Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Förbättrade I-gel Reduktiva β-Eliminering för omfattande O-kopplade och sulfo-glycomics med masspektrometri

doi: 10.3791/51840 Published: November 20, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glykosylering är en viktig protein posttranslationell modifiering, vilket bidrar till organismfysiologi, vävnadspatologi och celligenkännings 1-3. Trots stora framsteg inom analytisk Glycoscience, karakterisera hela mångfalden av glycans på ett specifikt protein fortfarande är ett mycket utmanande uppgift, särskilt på proteiner isolerade från primära biologiska källor. Icke desto mindre mikroheterogenitet av glykoprotein glykanema drabbar ofta funktionella interaktioner med andra proteiner. Därför är en förutsättning för att förstå den fysiologiska betydelsen av cell- och vävnads glykosylering 4,5 karakterisering av glycan mångfald. För att förstå bidrag glykoprotein glykosylering till vävnads fysiologi och patofysiologi, robust, känslig, och omfattande glycomic analystekniken har blivit allt viktigare. I proteomik analys, är protein identifieringar allmänhet genom LC-MS/ MS-analys av tryptiska peptider 6. Protein digestion kan utföras med användning av ett renat protein eller proteiner upplöstes genom SDS-PAGE efter in-gel digestion med proteaser, såsom trypsin 7-9. Pre-anrikning av proteinblandningen genom SDS-PAGE ökar djupet och noggrannhet av protein-ID. Utvecklingen av analoga strategier för glycomic analys av glykoprotein glykosylering ligger i framkant av Glycoscience.

De två huvudklasser av glykaner är knutna till protein stamnät via antingen N-koppling eller O-koppling. N-länkade glykaner är bundna till asparagin (Asn) rester hittades som en del av en sequon definieras såsom Asn-X-Ser / Thr / Cys (X är någon aminosyra förutom prolin), och kan frigöras genom enzymatisk spjälkning med peptid- N -glycanase (PNGasF eller A), antingen i lösning, i-gel eller på-blot 10-12. O-kopplade glykaner är i huvudsak fäst till serin (Ser) eller treonin (Thr) -rester. Dock har endast ett enzym har identifierad som är i stånd att frisätta O-kopplade glykaner från glykoproteinet och den har en extremt begränsad glykan specificitet, endast släppa de enklaste O-kopplade glykaner. Kemisk frigör strategier förblir metoden för omfattande frisättning av O-kopplade glykaner från glykoproteiner. Reduktionistisk eller icke-reduktiv β-eliminering, eller hydrazinolys är väl karakteriserade kemiska släpptekniker och är idag de vanligaste tillvägagångssätten för att frigöra O-kopplade glykaner från glykoproteiner 13,14. Även reduktiv β-eliminering har använts för att släppa O-kopplade glykaner från glykoproteiner separerade med SDS-PAGE, tidigare tillvägagångssätt krävs HPLC-separation för senare analys 15-17.

Multidimensional MS (MS n) analys ger för närvarande den rikaste källan till strukturella uppgifter för att karakterisera glykaner frigörs från glykoproteiner isolerade i de mängder som förväntas av de flesta biologiska källor. Djupet av MSbaserade strukturell karakterisering underlättas i hög grad genom permethylating de frigjorda glykanerna före deras analys. Permetylering ökar jonisering och tenderar att utjämna molar signalsvar över ett brett spektrum av glykanstrukturer 18,19. Dessutom permetylering taggar entydigt terminal- och monosackarid grupper med distinkta massorna, och därigenom förbättra den strukturella belysning 20-23. Till exempel, sura glykaner är generellt svåra att upptäcka som icke-permetylerad arter av MS. Även sura glykaner kan detekteras i negativ jon-läge genom MS, är det omöjligt att upptäcka både sura och neutrala glykaner i samma jon-läget. En stor fördel med glykan permetylering är att alla de fria hydroxylgrupperna (OH) på en glykan s monosackarid substituenter kommer att begränsas med en metylgrupp (OCH3 eller OMe), sålunda är en sialylerade glycan laddningar är neutraliserade, vilket gör dem möjliga att upptäcka som permetylerad neutral (asialo) glykaner. Men hydroxylema av sulfatgrupper på sulfoglycans är resistenta mot permetylering, vilket resulterar i kvarhållande av anjonisk laddning, som undertrycker jonisering och minskar känsligheten. Denna dämpning förhindrar för närvarande omfattande glycomic analys av mycket komplexa glykoproteiner såsom muciner, som bär en hög förekomst av sulfate glycans 24-26.

