन में मोती आंदोलन. धीरे हर 10-15 मिनट मिश्रण, 1 घंटे के लिए बर्फ पर ट्यूब रखें.
- आंतों पर मोती रखने से पहले बाँझ 1x पीबीएस में संक्षेप में मोती कुल्ला.
- Agarose मोती की नियुक्ति
- धीरे खींच लिया केशिका सुइयों के साथ एक मुंह pipet का उपयोग आंतों के शीर्ष पर agarose मोती जगह है. किसी न किसी तरह से निपटने आंत को नुकसान पहुंचा और घायल क्षेत्र में अंकुर विकास कर पाएगा रूप में अत्यधिक सावधानी के साथ मोती रखें.
- आंतों क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला आंदोलनों और संवर्धन समय के साथ आंतों के बंद रोल करेंगे रखा मोती के बारे में आधे से गुजरना होगा के बाद से विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं के रूप में दो बार के रूप में कई मोती रखें.
- सुसंस्कृत आंतों का निर्धारण
- ध्यान transwell नीचे से इलाज मीडिया को हटाने और 3 मिनट के लिए शुष्क हवा की आंतों अनुमति देते हैं.
- फिर निर्धारण समय के शेष के लिए लगानेवाला के 2 मिलीलीटर के साथ आंत के ऊपर कवर, 2 मिनट के लिए transwell तहत लगानेवाला के 1 मिलीलीटर जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर या आरटी पर 2 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde हे / एन के साथ ठीक करें.
फिक्स्ड आंतों के 2 इमेजिंग
- Wholemount इमेजिंग
- 1x DPBS के 100 μl के साथ एक स्लाइड पर (अंतर्जात प्रतिदीप्ति साथ) पूरे आंतों रखें. धीरे आंतों की व्यवस्था संदंश का प्रयोग करें.
- ऊतक मो बनाने के लिए ध्यान से 70% ग्लिसरॉल के 100 μl DPBS हटाने और तुरंत जोड़ने के लिए एक प्रयोगशाला ऊतक का प्रयोग करेंपारदर्शी रहे हैं और इमेजिंग के संभावित गहराई में वृद्धि.
नोट: आंत के आगे पैठ वांछित है, बजाय 70% ग्लिसरॉल में आंत बढ़ते, 10-30 मिनट के लिए फोकस स्पष्ट समाधान की कुछ बूँदें में आंत लेना. फोकस स्पष्ट समाधान बंद pipet और माउंट साफ साथ आंत माउंट. - क्ले मॉडलिंग में एक coverslip के चार कोनों में से प्रत्येक डुबकी और आंत सपाट से coverslip रखने के लिए स्लाइड और coverslip के बीच spacers के रूप में उपयोग करने के लिए मिट्टी की एक छोटी राशि लेने.
- एक कपास झाड़ू के साथ लागू पिघल VALAP साथ स्लाइड पर coverslip सील.
- छवि को या तो एक ईमानदार या उल्टे confocal खुर्दबीन पर आंतों. अधिक जानकारी के लिए चर्चा को देखें.
- (आंतों संरचनाओं के पार के अनुभागीय देखने के लिए) तय की आंतों की Vibratome सेक्शनिंग
- छोटे प्लास्टिक के नए नए साँचे में 7% agarose में शामिल करें आंतों के लिए (10 x 10 x 15 मिमी) और अनुमति agarose ब्लॉकशांत और स्थिर करना.
- तत्काल गोंद के साथ vibratome संग्रह चरण के लिए प्लास्टिक molds और गोंद agarose ब्लॉक से agarose ब्लॉक निकालें.
- बर्फ के ठंडे 1x DPBS के साथ संग्रह चरण भरें.
- 100-150 माइक्रोन के बीच एक मोटाई पर वर्गों में कटौती. मोटा वर्गों पार अनुभाग में गहरी कल्पना करने (धारा 2.1.2 में वर्णित) समाशोधन समाधान का उपयोग करें.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में संग्रह चरण से vibratome वर्गों डालो.
- तय, vibratome sectioned ऊतकों की immunofluorescence धुंधला
- 1x DPBS के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 5-12 vibratome वर्गों रखें.
- 1x DPBS निकालें और अच्छी तरह से प्रति permeabilization समाधान के 500 μl जोड़ें. धीरे आरटी पर 25 मिनट के लिए नमूने रॉक.
- Permeabilization के बाद, 1x पीबीएस के साथ नमूने 3 बार धोएं.
- अवरुद्ध समाधान के 500 μl में कम से कम 30 मिनट के लिए नमूने ब्लॉक.
- अवरुद्ध, ई के बादअवरुद्ध समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 500 μl के साथ अवरुद्ध समाधान Xchange और 4 डिग्री कंपनी / एन पर नमूने रहते हैं.
नोट: स्थिर और आयल वर्गों पर अच्छी तरह से काम करते हैं कि प्राथमिक एंटीबॉडी dilutions आम तौर पर हालांकि आम तौर पर इस प्रोटोकॉल (जैसे, BrdU) के साथ अच्छी तरह से काम नहीं करते परमाणु प्रतिजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता एंटीबॉडी, भी vibratome वर्गों पर अच्छी तरह से काम करते हैं. - अगले दिन, अवरुद्ध समाधान के साथ 15 मिनट के लिए नमूने हर बार 3 बार धोएं.
- धोने के बाद, अवरुद्ध समाधान में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के 500 μl लागू होते हैं. आरटी पर 2 घंटे के लिए 45 मिनट के लिए नमूने प्रकाश से fluorophores की रक्षा और रॉक करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में 24 अच्छी तरह से थाली लपेटें.
- 15 मिनट प्रत्येक के लिए 1x पीबीएस के साथ नमूने 3 बार धोएं और धारा 2.4 में वर्णित के रूप में स्लाइड पर vibratome वर्गों माउंट.
- Vibratome वर्गों बढ़ते
- Vibratome डबल एसटीआई के पतले स्लाइस में कटौती करके बढ़ते के लिए स्लाइड तैयारसी.के. टेप और स्लाइड के लंबे पक्ष के साथ उन्हें रखने.
- ध्यान 1x पीबीएस के 100 μl की एक बूंद में स्लाइड पर डबल स्टिक टेप के बीच 5-10 vibratome वर्गों जगह है.
- सभी वर्गों प्रकट करना और स्लाइड भर में एक भी परत में उन्हें बाहर फैल गया.
- फ्लैट बैठे से एक coverslip को रोका जा सके कि किसी भी अतिरिक्त agarose या असमान बिट्स निकालें.
- ध्यान vibratome वर्गों के आसपास से अतिरिक्त 1x पीबीएस सोख करने के लिए एक प्रयोगशाला ऊतक का उपयोग करें.
- Vibratome वर्गों के शीर्ष पर जलीय बढ़ते मध्यम की एक बूंद जोड़ें और फिर coverslip.
- VALAP एक कपास झाड़ू के साथ लागू पिघल साथ स्लाइड पर coverslips सील.
- छवि को या तो एक ईमानदार या उल्टे confocal खुर्दबीन पर vibratome वर्गों. एक इमेजिंग प्रणाली के चयन पर अधिक जानकारी के लिए चर्चा को देखें.
पूरे आंतों के 3 लाइव इमेजिंग
आंतों fetuse से काटाजुड़ा omentum बरकरार रह साथ E12.5 के बाद, सफलतापूर्वक ऊपर प्रणाली का उपयोग करते हुए संस्कृति में विल्ली विकास. इसलिए, इस पूर्व vivo प्रणाली समय के साथ morphogenesis की एक तीन आयामी देखने के लिए खंगाला जा सकता है, जो विकासशील आंतों का जीना Z-खंड छवियों का कब्जा परमिट.