Nya rapporter om rening av sulfat glykaner använde laddade, omvänd fas-kromatografi för att rena och separera permetylerad glykaner före MALDI analys. Denna metod bygger på fullständig separation av sulfate och icke-sulfate glykaner med olika mobila faser för eluering, som vi har funnit vara mindre stränga än organisk fas partitionering. Därför är nya tekniker som är lämpliga för detektering och anrikning av sulfoglycans presenteras här. Dessa tekniker möjliggör kvantitativ återvinning av sulfate glykaner i vattenfasen efter vatten: DCM (diklormetan)utvinning, som rutinmässigt utförs i slutet av glycan permetylering reaktioner 27. Viktigt är denna robusta separation av permetylerad sulfoglycans från en blandning av permetylerad icke-sulfate glykaner berikar samtidigt för laddade samtidigt förenkla MS 2 fragmenteringsmönster. En omfattande protokoll för förbättrad i-gel O-bunden glykan analys görs också. Den förbättrade protokollet förbättrar glycan återhämtning, ökar strukturell information kan erhållas genom MS n analys av permetylerad glykaner, och förbättrar känsligheten för sulfoglycomic analyser tillämpas på väsentliga glykoproteiner isolerade från biologiska källor.

Detta protokoll är avsedd för O-kopplad glykan analys av hela glykoprotein extrakt eller av ett specifikt glykoprotein av intresse upplöstes genom SDS-PAGE och är sammansatt av tre experimentella procedurer; A) gel sanering, B) i-gel reduktiv β-eliminering, och C) glykan permethyning. Målet är att få heltäckande O-länkad glycomic uppgifter för glykoproteiner som skördats från primära källor av biologiskt intresse (Figur 1). Glykoproteiner separerade med SDS-PAGE visualiseras genom färgning och band av intresse skars ut och den resulterande gelén bandet är skuret i små bitar. Gelén Bitarna avfärgades och utsattes för etylacetat tvättar för att avlägsna gel föroreningar (Figur 2A). Glykanen frisättning uppnås genom i-gel reduktiv β-eliminering (Figur 2B) och de frigjorda glykanema är permetylerad. Vatten-organiskt extraktion enligt permetylering partitioner kvantitativt de anjoniska sulfat glykanema bort från icke-sulfate neutrala glykaner (figur 2C). I-gel reduktiv β-eliminering som är kopplad till vatten-organiskt extraktion möjliggör karakteriseringen av O-kopplade glykaner och sulfoglycans frisatta från små mängder glykoprotein separerades genom SDS-PAGE. Den strategiska översikten är summariZed i figur 1 och detaljerna visas i figur 2. Dessutom kan en del av de avfärgades och tvättade gelstycken användas för protein ID med standard LC-MS / MS proteomik tekniker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OBS: Lab Säkerhets Betänkande

I linje med vanliga laboratorie bästa praxis, observera följande. Förvara alla organiska lösningsmedel i lämpliga platser. Håll alla avfallsmaterial i kemiska avfallsbehållare med tydlig märkning av kemiska sammansättningar. Eftersom flera reagenser som används i dessa protokoll är potentiella cancerframkallande eller generera flyktiga brännbara gaser, hantera alla reagenser i ett dragskåp med ventilation. Använd personlig skyddsutrustning såsom handskar, skyddsrock och skyddsglasögon vid arbete med organiska lösningsmedel.

Figur 1
Figur 1. Förfarande för i-gel O-glycomics. (A) Proteiner av intresse löses med SDS-PAGE, detekteras genom lämpliga färgningsförfaranden (Coomassie eller silver), och skars. Utskurna gelpartierna skivasi små kuber, avfärgades, och tvättas med etylacetat för att minska föroreningar som stör efterföljande MS-analys. En del av gelskivan kan reserveras i-gel Tryptic rötning och efterföljande proteomic karakterisering med LC-MS / MS. (B) O-kopplade glykaner frigörs från upplösta glykoproteiner från i-gel reduktiv β-eliminering. Viktiga steg inkluderar avsaltning och borat avlägsnande genom azeotrop med metanol. (C) O-kopplade glykaner som frigörs genom reduktiv β-eliminering är permetylerad och därefter fördelades in i vattenhaltiga och organiska faser. Sulfoglycans kvantitativt återvinns i den övre (vatten) fasen medan neutrala och sialylerade glykaner partition i den nedre (DCM) skikt.

Figur 2
Figur 2. Detalj flödesschema för i-gel glycomics. Vardera experimental steg som visas i figur 1 är individuellt illustreras. (A) gel avfärgning och EtOAc extraktion, (B) direkt in-gel reduktiv β-eliminering för O-bunden glykan release, och (C) permetylering och fas partition. Klicka här för att se en större version av bilden.