- लाइव इमेजिंग स्थापना
- एक ठीक जाल स्क्रीन करने के लिए एक व्यक्ति polycarbonate झिल्ली पालन करने के लिए त्वरित गोंद का प्रयोग करें. यह ईमानदार confocal खुर्दबीन के सूई लेंस के नीचे जगह में आंत पकड़ करने के लिए एक समर्थन पाड़ प्रदान करता है. लाइव इमेजिंग माइक्रोस्कोप के चयन पर अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें.
- केंद्र अच्छी तरह से एक संस्कृति थाली में जाल स्क्रीन रखें.
- पॉली कार्बोनेट झिल्ली पर विच्छेदित आंत रखें और दोनों छोर पर तुरंत गोंद की एक बूंद जोड़ें. आंत प्रत्यय ही पर्याप्त गोंद का प्रयोग करें, लेकिन नहीं कोट इसे!
- पॉली कार्बोनेट नीचे फिनोल लाल की संस्कृति मीडिया स्वतंत्र जोड़ेंकेंद्र अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में झिल्ली.
- नमी प्रदान करने के लिए संस्कृति प्लेट के बाहरी रिम के लिए पानी जोड़ें.
- इमेजिंग जबकि आंत के आंदोलन को नियंत्रित करने के लिए मीडिया के 3 मिलीलीटर 1x पीबीएस में xylazine के 5 समाधान: भ्रूण आंत संस्कृति में संकुचन की क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला की तरह लहरों आए चूंकि, एक 1 के 100 μl जोड़ें. इस खुराक अंकुर विकास समझौता किए बिना बारे में 8-10 घंटे के लिए आंत्र आंदोलनों को नियंत्रित करेगा.
- आंत का एक अनुप्रस्थ देखने के लिए, एक 3-4% agarose समाधान में रहते आंतों एम्बेड और एक vibratome पर मोटी वर्गों (150-500 माइक्रोन) में कटौती. कटौती की जा रही आंत की कठोरता के साथ agarose की कठोरता से मेल खाते हैं और अनुभव से विकास मंच निर्धारित की. आम तौर पर, एक 3% agarose समाधान E14.5 की तुलना में छोटी आंतों के लिए अच्छी तरह से काम करता है और एक 4% समाधान आंतों E15-E16 के लिए अच्छी तरह से काम करता है.
- (धारा 3.1.1 के रूप में) एक जाल स्क्रीन से चिपका एक polycarbonate झिल्ली को vibratome वर्गों गोंद औरसंस्कृति के रूप में धारा 3.1.2-3.1.6 में वर्णित है.
- ट्यून करने योग्य तालिका के साथ एक ईमानदार स्टैंड पर एक दो photon confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (690-1,040 एनएम के बीच उत्तेजना लेजर) का उपयोग रहते इमेजिंग आचरण.
- दो photon लेजर GFP संकेत के लिए सबसे अच्छा संकल्प के साथ गहरी पैठ प्रदान करता एनएम 900 से परिचित. इमेजिंग जबकि यह ऊतकों को नुकसान कम कर देता है. इसके अलावा, कम से कम संभव उत्सर्जन करने के लिए लेजर की सत्ता स्थापित करने के ऊतकों को नुकसान कम कर देता है. आमतौर पर, GFP की एक अच्छी उत्तेजना प्राप्त दो photon लेजर पर 12% शक्ति का उपयोग करने के लिए.