1. Gel Excision och borttagning av Gel-härledda Föroreningar

  1. Innan du påbörjar proceduren, förbereda kemikalier och reagens som anges i materiallistan.
  2. Lösa proteinet på SDS-PAGE-gel med användning av standard Tris-glycinbuffert-system. Stain löst proteiner med antingen Coomassie Brilliant Blue eller silver Stain. I allmänhet, är återvinning av O-kopplade glykaner från silverfärgade geler cirka 80-90% av den återhämtning uppnås från Coomassie-färgade geler.
  3. Efter elektrofores, placera gelen på en glasplatta och punkt tHan regionen av intresse med en ren skalpell eller rakblad.
  4. För att öka utbytet av O-glykaner, överföra gel intressanta bandet på en annan glasplatta och skär den utskurna gelstycket in ungefär 2 mm kuber. Undvik att göra gelstycken mindre än 1 mm kuber eftersom glykanen återhämtning minskar. Överför de små gelpartierna till en skruvtoppglasröret (13 x 100 mm) med en microspatula rostfritt stål.
  5. Tillsätt 1 ml 25 mM ammoniumbikarbonat (AMBIC, NH 4 HCO 3) till provröret, mössa glasrör med en Teflon-fodrade skruvtoppkåpa, och blanda försiktigt genom att ställa röret innan du låter stå i 10 min. Inte anställa kraftig omrörning för att undvika rippning gelen bitar.
  6. Ta försiktigt bort AMBIC från glasröret med hjälp av antingen en Pasteur glas pipett eller en pipett utrustad med en extra lång plastspets. Undvik smashing och överföring av små gelstycken när du tar bort den AMBIC lösningen.
  7. Tillsätt 1 ml acetonitril (ACN) tillglasrör, mössa, och blanda försiktigt genom att ställa röret innan låta stå i 10 min. Säkerställa att de gelpartierna är helt täckta med lösningsmedel. Om nödvändigt, pressa gelpartierna off av rörväggen och in i lösningsmedlet med pipettspetsen.
  8. Pipettera av ACN från glasröret och upprepa steg 1,5-1,7 tills den ljusa blå färgen elimineras. Upprepa minst fem sekventiella AMBIC / ACN tvättar om det behövs. För silver färgade geler, använd en avfärgning kit. Fortsätt till nästa steg när gelstycket vänder jämnt vit medan i ACN.
  9. Pipet bort den vätska från glasröret, sätt på röret, tillsätt 1 ml av AMBIC och låt stå i 5 min.
  10. Avlägsna AMBIC och tillsätt 2 ml etylacetat (EtOAc) till glasröret. Resumé rör med teflonfodrad locket och rum vid 4 ° C över natten med ände-över-ände agitation eller alternativt utföra tre EtOAc-tvättningar vid rumstemperatur under 30 min vardera. Ju längre EtOAc tvätt, desto mer effektivt avlägsnande av kontaminanter.
  11. Ta bortSlut EtOAc tvätta och utföra tre tvättar med vardera 2 ml H2O Fullständigt avlägsnande av EtOAc kommer att säkerställa en robust reduktiv β-elimineringsreaktion.
  12. Pipettera H2O och dehydratisera gelén genom tvättning en gång med 1 ml av ACN.
    NOTERA: Efter torkning de dehydratiserade geler är klar för in-gel β-eliminering. Dehydratiserade gelpartierna kan lagras vid -20 ° C fram till användning.
  13. Stoppa tvättprocessen vid varje steg och lagra gelpartierna vid 4 ° C över natten, oavsett vilken buffert eller lösning anbringas på gelén (AMBIC, ACN, H2O). Starta om provberedning som helst inom de kommande 2 dagarna.
  14. Använd en del av de avfärgades och torkade gelstycken för protein ID med standard proteomik metoder.