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Representative Results
इस प्रणाली औषधीय अभिकर्मकों या पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ संकेत के हेरफेर के लिए सक्षम बनाता है के रूप में भ्रूण आंतों की पूरी explants की संस्कृति, आंतों विकास समन्वय कि संकेतन अणुओं के स्थान, वितरण, और अवधि के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. (वाल्टन एट अल से reproduced चित्रा 1 ए,., 2012) transwell संस्कृति प्रणाली 2 यह संभव ऊतक पर दवा या प्रोटीन लथपथ agarose मोती जगह है और जिससे स्थानीय संकेत सूत्रों स्थापित करने के लिए बनाता है जो एक हवा तरल इंटरफेस, (चित्रा 1 बी प्रदान करता है ). E10 पर E18.5 भ्रूण से काटा आंतों transwells पर संस्कृति में जीवित है और आंदोलन के क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला की तरह लहरों से गुजरना. आंतों 10 दिन लगभग जीवित रहने या मोटे तौर पर पी 3, तहखाना गठन पहले मनाया जाता है जब माउस विकास के चरण के लिए E13.5 से संस्कृति में शुरू कर दिया. प्रारंभिक चरण आंतों संस्कृति में जीवित हालांकि, आंतों से पहले काटाSerosa पूरी तरह से उस समय तक आंत को कवर करने के लिए नहीं बढ़ी है क्योंकि E12.5, मज़बूती संभावना विल्ली उभरने नहीं है. वाल्टन एट से reproduced असभ्य, चरण मिलान नियंत्रण (चित्रा 1, के साथ तुलना में विकास थोड़ा देरी हो रही है, हालांकि, E12.5, E13.5 या E14.5 पर संस्कृति में शुरू mesenchymal समूहों फार्म और विल्ली उभरने और आंतों में लंबा करने के लिए शुरू अल., 2012) 2. भले ही संस्कृति (E12.5-E14.5) के शुरू में आंत के चरण की, आंतों हमेशा दिखाई देते हैं 24 घंटे की एक अनुमानित देरी है. दो दिनों के लिए संस्कृति में उगाया E14 आंतों utero (चित्रा 1C एफ) 2 में उगाई E16 आंतों की विल्ली से E15 आंतों के उन लोगों के लिए समान हैं कि विल्ली की वृद्धि दिखा.
mesenchymal समूहों की नियमित पैटर्न E15.5 (चित्रा 2 में एक पूरी PDGFRα GFP / + आंत की ऑप्टिकल वर्गों के तीन आयामी पुनर्निर्माण से पता चला है <से reproduced,> / मजबूत वाल्टन एट अल., 2012) 2. इस छवि Leica लास वायुसेना सॉफ्टवेयर द्वारा सिले थे कि देखने के 54 क्षेत्रों के Z-ढेर हैं. आंत के अंदर हर जगह PDGFRα लोकस 14 से व्यक्त परमाणु टैग GFP द्वारा कल्पना एक mesenchymal क्लस्टर है. छवि के उच्च संकल्प ज़ूम में करने के लिए कुछ क्षेत्रों के लिए विवरण की जांच करने के लिए दर्शक की अनुमति देता है, अभी तक देखने या कम बिजली की बढ़ाई की एकल क्षेत्रों से gleaned नहीं किया जा सकता कि गहराई स्थानिक संबंधों में प्रदान करता है. मूवी 1 सिले Z के माध्यम से कदम एक श्रृंखला है 3 डी हैं कि -stack छवियों चित्रा 2 में खंगाला. व्यक्तिगत ऑप्टिकल वर्गों ऐसे समूहों के भीतर एकल कक्षों के रूप में विवरण के आगे दृश्य के लिए अनुमति देते हैं.
PECAM एंटीबॉडी के साथ आंतों vasculature की wholemount immunofluorescence की ऑप्टिकल वर्गों (बी Pharmingen 557355, 1 पतला: 1000) दो photon उत्तेजना और टोह का उपयोग कर लिया गयाImaris सॉफ्टवेयर के साथ structed (चित्रा 3). आंतों रक्त वाहिकाओं के इस तीन आयामी दृष्टिकोण पूरी तरह पतली धारा की तैयारियाँ ने सराहना नहीं की जा सकती कि vasculature की एक जटिल नेटवर्क का पता चलता है. मूवी 2, 3 चित्र में खंगाला छवि के घूर्णन तीन आयामी प्रक्षेपण, कैसे आगे प्रशंसा के लिए अनुमति देता है प्रदान की तीन आयामी पुनर्निर्माण की वृद्धि हुई जानकारी संरचनात्मक patterning की समझ में सुधार कर सकते हैं.