2. I-gel O-glykanen Release genom reduktiv β-Eliminering

  1. Bered en förrådslösning av 1 M natriumhydroxid (NaOH) med användning av 50% NaOH eller fast NaOH och förvara vid 4 ° C fram till användning. Ta 5,2 ml av 50% NaOH (eller 4 g fast NaOH) och justera volymen till 100 ml för att göra en M NaOH-lösning. Späd 1 M NaOH stamlösning till 100 mM NaOH, som kan lagras vid 4 ° C upp till 6 månader utan förlust av effektivitet i reduktiva reaktioner β-eliminering.
  • Gör två M natriumborhydrid (NaBH4) i 100 mM NaOH. Lös upp 38 mg av NaBH4 i 0,5 ml av 100 mM NaOH. Generellt använda 0,5-1,0 ml av borhydrid lösning för varje prov. Variera volymen av reaktionslösningen på mängden torkade gelpartierna som framställts i steg 1. Räkna med att använda 0,5 ml borhydridlösning för 1-2 exciderade gelstycken (steg 1,3).
  • Lägg 500 l 100 mM NaOH till de torkade gel bitar och låt stå i 3-5 minuter på isen för att jämna ut gelen till de grundläggande villkoren som höjer glycan återhämtning.
  • Lägg 500 pl 2 M NaBH4 i 100 mM NaOH, vilket resulterar i slutliga koncentrationer av 1 M NaBH
  • Under den första timmen av inkuberingen, blanda försiktigt röret var 15 min. Undvik kraftig omrörning, eftersom det kan splittra gelen bitar. Utföra reaktionen i ett väl ekvilibrerad inkubator / ugn eller i ett värmeblock. Säkerställa att de gelpartierna är täckta med reaktionslösningen.
  • Stoppa reaktionen genom att avlägsna provröret från inkubatorn eller värmeblocket och placera den på is.
    ANMÄRKNING: Efter att ha låtit den β-elimineringsreaktion fortskrida under 18 h, måste avsaltningsprocessen utföras inom samma dag.
  • 3. Avsaltning på katjonbyteskromatografi

    1. Under upprätthållande av provröret på is för att förhindra överdriven värmebildning, tillsätt långsamt 10% ättiksyra (AcOH) droppvis för att neutralisera basen. Virvel försiktigt provröret mellan tillsatser av AcOH. Var noga med att lägga syra långsamt och droppvis som additipå syra kommer att producera en "vulkan" av bubblor. Centrifugera röret för att eliminera bubblor och hindra spillover, om så är nödvändigt.
      1. I syfte att avlägsna den stora mängden natrium i reaktionsblandningen, passera reaktionsblandningen genom en liten katjonbyteskolonn (Dowex eller AG-50W-X8-harts, H + -form).
      2. Tvätta katjonbytarhartset med ett M NaOH och 1 M HCl före användning i syfte att avlägsna föroreningar som interfererar med MS-analys, även om hartset är av analytisk kvalitet.
      3. Blöt hartset i 1 M NaOH och ta bort lösningen genom dekantering. Lägg avjoniserat vatten, ta bort vatten, tillsätt sedan 1 M HCl.
    2. Upprepa dessa steg tills lösningen ovanför hartset är färglös. Tvätta den rengjorda hartset med avjonat vatten och lagra i 5% AcOH vid 4 ° C.
    3. För att göra en liten glaskolonn, skrapa och bryta spetsen av en Pasteur glaspipett med hjälp av en keramisk fräs så att avsmalningen av pipettspetsen är ca 1 cm lång. Retas isär en plugg av glasull och tryck mot spetsen bildar ett stöd för det hartsbädden. Säkra pipett-kolonn med en klämma eller klädnypa och rum över ett provrör av glas.
    4. Tvätta den tomma pipetten med en ml metanol (MeOH) och 3 ml av 5% AcOH. Swirl H + Dowex eller AG50 katjonbytarharts uppslamningen lagrades i 5% AcOH och överföra tillräckligt av uppslamningen för att producera en 1 ml bäddvolym i pasteurpipett kolonnen.
    5. Skölj kolonnen med fem volymer 5% AcOH. Kontrollera flödet genom för uppkomsten av hartspartiklar och använd inte kolumnen om harts upptäcks.
    6. Placera kolonnen över en ny skruv topp glasrör (16 x 125 mm) och lastprov. Samla flödet genom och eluera glykaner med minst tre volymer av 5% AcOH in i samma rör.
    7. Täck röret med Parafilm och göra små hål med en nål. Placera provröret vid -80 ° C eller på torris. När frysta torkas provet genom frystorkning. Lagra det torkade materialet vid -20 °C fram till användning.