Vibratome सेक्शनिंग एक अनुप्रस्थ सहूलियत से आंत के तीन आयामी देखने के लिए अनुमति देता है. चित्रा 4 में, उपकला और आसपास mesenchyme के साथ 14 (PDGFRα GFP / + के साथ चिह्नित) के विकास समूहों के संबंध (झिल्ली टमाटर (Rosa26 मीट्रिक टन / मिलीग्राम) 15 मनाया जाता है के साथ चिह्नित.
वैकल्पिक रूप से, इस संबंध एंटीबॉडी immunofluore से देखा जा सकता है(एंटी PDGFRα (सांताक्रूज सी 20 के साथ लेबल हरी,, 1 पतला: 200)) mesenchymal समूहों की scence धुंधला (चित्रा 5) उपकला साथ (लाल, विरोधी Ecadherin (बी पारगमन लैब्स 610181 के साथ लेबल, 1: 1,000 कमजोर पड़ने).
इस पूरे अंग संस्कृति प्रणाली भी भ्रूण आंतों के विकास के दो photon इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए बढ़ाया जा सकता है. इस सेट अप में, भ्रूण आंत एक बड़ा संस्कृति की थाली में एक जाल स्क्रीन द्वारा समर्थित एक polycarbonate झिल्ली (चित्रा 6) से चिपके है. confocal खुर्दबीन लेंस के अंदर अच्छी तरह से आंत से संपर्क करने के लिए संस्कृति प्लेट की बड़ी अच्छी तरह से आकार की अनुमति देता है.
एक transwell संस्कृति प्रणाली में पूरे भ्रूण आंतों की चित्रा 1. विकास. (ए) एक transwell मेम पर रखा भ्रूण आंतोंBGJb मीडिया के साथ एक 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में brane. शीर्ष दो आंतों E12.5 हैं, नीचे दो आंतों E13.0 हैं. Transwell संस्कृति प्रणाली में एक ग्रहणी पर रखा गया (बी) गोजातीय सीरम albumin लथपथ agarose मोती (हल्का नीला). गहरा नीला दाग Ptc lacZ के लिए X-लड़की धुंधला है / + हाथी संवाददाता माउस लाइन अंकन mesenchymal समूहों में हौसले से काटा E14.0 (सी), E15.0 (डी) और E16 की 16. (सीएफ) पार वर्गों. ई cadherin (हरा) और DAPI (नीला) के साथ दाग 0 (ई), ग्रहणी ऊतक. E15.0 और E16.0 पर, नवजात विल्ली दिखाई दे रहे हैं, जबकि E14.0 में unremodeled उपकला अभी भी pseudostratified है. (एफ) के दो दिनों के लिए एक आंत्र (सी) में देखा है कि समान खंड, लेकिन सुसंस्कृत (E14 + 2days) थोड़ा देरी हालांकि विल्ली, संस्कृति में है कि विकास को दर्शाता है. पैनलों (सीएफ) वाल्टन एट अल से reprinted रहे हैं., 2012 2 > समर्थन. Scalebars 50 माइक्रोन हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
एक E15.5 wholemount PDGFRα EGFP / + आंत से Z-ढेर के सिले क्षेत्रों की चित्रा 2 तीन आयामी पुनर्निर्माण. छवि एक आंशिक पुनर्निर्माण है 54 सिले क्षेत्रों से (65 जेड वर्गों के केंद्र से पांच 1 माइक्रोन वर्गों) देखने के 900 एनएम पर दो photon लेजर उत्तेजना के साथ एक औंधा डीएमआई 6000 स्टैंड पर LeicaSP5X confocal खुर्दबीन के मोटर चालित मंच का उपयोग कर लिया. Leica लास वायुसेना सॉफ्टवेयर पूरी छवि के रूप में एक साथ जेड ढेर सिले. Scalebar 1 मिमी है.