    4. Borat Borttagande

    1. Bered 10% AcOH i MeOH. Ta 10 ml av isättika och justera volymen till 100 ml med metanol. Förvara detta reagens i en glasflaska med Teflon-fodrat lock i upp till 6 månader.
    2. Addera 300 pl av 10% AcOH i MeOH till den torkade, lyofiliserat provrör och virvel. Avlägsna det resulterande trimetylborat genom indunstning under en N 2 strömmen.
      OBS: Blandning boratsalter med metanol under sura förhållanden producerar trimetylborat som är en flyktig förening.
    3. Torr under N2 ström vid 37 ° C. Efter torkning, lägga till ytterligare en portion av AcOH i MeOH som beskrivs i steg 4.2. Torka vätskan under 5 min under kväve (N 2) ström vid 37 ° C.
      1. Upprepa resuspension och torkning åtminstone tre gånger. Lagra det torkade materialet vid -20 ° C fram till användning.

    5. C18 Clean-up

    1. Jämvikta en C18 patron kolonn(Storlek 1 ml, 100 mg harts) med tre volymer av ACN och fem volymer 5% AcOH. Påskynda passage av de utjämnande lösningar genom tillämpning av mild positivt lufttryck.
    2. Addera 500 pl av 5% AcOH till den avsaltade och boratfria provrör och löses upp genom virvel.
    3. Ladda återsuspenderades provet på ekvilibrerad C18-kolonn och samla flödet genom i en glasskruvlock rör (13 x 100 mm). Eluera O-glykaner med 3 ml 5% AcOH in i samma rör.
    4. Parafilm på röret, gör små hål med en liten nål eller använd löst sluten PTFE-fodrade lock för att täcka röret och frysa provet vid -80 ° C eller på torris. Avlägsna lösningsmedlet genom lyofilisering. Lagra det torkade provet vid -20 ° C fram till användning.

    6. Grund Förberedelse för permetylering

    OBS: För att uppnå robust permetylering, förbereda NaOH slurry fräsch. Allt glas som används för permetylering reaktioner bör utförligt rengöras.

    1. För att framställa den basreagens för permetylering, tillsätt 400 | il av 50% NaOH till en ren glasskruvlock rör (13 x 100 mm). Addera 800 pl av vattenfri MeOH och vortexa.
    2. Lägg 4 ml vattenfri dimetylsulfoxid (DMSO) och virvel för att alstra en vit fällning.
    3. Centrifugera vid 600 x g under 1 min för att pelletisera fällningen. Pipettera av supernatanten och kasta. Lägg ytterligare 4 ml vattenfri DMSO till pelleten. Vortex.
    4. Upprepa steg 6,2 och 6,3 i minst tre gånger eller tills inga vit fällning bildas.
    5. Upplös den pellete bas i 3 ml vattenfri DMSO och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner med en ren pasteurpipett.
    6. Använd basen omedelbart för följande permetylering reaktion som den inte kan lagras.

    7. permetylering av Släppt glycans

    1. Tillsätt 200 pl av vattenfri DMSO till C18-renade provet och skaka eller sonikera att resuspendera.
    2. Addera 300 pl av resuspended bas uppslamning till provet och omedelbart lägga till 100 | il av jodmetan (Mel). Förslut röret med teflonfodrad locket och kraftigt blanda under 5 min med virvel.
    3. För att stoppa permetylering reaktionen, tillsätt 2 ml av 5% AcOH på is och skaka. Pipett lösning upp och ner 5 gånger för att minska den kvarvarande volymen av Mel genom avdunstning.
      OBS! AcOH neutraliserar lösningen och avlägsnande av Mel ökar extraktionseffektiviteten av sulfate glykaner i vattenfasen under fas-partitionen.
    4. Tillsätt 2 ml diklormetan (DCM) och skaka. Centrifugera vid 600 x g under 1 min vid rumstemperatur för att separera de vattenhaltiga och organiska faserna.
    5. Överför det översta lagret (vattenfas som innehåller merparten av permetylerad sulfate glycans) i en ny glasrör (13 x 100 mm).
    6. Tillsätt 2 ml H2O till den organiska fasen och skaka. Centrifugera vid 600 xg under 1 min för att separera de vattenhaltiga och organiska faserna och kombinera denna andra vattenhaltig fas med granst vattenhaltiga fasen (steg 7,5).
    7. Upprepa steg 7,6 och 7,5 tre gånger till, men det finns inget behov av att spara de vattenhaltiga faserna som följer av de följande partitioner.
    8. Avlägsna den slutliga toppskikt (vattenhaltig fas) så mycket som möjligt från bottenskiktet (organisk fas) och för över det undre skiktet (organisk fas) i en separat ny glasrör med användning av ren pasteurpipett.
    9. Torka den organiska fasen under N2 ström vid 42 ° C.
    10. Täck röret med Parafilm och förvara vid -20 ° C fram till användning.