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एक E14 ग्रहणी में आंत्र vasculature की wholemount विरोधी PECAM immunofluorescence दिखा ऑप्टिकल वर्गों की चित्रा 3 तीन आयामी पुनर्निर्माण. ऑप्टिकल वर्गों 900 एनएम और तीन में दो photon उत्तेजना के साथ खड़े एक ईमानदार डीएमआई 6000 पर एक LeicaSP5X confocal खुर्दबीन पर कब्जा कर लिया गया dimensionally Imaris 7.6.1 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर खंगाला. Scalebar 200 माइक्रोन है.
Vibratome sectioned E15.5 PDGFRα EGFP की चित्रा 4 Confocal छवियों / +; Rosa26 mTmG सूखेपन उनके overlying उपकला साथ mesenchymal समूहों (हरा) के PDGFRα EGFP / + कोशिकाओं के निकट सहयोग दिखा और mesenchyme आसपास के (लाल, Rosa26 mTmG से झिल्ली टमाटर). < / Strong> Scalebars कम पैनल में 50 ऊपरी पैनल में माइक्रोन और 25 माइक्रोन हैं.
दाग एंटीबॉडी immunofluorescence थे कि E15.5 vibratome sectioned आंतों से confocal छवियों के 5 चित्रा तीन आयामी पुनर्निर्माण. Scalebar 50 माइक्रोन है.
2 फोटॉन लाइव इमेजिंग के लिए transwell संस्कृति प्रणाली के 6 अनुकूलन चित्रा. (ए) स्क्रीन एक संस्कृति डिश में रखा गया है जाल. (बी) Polycarbonate झिल्ली जाल स्क्रीन से चिपके है. (सी) अंतड़ी polycarbonate झिल्ली से चिपके और फिनोल मुक्त DMEM मीडिया के साथ सुसंस्कृत हैं.
चित्रा 2 में E14 ग्रहणी में PECAM दाग vasculature की ऑप्टिकल वर्गों के तीन आयामी पुनर्निर्माण दिखा मूवी 2 घूर्णन फिल्म.
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Discussion
गतिशील प्रकृति और विकासशील आंत की जटिल ऊतक बातचीत इन Morphogenetic घटनाओं की एक पूरी प्रशंसा करने के लिए 3 डी दृश्य की आवश्यकता है. इमेजिंग तकनीक के साथ विकसित, क्षमता / विकासशील सुधार और इसके साथ, जीवोत्पत्ति के दौरान स्थानिक संचार और बातचीत की समझ बहुत बढ़ाया है विस्तार से अंकुर morphogenesis जांच करने के लिए.
पूरे आंतों संवर्धन के लिए वैकल्पिक तरीकों का भी परीक्षण किया गया है, लेकिन transwell प्रणाली अब संस्कृति समय के लिए और सामान्य क्लस्टर और अंकुर patterning को बनाए रखने के लिए सबसे विश्वसनीय बनी हुई है. तीन आयामी संस्कृति सिस्टम (Matrigel या कोलेजन) छोटी आंतों (E12.5-E15.5) की कमी संस्कृति अवधि (कम से कम 24 घंटे) के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, लेकिन आंतों एंजाइमों और अपशिष्ट क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला जैसे आंदोलनों के दौर से गुजर और स्रावित शुरू एक बार लुमेन में, तीन आयामी substrates अच्छी तरह से पकड़ नहीं है. तरल संस्कृति में अंतड़ीभी, हालांकि, एक मुक्त अस्थायी संस्कृति में उन्मुखीकरण के लिए समर्थन या संदर्भ की कमी का विकास होगा समूहों और विल्ली के सामान्य पैटर्न बदल गया लगता है. इसलिए, transwell प्रणाली क्लस्टर patterning और अंकुर उद्भव और परिणाम की जांच करने के लिए पसंद किया जाता है.
एक कम कठोर सेट अप के साथ wholemount लाइव इमेजिंग के लिए एक अन्य तरीका एक 35 x 10 मिमी प्लेट के नीचे पर 7% agarose की एक पतली परत के लिए भ्रूण आंत प्रत्यय minutien पिन का उपयोग करने के लिए है. इस पद्धति स्थापित करने के लिए आसान है, Matrigel आंत्र स्राव को पकड़ नहीं होगा क्योंकि इसके प्रयोग युवा चरणों (E12.5-E15.5) या कम संवर्धन समय के लिए करने के लिए सीमित है कि ध्यान दें.
संस्कृति प्लेटें तैयार करते हैं, सिर्फ एक 35 x 10 मिमी प्लेट के नीचे कवर करने के लिए पर्याप्त पिघल 7% agarose डालना. यह अभी भी निंदनीय है जबकि agarose के केंद्र में एक गिलास केशिका ट्यूब रखें. Agarose जम जाने के बाद, गिलास केशिका हटाने और टी जगहवह अच्छी तरह से केशिका द्वारा बनाई गई साथ आंत भ्रूण. आंत के चारों ओर और Matrigel सेटों तक 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति पकवान स्थान के लिए Matrigel के साथ अच्छी तरह से केशिका भरें. ध्यान से फिनोल लाल मुक्त DMEM संस्कृति मीडिया जोड़ें. एक नम कक्ष बनाने के लिए पानी के साथ 60 मिमी प्लेट एक 60 x 15 मिमी प्लेट के अंदर 35 x 10 मिमी प्लेट रखें और भरने.
क्षेत्र के वांछित अभिविन्यास देखे जा करने पर बढ़ते विधि (wholemount या vibratome) लाइव इमेजिंग के लिए चुनाव आधारित है. उदाहरण के लिए, शिखर और बेसल सतहों के विचारों को प्रदान करेगा एक wholemounted आंत के माध्यम से उपकला सेल आकार में परिवर्तन, Z-ढेर देखने के लिए. उपकला चादर के भीतर उपकला कोशिकाओं के परमाणु प्रवास interkinetic देखने के लिए, vibratome वर्गों (अनुप्रस्थ) देखने पर एक अंत शिखर और बेसल सतहों का पालन करने की अनुमति देते हैं.
नमूनों की तैयारी सबसे अच्छा इमेजिंग परिणाम उपज के लिए महत्वपूर्ण है. Vibratome वर्गों एक का उपयोग करते समयएन डी मानक confocal माइक्रोस्कोपी, अच्छा संकल्प एक समाशोधन अभिकर्मक बिना 75 माइक्रोन की गहराई तक का प्राप्त किया जा सकता है. इमेजिंग की गहराई सीमित है इसलिए वर्तमान में, लाइव नमूने के लिए एक समाशोधन अभिकर्मक पहचान नहीं की गई है. तय नमूने लिए, एक समाशोधन अभिकर्मक का उपयोग बहुत इमेजिंग की गहराई में सुधार कर सकते हैं. सबसे अच्छा आकारिकी प्रदान और संकल्प में पाया समाशोधन अभिकर्मक फोकस साफ़ 17 वर्ष के थे. फोकस स्पष्ट और स्पष्ट माउंट में बढ़ते में समाशोधन के 30 मिनट के बाद, भ्रूण आंतों के सभी चरणों की पूरी गहराई उत्कृष्ट संकल्प के साथ imaged किया जा सकता है. एक कम महंगा समाशोधन वैकल्पिक 70% ग्लिसरॉल, भ्रूण ऊतकों में प्रवेश की लेकिन अधिक से अधिक गहराई है 150 m, उसके बाद संकल्प और संकेत की तीव्रता खो दिया है.
एक महत्वपूर्ण नोट संकेतों सबसे घुड़सवार और धुंधला पूरा किया गया उसी दिन imaged हैं कि नमूने में परिभाषित कर रहे हैं. (संकेत के संरक्षण जलीय बढ़ते मध्यम के साथ बढ़तेऐसे लम्बा सोने विरोधी फीका समाधान (जीवन टेक्नोलॉजीज P36930) केवल संक्षिप्त संकेत के संरक्षण के साथ मदद करता है, लेकिन के रूप में; स्पष्ट छवियों हमेशा नमूने धुंधला और बढ़ते के बाद तुरंत प्राप्त कर रहे हैं.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
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