    8. C18 Saneringen av permetylerad Sulfat O-glykaner från vattenfasen

    1. Jämvikta en C18 patron kolonn med tre volymer av ACN och fem volymer 5% AcOH.
    2. Ladda de vattenhaltiga faserna uppsamlades och kombinerades från steg 7,5 och 7,6 på kolonnen.
    3. Tvätta kolonnen med 10 ml H2O för avsaltning.
    4. Eluera permetylerad sulfat O-glykaner i en ny glasrör med 2 mlav 50% ACN. Använd en extra eluering med 85% ACN att öka återvinningen av permetylerad sulfate O-glykaner på större oligosackarider.
    5. Torra eluaten under kväveström vid 42 ° C.
    6. Lagra det torkade materialet vid -20 ° C upp till 6 månader före MS-analys.

    9. masspektrometri av permetylerad O-glykaner

    1. Analysera permetylerad O-glykaner genom direkt infusion in i en lämplig masspektrometer med användning av en nanoelectrospray källa vid en spruta flödeshastighet av 0,40 till 0,60 | j, l / min vid 210 ° C kapillär temperatur. För fragmentering av CID i MS / MS och MS n en jonfälla instrument, tillämpas 30-40% kollisionsenergi.
    2. För negativ jon-läge, rekonstituera permetylerad sulfaterad O-glykaner i 50 | il metanol / 2-propanol / 1-propanol / 13 mM vattenlösning av ammoniumacetat (16: 3: 3: 2 i volym). För positiv jonmod, rekonstituera permetylerad neutrala / sialylerade O-glykaner i 50 pl av en mM natriumhydroXide i metanol / vatten (1: 1).
    3. Använd den totala jon kartläggning (TIM) och neutral förlust scan (NL scan) funktionalitet Xcalibur programpaket version 2.0 för MSN-analys för att karakterisera enskilda O-glykanstrukturer 13,19.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Effekt av etylacetat Behandling Före In-gel Reduktiv β-Eliminering

    Ett representativt masspektrum av permetylerad O-kopplade glycan prover som frigörs från bovin mucin med användning av i-gel reduktiv β-eliminering visas i figur 3. EtOAc-tvätt av gelpartierna effektivt bort SDS och polyakrylamider föroreningar som interfererar med efterföljande MS-analys 27.

    Figur 3
    Figur 3. Etylacetat tvätt av polyakrylamidgel bit före i-gel reduktiv β-eliminering förbättrar upptäckt av frigjorda glykaner. (A) utan tvätt med etylacetat, massspektrum permetylerad O-bundna glykaner släpptes av i-gel β-eliminering från nötkreatur submaxillärt mucin domineras av ett överflöd av en polydispers contaminant, som nästan helt döljer MS-signaler i samband med O-kopplade glykaner. (B) tvättning av gelén stycke med etylacetat eliminerar föroreningstoppar, vilket möjliggör känslig detektion av glykaner. Modifierad från Kumagai 25.

    Återvinning av O-kopplad Glycan är större från små gelskivor

    O-kopplade glykaner släpptes från nötkreatur submaxillärt mucin genom in-gel reduktiv β-eliminering med hjälp gelstycken som antingen skivade små (~ 2 x 2 mm) eller stora (~ 5 x 5 mm). Gel bitar som är mindre än ~ 2 x 2 mm var inte effektivt återvinnas genom tvättsteg. Efter permetylering, en känd mängd av en permetylerad yttre glycan standard (maltotri- och maltotetrasaccharide, DP3 och DP4) sattes till varje underlätta kvantifiering av glycan återhämtning 27. Återvinningen av O-kopplade glykaner från små gelstycken var nästan 10 gånger större än från stora gelskivor (Figur 4).

    Figur 4
    Figur 4. Glycan återhämtning från små gelstycken är effektivare än från större bitar. Små bitar (~ 2 x 2 mm) gav mer glykanen än större kuber (~ 5 x 5 mm). Staplarna visar relativa signalnivåer för summan av alla O-kopplade glykanstrukturer normaliserade till signalen detekteras för en extern standard (maltotrisaccharide DP3, satt till 100%), vilket lades till den frigjorda glykanen innan MS-analys. Värdena är medelvärde standardavvikelse för n = 3. Modifierad från Kumagai K 25.

    Anrikning av Sulfoglycans från fas Partition

    En permetylerad sulfaterad glykan standard (sulfo-Le a) fullständigt återvinnas i den vattenhaltiga fasen. Permetylerad sialylerade glykaner frigörs från the mucin glykoprotein uppdelad i DCM fasen (Figur 5). Återhämtningen av varje permetylerad glykaner av vatten-organiskt partition var jämförbar med den som tidigare kännetecknas C18 Sep-Pak sanering metod 27. Effektiviteten och enkelheten av fas partitionen metod underlättar i hög grad provkapacitet och efterföljande analytiska metoder.

    Figur 5
    Figur 5. Differential återvinning av sulfo- och sialo-glykaner från fas partition. Bovin mucin glykoprotein spetsades med en känd mängd av en sulfo-glycan standard (sulfo-Le a) innan den utsätts för reduktiv β-eliminering. Tillstånd glykaner permetylerad och permetylering reaktion justerades till 1: 1: vatten: DCM. De resulterande organiska och vattenhaltiga faserna separerades och analyserades medelst MS. Glykanen återhämtning kvantifierades reltiva till permetylerad externa glycan standarder, som spetsades i provet innan MS-analys. Glykanen återvinningar i den organiska (DCM) och vatten (Vatten) faser visas i förhållande till extern standard, som var inställd på 100%. Sulfoglycans var odetekterbart i den organiska fasen, men kvantitativt utvinnas i den vattenhaltiga fasen. Resultaten representerar medelvärde ± SE för tre oberoende experiment. Modifierad från Kumagai 25.

    Tillämpning på Fördjupad proteomik och Glycomic Analyser i biologiska prov

    Human saliv proteiner separerades genom SDS-PAGE och färgades med Coomassie Brilliant Blue (G-250). En hög molekylvikt protein vid MW ~ 600 kD skars ut från gelén och en del av gelén stycket utsattes för in-gel tryptic digestion och LC-MS / MS-baserade proteomic analys, som identifieras här bandet som MUC5B 16,24 . Återstoden av gelén stycket utsattes för i-gel-redu ctive β-eliminering för O-glycan analys 27. Efter permetylering och vattenhaltig-organisk fas partition (Vatten: DCM, 1: 1), permetylerad glykaner i de vattenhaltiga och organiska faserna analyseras med NSI-MS. Icke-sulfate permetylerad O-glykaner utvanns från den organiska fasen och alla permetylerad sulfoglycans återvanns från vattenfasen, vilket underlättar identifiering och karakterisering av nästan isobarisk sulfaterad och icke-sulfate glykaner, t.ex. Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 GalNAc-ol (m / z = 1606,8, [M + Na] +) och (SO 3) en NeuAc 1 Fuc 1 Hex 2 HexNAc en GalNAc-ol (m / z = 1606,7, [M + 2Na-H] +) skiljer sig med endast 0,1 mass enheter och skulle vara svårt att lösa utan att fysiskt separera de två arterna av fas partition (Figur 6).

    pload / 51840 / 51840fig6highres.jpg "width =" 700px "/>
    Figur 6. Upptäckt av isobarisk komplexiteten i neutrala och sulfo-glykaner åtskilda av vatten-organiskt partition. MS 2 fragmenteringsmönster som erhållits från moderjoner som upptäckts av total jon kartläggning (TIM) analys av permetylerad O-glykaner frigörs från mänsklig saliv mucin genom in-gel β-eliminering och vatten: DCM partition efter permetylering. (A) MS 2 från TIM analys av DCM fas för en 2,8 massenhet fönster runt m / z = 1608. (B) MS 2 spektrum för samma massa fönster för TIM-analys av vattenfasen. I DCM-fasen, de stora fragmentjoner motsvarar förlust av Hex 1 -O (m / z 1370,8), Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 + Na (1.331,8), förlust av Fuc 1 Hex 1 -O (1.196,7), förlust Hex 1 HexNAc 1 (1.143,6), förlust av Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 (969,5), förlustav Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1 O (747,4), Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 + Na (660,4), och Hex 1 HexNAc 1 + Na (486,3). Baserat på dessa fragmentjoner, är en blandning av icke-sulfate strukturer med en sammansättning av Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 GalNAc-ol föreslås som visas till höger av spektrumet. I motsats härtill har de större fragmentjoner för vattenfasen är förlust av SO 3 Na (1486,8), förlust av NeuAc (1231,5), förlust av Fuc 1 Hex 1 -O (1196,7), förlust av en kombination av NeuAc och SO 3 Na ( 1111,8), och förlust av NeuAc 1 Hex 1 -O (1009,4). En blandning av sulfaterade strukturer med en sammansättning av (SO 3 -) 1 NeuAc 1 Fuc 1 Hex 2 HexNAc en GalNAc-ol föreslås. Utan fysisk separation av den neutrala och sulfoglycans från fas partition, tolka MS 2 spektra av sådana blandningar är betydligt mer challenging. Modifierad från Kumagai 25. Klicka här för att se en större version av bilden.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Water, deionized water Sigma-Aldrich  270733-4L CHROMASOLV, for HPLC
    Acetic acid, Glacial Fisher A38-500 Certified ACS ≥99.7% w/w
    Methanol Sigma-Aldrich  34860-4L-R CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9%
    Ammonium bicarbonate Fluka 09830-500G BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1
    Acetonitrile Sigma-Aldrich  34998-4L CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1
    Ethyl acetate Fluka 34972-1L-R LC-MS CHROMASOLV, Step 1
    Sodium borohydride Aldrich 213462-25G ReagentPlus, 99%, Step 2
    Iodomethane Sigma-Aldrich  289566-100G ReagentPlus, 99.5%,  Step 6.  Store at 4 °C until use.  Sit at room temperature before use.
    Sodium hydroxide solution, 50% w/w Fisher SS254-1 Certified, Step 6
    Dimethyl sulfoxide, anhydrous Sigma-Aldrich  276855-1L Anhydrous, ≥99.9%, Step 6
    Methanol, anhydrous Sigma-Aldrich  322415-100ML Anhydrous, 99.8%, Step 6
    Dichloromethane Sigma-Aldrich  34856-4L CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7
    Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh Sigma-Aldrich  217506-500G Step 3
    AG 50W-X8 Resin  Bio-Rad 142-1441 Step 3
    BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase JT Baker JT-7020-01 Step 5 and 8
    7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel  Bio-Rad Step 1
    Bio-Safe Coomassie Stain  Bio-Rad 161-0786 G-250, Step 1
    Silver Stain Kit for Mass Spectrometry Pierce 24600 Step 1
    Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) Supelco  47265
    Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) Supelco  47265
    Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip VWR 14673-010 Wash before use
    PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-13 Wash before use
    PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-16 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-13 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-15 Wash before use
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81265 volume 500 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81165 volume 250 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81065 volume 100 μl, needle size 22s G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 80965 volume 50 μl, needle size 22s G
    Hamilton Calibrated Syringes HAMILTON 80300 volume 10 μl, needle size 26s G
    Petri Dish Glass 100 mm x 15mm GSC INTERNATIONAL INC 1500-4 Wash before use, Step 1
    Bard-Parker Surgical Blades Fisher 371310 Step 1
    Reacti-Therm Heating/Stirring Module Pierce 18870 Step 1, 4 and 7
    Heating Blocks Fisher 125D Step 2
    Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm Aldrich CLS3950 Step 3
    Fused Silica CutterTubing cutter alltech 3194 Step 3
    Multi-tube vortexers  VWR 444-7063 Step 6
    Lyophilizer 25EL Freezemobile Virtis 25EL
    Centrifuge VWR Clinical 50
    LTQ Orbitrap Discovery Thermo Fisher Scientific

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3, (2), 97-130 (1993).
    2. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126, (5), 855-867 (2006).
    3. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, (7), 448-462 (2012).
    4. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
    5. Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280, (5), 3121-3124 (2005).
    6. Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3, (3), 280-286 (2004).
    7. Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203, (1), 173-179 (1992).
    8. Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224, (1), 451-455 (1995).
    9. Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6, (14), 3993-4015 (2006).
    10. Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17, (5), 925-931 (1996).
    11. Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250, (1), 82-101 (1997).
    12. Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71, (7), 1431-1440 (1999).
    13. Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283, (44), 30385-30400 (2008).
    14. Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423, (1), 119-128 (2012).
    15. Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74, (23), 6088-6097 (2002).
    16. Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15, (8), 791-804 (2005).
    17. Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6, (10), 2936-2946 (2006).
    18. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203, (1), 101-108 (1992).
    19. Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282, (12), 9127-9142 (2007).
    20. Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5, (4), 397-409 (1988).
    21. Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77, (19), 6250-6262 (2005).
    22. Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77, (19), 6271-6279 (2005).
    23. Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79, (10), 3830-3842 (2007).
    24. Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12, (1), 1-14 (2002).
    25. Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19, (10), 1136-1149 (2009).
    26. Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30, (2), 183-194 (2013).
    27. Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85, (18), 8692-8699 (2013).
    Förbättrade I-gel Reduktiva β-Eliminering för omfattande O-kopplade och sulfo-glycomics med masspektrometri
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T., Tiemeyer, M., Aoki, K. Improved In-gel Reductive β-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (93), e51840, doi:10.3791/51840 (2014).More

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T., Tiemeyer, M., Aoki, K. Improved In-gel Reductive β-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (93), e51840, doi:10.3791/51840 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter