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Chemistry

Mejora En-gel β-eliminación para ligada al O y exhaustiva sulfo-glycomics reductoras de Espectrometría de Masas

doi: 10.3791/51840 Published: November 20, 2014

Introduction

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La glicosilación es una modificación esencial de proteína después de la traducción, lo que contribuye a la fisiología del organismo, patología del tejido, y el reconocimiento celular 1-3. A pesar de los grandes avances en glicociencia analítica, la caracterización de la diversidad completa de glicanos en una proteína específica sigue siendo una tarea extremadamente difícil, sobre todo en las proteínas aisladas de fuentes biológicas primarias. No obstante, la microheterogeneidad de glicanos de glicoproteínas con frecuencia afecta a las interacciones funcionales con otras proteínas. Por lo tanto, la caracterización de la diversidad glicano es esencial para la comprensión de la importancia fisiológica de celular y tisular 4,5 glicosilación. A fin de comprender la contribución de glicosilación glicoproteína a la fisiología y la fisiopatología del tejido, robusto, sensible, y técnicas analíticas integrales glycomic han vuelto cada vez más importante. En el análisis proteómico, identificación de proteínas se obtienen generalmente por LC-MS/ MS análisis de péptidos trípticos 6. La digestión de proteínas puede llevarse a cabo usando una proteína o proteínas purificadas resueltas por SDS-PAGE después de la digestión en gel con proteasas tales como tripsina 7-9. Pre-enriquecimiento de la mezcla de proteínas por SDS-PAGE aumenta la profundidad y exactitud de ID de la proteína. El desarrollo de estrategias análogas para el análisis glycomic de glicosilación glicoproteína se encuentra a la vanguardia de la glicociencia.

Las dos clases principales de glicanos están unidos a cadenas principales de proteínas a través de cualquiera de ligamiento o N-O-vinculación. Glicanos ligados a N están unidos a asparagina (Asn) residuos que se encuentran como parte de un sequon definido como Asn-X-Ser / Thr / Cys (X es cualquier aminoácido excepto prolina), y puede ser liberado por digestión enzimática con péptido-N -glycanase (PNGasaF o A), ya sea en solución, en gel, o en-blot 10-12. Glicanos O-ligados están asociadas principalmente a serina (Ser) o treonina (Thr) residuos. Sin embargo, sólo una enzima ha sido identificado que es capaz de liberar glicanos O-ligados de glicoproteína y tiene una especificidad glicano extremadamente limitada, liberando sólo los glicanos O-ligados simples. Estrategias de las emisiones químicas siguen siendo el método de elección para la liberación integral de glicanos O-ligados de glicoproteínas. Β-eliminación reductora o no reductora, o hidrazinolisis son técnicas de liberación química bien caracterizados y son actualmente los métodos más comúnmente utilizados para la liberación de los glicanos O-vinculado glicoproteínas de 13,14. Aunque reductora β-eliminación se ha utilizado para liberar los glicanos O-ligados de glicoproteínas separadas por SDS-PAGE, los enfoques anteriores requieren separación por HPLC para el análisis posterior 15-17.

Análisis multidimensional MS (MS n) actualmente proporciona la fuente más rica de los datos estructurales para la caracterización de los glicanos liberados de glicoproteínas aisladas en las cantidades que se espera de la mayoría de fuentes biológicas. La profundidad de la EMcaracterización estructural basado ve facilitada en gran medida por permethylating los glicanos liberados antes de su análisis. Permetilación mejora la ionización y tiende a igualar las respuestas de señal molares través de una amplia gama de estructuras de glicano 18,19. Además, permetilación etiquetas inequívocamente restos de monosacáridos terminales y sustituidos con masas distintivos, mejorando así la elucidación estructural 20-23. Por ejemplo, los glicanos ácidos son generalmente difíciles de detectar como especies no permetilado por MS. Aunque glicanos ácidas se pueden detectar en modo de iones negativos por MS, es imposible detectar tanto glicanos ácidos y neutros en el mismo modo de iones. Una ventaja importante de permetilación glicano es que todos los grupos hidroxilo libres (OH) en sustituyentes de monosacáridos de un glicano se tapó con un grupo metilo (OCH 3 o OMe), por lo tanto los cargos de un sialilados glicano se neutralizan, por lo que como detectable como permetilado neutral (AsiaLO) glicanos. Sin embargo, los hidroxilos de restos de sulfato en sulfoglycans son resistentes a la permetilación, lo que resulta en la retención de carga aniónica, que suprime la ionización y disminuye la sensibilidad. Esta supresión actualmente impide el análisis glycomic integral de glicoproteínas muy complejas, como las mucinas, que llevan una gran abundancia de glicanos sulfatados 24-26.

Informes recientes sobre purificadores de glicanos sulfatados usado cargado, cromatografía de fase inversa para purificar y glicanos permetilados separadas antes del análisis MALDI. Este método se basa en la separación completa de glicanos sulfatados y no sulfatados utilizando diferentes fases móviles para la elución, lo que hemos encontrado para ser menos estrictas que el particionamiento fase orgánica. Por lo tanto, las nuevas técnicas adecuadas para la detección y el enriquecimiento de sulfoglycans se presentan aquí. Estas técnicas permiten la recuperación cuantitativa de glicanos sulfatados en la fase acuosa de agua siguiente: DCM (diclorometano)extracción, que se realiza rutinariamente en el extremo de reacciones permetilación de glicano 27. Es importante destacar que esta robusta separación de sulfoglycans permetilados de una mezcla de glicanos sulfatados no permetilados enriquece concomitantemente para especies cargadas al mismo tiempo simplificar MS 2 patrones de fragmentación. También se presenta un protocolo integral para mejorar el análisis de glicanos O-ligados en gel. El protocolo de recuperación mejorada aumenta el glicano, aumenta la información estructural puede obtenerse a través de MS n análisis de glicanos permetilados, y mejora la sensibilidad del análisis sulfoglycomic aplicadas a glicoproteínas esenciales aislados de fuentes biológicas.

Este protocolo está diseñado para O-glicano ligado análisis de extractos de glicoproteína enteros o de una glicoproteína específica de interés resueltas por SDS-PAGE y se compone de tres procedimientos experimentales; A) gel de limpieza, B) en gel reductora β-eliminación y C) permethy glicanolación. El objetivo es obtener datos glycomic integrales O-ligados para glicoproteínas cosechadas a partir de fuentes primarias de interés biológico (Figura 1). Las glicoproteínas separadas por SDS-PAGE se visualizaron por tinción y bandas de interés se escindieron y la banda de gel resultante se corta en trozos pequeños. Las piezas de gel se destiñeron y se sometieron a lavados de acetato de etilo para eliminar los contaminantes de gel (Figura 2a). La liberación de glucanos se consigue mediante in-gel reductora β-eliminación (Figura 2B) y los glicanos liberados se permetiló. Acuoso-orgánico de extracción siguiente permetilación particiones cuantitativamente los glicanos aniónicos sulfatados lejos de glicanos neutros no sulfatados (Figura 2C). En-gel reductora β-eliminación acoplado a extracción acuosa-orgánica permite la caracterización de glicanos O-ligados y sulfoglycans liberados de pequeñas cantidades de glicoproteína separados por SDS-PAGE. La visión estratégica es summariZed en la Figura 1 y los detalles se muestran en la Figura 2. Además, una parte de las piezas de gel se lavaron destained y se puede utilizar para ID de proteínas mediante técnicas proteómicas estándar LC-MS / MS.

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Protocol

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NOTA: Las preocupaciones de seguridad de laboratorio

En consonancia con las mejores prácticas de laboratorio estándar, observar lo siguiente. Guarde todos los disolventes orgánicos en lugares apropiados. Mantenga todos los materiales de desecho en contenedores de residuos químicos con un etiquetado claro de composiciones químicas. Como varios reactivos utilizados en estos protocolos son carcinógenos potenciales o generar gases combustibles volátiles, manejar todos los reactivos en una campana de humos con ventilación. Use el equipo de protección personal como guantes, bata de laboratorio y protección para los ojos cuando se trabaja con disolventes orgánicos.

Figura 1
Figura 1. Procedimiento para la en-gel juntas glycomics. (A) Las proteínas de interés se resuelven por SDS-PAGE, detectado por los procedimientos de tinción apropiados (Coomassie o plata), y extirpados. Piezas de gel extirpados se cortan en rodajasen cubos pequeños, se destiñó, y se lavó con acetato de etilo para reducir los contaminantes que interfieren con el análisis MS subsiguiente. Una porción de la porción de gel puede ser reservado para in-gel digestión tríptica y la posterior caracterización proteómica por LC-MS / MS. (B) glicanos O-ligados se liberan de las glicoproteínas resueltos por en-gel reductivo β-eliminación. Pasos esenciales incluyen la desalinización y eliminación de borato por azeótropo con metanol. (C) glicanos liberados por β-eliminación reductora unida a O se permetilado y posteriormente dividido en fases acuosa y orgánica. Sulfoglycans se recuperan cuantitativamente en la fase superior (acuosa), mientras que los glicanos neutros y sialiladas partición en la (DCM) capa inferior.

Figura 2
Figura 2. Detalle de diagrama de flujo para glycomics en gel. Cada experimentalmenteTal paso se muestra en la Figura 1 se ilustra de forma individual. (A) destaining gel y extracción de EtOAc, (B) dirigir en gel reductivo β-eliminación de la liberación de glicanos O-ligados, y (C) permetilación y fase de partición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

Gel 1. La escisión y eliminación de contaminantes derivados de Gel

  1. Antes de iniciar el procedimiento, preparar los productos químicos y reactivos en la Lista de Materiales.
  2. Resolver la proteína en gel de SDS-PAGE utilizando sistemas de tampón Tris-glicina estándar. Manchas resuelto proteínas, ya sea con azul brillante de Coomassie o plata a las manchas. En general, la recuperación de los glicanos O-ligados de geles teñidos con plata es de aproximadamente el 80-90% de la recuperación alcanzado teñido con Coomassie de geles.
  3. Después de la electroforesis, colocar el gel en una placa de vidrio y especial tél región de interés con un bisturí limpio o cuchilla de afeitar.
  4. Para aumentar el rendimiento de O-glicanos, transferir la banda de gel de interés sobre otra placa de vidrio y cortar la pieza de gel extirpado en cubos de aproximadamente 2 mm. Evite hacer piezas de gel de menos de 1 mm cubos porque la recuperación de glicanos se reduce. Transfiera las pequeñas piezas de gel en un tubo de vidrio con tapa de rosca (13 x 100 mm) con un microespátula acero inoxidable.
  5. Añadir 1 ml de bicarbonato de amonio 25 mM (Ambic, NH 4 HCO 3) en el tubo de la muestra, la tapa del tubo de vidrio con una tapa superior del tornillo revestido de teflón, y mezcle suavemente con un movimiento rápido del tubo antes de dejar reposar durante 10 minutos. No emplear agitación vigorosa para evitar la rasgadura de las piezas de gel.
  6. Retire con cuidado Ambic desde el tubo de vidrio utilizando una pipeta de vidrio o una pipeta Pasteur equipado con una punta de plástico extra-largo. Evite aplastar y transferir las pequeñas piezas de gel mientras se quita la solución Ambic.
  7. Añadir 1 ml de acetonitrilo (ACN) a latubo de vidrio, tapa, y mezcle suavemente con un movimiento rápido de tubo antes de dejar reposar durante 10 min. Asegúrese de que las piezas de gel están completamente cubiertos con disolvente. Si es necesario, empuje piezas de gel fuera de la pared del tubo y en solvente con punta de la pipeta.
  8. Pipeta de ACN desde el tubo de vidrio y repita los pasos 1.5 a 1.7 hasta que el color azul brillante es eliminado. Repetir un mínimo de cinco lavados secuenciales Ambic / ACN, si es necesario. Para geles teñidos con plata, utilizar un kit destain. Proceda al siguiente paso cuando la pieza se convierte en gel, mientras que de manera uniforme blanco en ACN.
  9. Pipetear con agua cualquier líquido del tubo de vidrio, vuelva a tapar el tubo, añadir 1 ml de Ambic y dejar reposar durante 5 minutos.
  10. Retire Ambic y añadir 2 ml de acetato de etilo (EtOAc) para el tubo de vidrio. Recapitulación con tubo de teflón alineados tapa y lugar a 4 ° C durante la noche con agitación de extremo a extremo o, alternativamente, realizar tres lavados de EtOAc a temperatura ambiente durante 30 min cada uno. Cuanto más tiempo el lavado EtOAc, más eficiente la eliminación de contaminantes.
  11. Quitarla final EtOAc lavar y realizar tres lavados cada uno con 2 ml de H 2 O. La eliminación completa de EtOAc se asegurará de una reacción de β-eliminación reductora robusto.
  12. Pipetear off H 2 O y deshidratar el gel por lavado una vez con 1 ml de ACN.
    NOTA: Después del secado, los geles están listos para deshidratados en gel β-eliminación. Piezas de gel deshidratados se pueden almacenar a -20 ° C hasta su uso.
  13. Detener el proceso de lavado en cualquier paso y almacenar las piezas de gel a 4 ° C durante la noche, independientemente de qué tampón o solución se aplica a la gel (Ambic, ACN, H 2 O). Reinicie la preparación de muestras en cualquier momento dentro de los próximos 2 días.
  14. Use una parte de las piezas de gel destained y deshidratados para Identificación de proteínas mediante enfoques proteómicos estándar.

2. En-gel Release-O glicanos por β-eliminación reductiva

  1. Preparar una solución madre de 1 M de hidróxido de sodio (NaOH) utilizando 50% de NaOH o sólido tienda de NaOH y a 4 ° C hasta su uso. Tomar 5,2 ml de NaOH al 50% (o 4 g de NaOH sólido) y ajustar el volumen a 100 ml para hacer 1 M solución de NaOH. Diluir la solución madre 1 M NaOH a 100 mM NaOH, que se puede almacenar a 4 ° C hasta 6 meses sin pérdida de eficiencia en las reacciones de β-eliminación reductora.
  • Hacer 2 M borohidruro de sodio (NaBH4) en NaOH 100 mM. Disolver 38 mg de NaBH4 en 0,5 ml de NaOH 100 mM. Generalmente, se utiliza 0,5-1,0 ml de la solución de borohidruro para cada muestra. Variar el volumen de la solución de reacción de la cantidad de piezas de gel secos preparados en la etapa 1. espera utilizar 0,5 ml de solución de borohidruro de 1-2 piezas de gel extirpados (paso 1.3).
  • Añadir 500 l de NaOH 100 mM a las piezas de gel deshidratados y dejar reposar durante 3-5 min en hielo con el fin de equilibrar el gel a las condiciones básicas que mejoran la recuperación de glicano.
  • Añadir 500 l de 2 M NaBH4 en NaOH 100 mM, resultando en concentraciones finales de 1 M NaBH
  • Durante la primera hora de incubación, mezclar suavemente el tubo cada 15 min. Evitar fuerte agitación, ya que puede fragmentar las piezas de gel. Realizar la reacción en una incubadora / horno bien equilibrada, o en un bloque de calentamiento. Asegúrese de que las piezas de gel se cubren con solución de reacción.
  • Detener la reacción mediante la eliminación del tubo de muestra de la incubadora o bloque de calentamiento y colocándola en hielo.
    NOTA: Después de permitir que la reacción de β-eliminación de proceder durante 18 horas, el proceso de desalación debe ser realizado en el mismo día.
  • 3. La desalación en Cromatografía de intercambio catiónico

    1. Mientras se mantiene el tubo de muestra en hielo para evitar la formación de calor excesivo, añadir lentamente 10% de ácido acético (AcOH) gota a gota para neutralizar la base. Vórtice suavemente el tubo de la muestra entre las adiciones de AcOH. Tenga cuidado al añadir ácido lentamente y gota a gota como el additien de ácido producirá un "volcán" de burbujas. Centrifugar el tubo para eliminar las burbujas y evitar desbordamiento, si es necesario.
      1. Con el fin de eliminar la gran cantidad de sodio en la mezcla de reacción, pasar la mezcla de reacción a través de una columna de intercambio catiónico pequeña (o resina Dowex AG-50W-X8, forma H +).
      2. Lavar la resina de intercambio de cationes con 1 M de NaOH y HCl 1 M antes de su uso con el fin de eliminar los contaminantes que interfieren con el análisis MS, incluso si la resina es de grado analítico.
      3. Remoje la resina en NaOH 1 M y eliminar la solución por decantación. Añadir ionizada des agua, eliminar el agua, luego añadir HCl 1 M.
    2. Repita estos pasos hasta que la solución por encima de la resina es incoloro. Lavar la resina limpiado con agua destilada y almacenar en un 5% AcOH a 4 ° C.
    3. Para hacer un pequeño vaso columna, cero y romper la punta de una pipeta de vidrio Pasteur utilizando un cortador de cerámica de manera que el cono de la punta de la pipeta es de aproximadamente 1 cm de largo. Desmenuzar un tapón de lana de vidrio y empujar hacia la punta que forma un soporte para el lecho de resina. Asegure la columna de la pipeta con una abrazadera o pinza de la ropa y el lugar en un tubo de ensayo de vidrio.
    4. Lavar la pipeta de vacío con 1 ml de metanol (MeOH) y 3 ml de 5% de AcOH. Swirl H + Dowex AG50 o de intercambio catiónico suspensión de resina almacenan en 5% de AcOH y transferir suficiente de la suspensión para producir un volumen de lecho de 1 ml en la columna de la pipeta Pasteur.
    5. Enjuague la columna usando cinco volúmenes de 5% AcOH. Compruebe el flujo a través de la aparición de partículas de resina y no utilice la columna si se detecta resina.
    6. Coloque la columna en un nuevo tubo de vidrio con tapa de rosca (16 x 125 mm) y la muestra de carga. Recoger el flujo a través de glicanos y eluir con al menos 3 volúmenes de 5% de AcOH en el mismo tubo.
    7. Cubra el tubo con Parafilm y hacer pequeños agujeros con una aguja. Colocar el tubo de la muestra a -80 ° C o en hielo seco. Una vez congelado, secar la muestra por liofilización. Guarde el material seco a -20 °C hasta su uso.

    4. La eliminación de borato

    1. Preparar 10% de AcOH en MeOH. Tomar 10 ml de ácido acético glacial y ajustar el volumen a 100 ml con metanol. Guarde este reactivo en un frasco de vidrio con tapa de teflón forrado para un máximo de 6 meses.
    2. Añadir 300 l de AcOH al 10% en MeOH al, tubo de muestra liofilizada se secó y se vórtice. Retire el borato de trimetilo resultante por evaporación bajo una corriente de N 2.
      NOTA: La mezcla de sales de borato con metanol bajo condiciones ácidas produce borato de trimetilo que es un compuesto volátil.
    3. Seco en N2 corriente a 37 ° C. Después del secado, añadir otra alícuota de AcOH en MeOH como se describe en el paso 4.2. Seque el líquido durante 5 min en atmósfera de nitrógeno (N 2) flujo a 37 ° C.
      1. Repita la resuspensión y secado al menos 3 veces. Almacenar el material seco a -20 ° C hasta su uso.

    5. C18 Limpieza

    1. Equilibrar una columna de cartucho C18(Tamaño de 1 ml, 100 mg de resina) con tres volúmenes de ACN y cinco volúmenes de 5% AcOH. Acelerar el paso de las soluciones equilibrantes por aplicación de presión positiva de aire suave.
    2. Añadir 500 l de 5% de AcOH al tubo de muestra desalada y borato libre y disolver por vórtice.
    3. Cargar muestra resuspendida en la columna C18 equilibrada y recoger el flujo a través de en un tubo de tapón de rosca de vidrio (13 x 100 mm). Eluir O-glicanos con 3 ml de 5% de AcOH en el mismo tubo.
    4. Parafilm el tubo, hacer pequeños agujeros con una aguja pequeña o utilice la tapa de PTFE forrado débilmente cerrado para cubrir el tubo, y congelar la muestra a -80 ° C o en hielo seco. Eliminar el disolvente por liofilización. Almacenar la muestra desecada a -20 ° C hasta su uso.

    6. Preparación de la base para permetilación

    NOTA: Con el fin de lograr robusta permetilación, preparar NaOH fresco lodo. Toda la cristalería utilizado para las reacciones permetilación debe limpiarse exhaustivamente.

    1. Para preparar el reactivo de base para permetilación, añadir 400 l de NaOH al 50% a un tubo con tapa de rosca de vidrio limpio (13 x 100 mm). Añadir 800 l de MeOH anhidro y vórtice.
    2. Añadir 4 ml de sulfóxido de dimetilo anhidro (DMSO) y agitar en vórtex para generar un precipitado blanco.
    3. Centrifugar a 600 xg durante 1 min para sedimentar el precipitado. Pipetear el sobrenadante y desechar. Añadir un adicional de 4 ml de DMSO anhidro al sedimento. Vortex.
    4. Repita el paso 6.2 y 6.3 con un mínimo de tres veces más o hasta que no se forma un precipitado blanco.
    5. Disolver la base granulado en 3 ml de DMSO anhidro y mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo con una pipeta Pasteur limpia.
    6. Utilice la base inmediatamente para la siguiente reacción permetilación ya que no se puede almacenar.

    7. permetilación de glucanos liberados

    1. Añadir 200 l de DMSO anhidro a la muestra purificada-C18 y de vórtice o sonicado para volver a suspender.
    2. Añadir 300 l de la resuspcomposición lodo de base a la muestra y añadir inmediatamente 100 l de yodometano (MEI). Selle el tubo con tapón de teflón forrado y mezclar vigorosamente durante 5 min en vórtice.
    3. Para detener la reacción permetilación, añadir 2 ml de 5% de AcOH en hielo y vórtice. Pipeta solución arriba y abajo 5 veces para reducir el volumen restante de Mel por evaporación.
      NOTA: El AcOH neutraliza la solución y la eliminación de MeI aumenta la eficiencia de la extracción de glicanos sulfatados en la fase acuosa durante la fase de partición.
    4. Añadir 2 ml de diclorometano (DCM) y agitar. Centrifugar a 600 xg durante 1 min a temperatura ambiente para separar las fases acuosa y orgánica.
    5. Transferir la capa superior (fase acuosa que contiene la mayoría de los glicanos sulfatados permetilados) en un nuevo tubo de vidrio (13 x 100 mm).
    6. Añadir 2 ml de H 2 O a la fase orgánica y vórtice. Se centrifuga a 600 × g durante 1 min para separar las fases acuosa y orgánica y combinar esta segunda fase acuosa con el abetofase acuosa st (paso 7.5).
    7. Repita el paso 7.6 y 7.5 más de tres veces, pero no hay necesidad de ahorrar las fases acuosas resultantes de las particiones posteriores.
    8. Eliminar la capa final superior (fase acuosa) tanto como sea posible de la capa inferior (fase orgánica) y transferir la capa inferior (fase orgánica) en un tubo de vidrio limpio nuevo separada usando una pipeta Pasteur.
    9. Se seca la fase orgánica bajo N2 corriente a 42 ° C.
    10. Cubra el tubo con Parafilm y se almacena a -20 ° C hasta su uso.

    8. C18 Clean-up de permetilados sulfatado O-glicanos de la fase acuosa

    1. Equilibrar una columna de cartucho C18 con tres volúmenes de ACN y cinco volúmenes de 5% de AcOH.
    2. Cargar las fases acuosas recogidas y combinado de los pasos 7.5 y 7.6 en la columna.
    3. Lavar la columna con 10 ml de H 2 O para la desalación.
    4. Eluir el permetilado sulfatado O-glicanos en un nuevo tubo de vidrio con 2 mlde 50% de ACN. Utilice una elución adicional con un 85% de ACN para mejorar la recuperación de permetilado sulfatados O-glicanos en oligosacáridos más grandes.
    5. Eluidos seco bajo corriente de nitrógeno a 42 ° C.
    6. Guarde el material seco a -20 ° C hasta 6 meses antes de su análisis MS.

    9. La espectrometría de masa de permetilado O-glicanos

    1. Analizar permetilados O-glicanos por infusión directa en un espectrómetro de masas apropiado usando una fuente de nanoelectropulverización a un caudal de jeringuilla de 0,40-0,60 l / min a 210 ° C de temperatura capilar. Para la fragmentación por CID en MS / MS y MS n de una trampa de iones instrumento, aplique un 30-40% de la energía de colisión.
    2. Para el modo de ion negativo, reconstituir permetilado sulfatado O-glicanos en 50 l de metanol / 2-propanol / 1-propanol / 13 mM de acetato de amonio acuoso (16: 3: 3: 2 en volumen). Para el modo de iones positivos, reconstituir permetilado / O-glicanos sialiladas neutros en 50 l de sodio 1 mM hidroeléctricaXide en metanol / agua (1: 1).
    3. Use el mapeo total de iones (TIM) y tomografía pérdida neutra (exploración NL) funcionalidad de la versión del paquete de software Xcalibur 2.0 para el análisis de MSN a caracterizar estructuras-O glicanos individuales 13,19.

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    Representative Results

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    Efecto de Etil Acetato de Tratamiento Antes del En-gel reductora β-eliminación

    Un espectro de masas representativo de muestras permetilados glicanos O-ligados liberados de mucina bovina utilizando en gel reductora β-eliminación se muestra en la Figura 3. El lavado EtOAc de las piezas de gel SDS y elimina de forma efectiva poliacrílicos contaminantes que interfieren con el posterior análisis MS 27.

    Figura 3
    Figura 3. Acetato de etilo lavado de pieza de gel de poliacrilamida antes de la en-gel reductivo β-eliminación mejora la detección de glicanos liberados. (A) Sin lavado con acetato de etilo, el espectro de masas de glicanos O-ligados permetilados liberados por in-gel de β-eliminación de mucina submaxilar bovina está dominada por una gran cantidad de un co polidispersantaminant, que oscurece casi por completo las señales MS asociados con glicanos O-ligados. (B) Lavado de la pieza de gel con acetato de etilo elimina los picos de contaminantes, lo que permite la detección sensible de glicanos. Modificado de Kumagai 25.

    Recuperación de O-ligado Glycan es mayor de gel pequeñas rebanadas

    Glicanos O-ligados se liberaron de mucina submaxilar bovina por in-gel reductora β-eliminación utilizando piezas de gel que fueron ya sea en rodajas pequeño (~ 2 x 2 mm) o grande (~ 5 x 5 mm). Piezas de gel menor que ~ 2 x 2 mm no se recuperaron de manera eficiente a través de las etapas de lavado. Tras permetilación, una cantidad conocida de un estándar externo glicano permetilado (maltotri- y maltotetrasaccharide, DP3 y DP4) se añadió a cada uno para facilitar la cuantificación de la recuperación de glicano 27. La recuperación de los glicanos O-ligados de pequeñas piezas de gel era casi 10 veces mayor que a partir de grandes cortes de gel (La Figura 4).

    Figura 4
    Figura 4. Recuperación de glicanos de pequeñas piezas de gel es más eficiente que a partir de piezas más grandes. Pequeñas piezas (~ 2 x 2 mm) produjo más de glicano que los cubos grandes (~ 5 x 5 mm). Las barras muestran intensidades de señal relativas de la suma de todas las estructuras de glicano O-ligado se normalizaron a la señal detectada para un estándar externo (maltotrisaccharide DP3, ajustado a 100%), que se añadió a la glicano liberado antes del análisis MS. Los valores son la desviación estándar media para n = 3. Modificado de Kumagai K 25.

    Enriquecimiento de Sulfoglycans por Fase partición

    A permetilado sulfatado estándar glicano (sulfo-Le a) se recuperó por completo en la fase acuosa. Glicanos sialiladas permetilado liberados de XXe glicoproteína mucina divide en la fase de DCM (Figura 5). La recuperación de cada uno de los glicanos permetilados por partición acuosa-orgánica fue comparable a la del C18 Sep-Pak limpieza método caracterizado previamente 27. La eficiencia y la simplicidad del método de partición de fase facilita en gran medida el rendimiento de la muestra y enfoques analíticos posteriores.

    Figura 5
    Figura 5. recuperación diferencial de sulfo y sialo-glicanos por partición de fase. Bovina glicoproteína mucina, se añadieron con una cantidad conocida de un estándar sulfo-glicano (sulfo-Le a) antes de ser sometido a reductiva β-eliminación. Glicanos liberados fueron permetilados y la reacción permetilación se ajustó a 1: 1: agua: DCM. Las fases orgánica y acuosa resultantes se separaron y se analizaron mediante MS. Recuperación de glicano se cuantificó relativa a las normas de glicanos externos permetilados, que fueron inoculadas en la muestra antes del análisis MS. Recuperaciones de glicano en la orgánica (DCM) y acuosa (agua) fases se muestran en relación con el estándar externo, el cual fue ajustado a 100%. Sulfoglycans fueron indetectables en la fase orgánica pero cuantitativamente recuperados en la fase acuosa. Los resultados representan la media ± SE de tres experimentos independientes. Modificado de Kumagai 25.

    Aplicación a en profundidad Proteómica y Glycomic análisis en muestras biológicas

    Proteínas de la saliva humanos se separaron por SDS-PAGE y se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie (G-250). Una proteína de alto peso molecular en MW ~ 600 kDa se escindió del gel y una porción de la pieza de gel se sometió a digestión en gel con tripsina y LC-MS / análisis proteómico basado en MS, que identificó esta banda como MUC5B 16,24 . El resto de la pieza de gel se sometió a redu-en gel ctive β-eliminación para el análisis de glicanos O-27. Tras permetilación y partición de fase acuosa-orgánica (agua: DCM, 1: 1), permetilados glicanos en las fases acuosa y orgánica fueron analizados por NSI-MS. No sulfatado permetiló O-glicanos fueron recuperados de la fase orgánica y todos los sulfoglycans permetilados se recuperaron de la fase acuosa, lo que facilita la identificación y caracterización de sulfatado casi isobárica y glicanos no sulfatados, por ejemplo, Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 GalNAc-ol (m / z = 1606.8, [M + Na] +) y (SO3) 1 1 NeuAc Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1 GalNAc-ol (m / z = 1606.7, [M + 2Na-H] +) diferir en sólo 0,1 unidades de masa y sería difícil de resolver sin separar físicamente las dos especies por partición de fase (Figura 6).

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    Figura 6. Detección de complejidad isobárica en punto muerto y sulfo-glicanos separados por partición acuosa-orgánica. MS 2 patrones de fragmentación obtenidos de iones de padres detectados por el análisis total de O-glicanos permetilados liberados de saliva humana mucina por en-gel de β-eliminación y el agua mapeo de iones (TIM): partición DCM siguiente permetilación. (A) a partir del análisis MS 2 TIM de la fase de DCM para una ventana de 2,8 unidad de masa alrededor de m / z = 1608. (B) El espectro de MS 2 de la misma ventana de masas para el análisis de TIM de la fase de agua. En la fase de DCM, los principales iones de fragmentos corresponden a la pérdida de Hex 1 -O (m / z 1370,8), Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 + Na (1331,8), pérdida de Fuc 1 Hex 1 -O (1196,7), pérdida de Hex 1 HexNAc 1 (1.143,6), pérdida de Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 (969.5), la pérdidade Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1 -O (747,4), Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 + Na (660.4), y Hex 1 HexNAc 1 + Na (486,3). Sobre la base de estos iones de fragmentos, se propone una mezcla de estructuras no sulfatados con una composición de Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 GalNAc-ol como se muestra a la derecha del espectro. En contraste, los principales iones de fragmentos para la fase de agua son la pérdida de SO 3 Na (1486,8), pérdida de NeuAc (1231,5), pérdida de Fuc 1 Hex 1 -O (1196,7), pérdida de combinación de NeuAc y SO 3 Na ( 1111,8), y la pérdida de NeuAc 1 Hex 1 -O (1.009,4). Una mezcla de estructuras sulfatados con una composición de (SO 3 -) se propone 1 NeuAc 1 Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1 GalNAc-ol. Sin una separación física de la neutral y sulfoglycans por partición de fase, la interpretación de los espectros de MS 2 de tales mezclas es significativamente más challenging. Modificado de Kumagai 25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Water, deionized water Sigma-Aldrich  270733-4L CHROMASOLV, for HPLC
    Acetic acid, Glacial Fisher A38-500 Certified ACS ≥99.7% w/w
    Methanol Sigma-Aldrich  34860-4L-R CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9%
    Ammonium bicarbonate Fluka 09830-500G BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1
    Acetonitrile Sigma-Aldrich  34998-4L CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1
    Ethyl acetate Fluka 34972-1L-R LC-MS CHROMASOLV, Step 1
    Sodium borohydride Aldrich 213462-25G ReagentPlus, 99%, Step 2
    Iodomethane Sigma-Aldrich  289566-100G ReagentPlus, 99.5%,  Step 6.  Store at 4 °C until use.  Sit at room temperature before use.
    Sodium hydroxide solution, 50% w/w Fisher SS254-1 Certified, Step 6
    Dimethyl sulfoxide, anhydrous Sigma-Aldrich  276855-1L Anhydrous, ≥99.9%, Step 6
    Methanol, anhydrous Sigma-Aldrich  322415-100ML Anhydrous, 99.8%, Step 6
    Dichloromethane Sigma-Aldrich  34856-4L CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7
    Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh Sigma-Aldrich  217506-500G Step 3
    AG 50W-X8 Resin  Bio-Rad 142-1441 Step 3
    BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase JT Baker JT-7020-01 Step 5 and 8
    7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel  Bio-Rad Step 1
    Bio-Safe Coomassie Stain  Bio-Rad 161-0786 G-250, Step 1
    Silver Stain Kit for Mass Spectrometry Pierce 24600 Step 1
    Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) Supelco  47265
    Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) Supelco  47265
    Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip VWR 14673-010 Wash before use
    PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-13 Wash before use
    PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-16 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-13 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-15 Wash before use
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81265 volume 500 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81165 volume 250 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81065 volume 100 μl, needle size 22s G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 80965 volume 50 μl, needle size 22s G
    Hamilton Calibrated Syringes HAMILTON 80300 volume 10 μl, needle size 26s G
    Petri Dish Glass 100 mm x 15mm GSC INTERNATIONAL INC 1500-4 Wash before use, Step 1
    Bard-Parker Surgical Blades Fisher 371310 Step 1
    Reacti-Therm Heating/Stirring Module Pierce 18870 Step 1, 4 and 7
    Heating Blocks Fisher 125D Step 2
    Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm Aldrich CLS3950 Step 3
    Fused Silica CutterTubing cutter alltech 3194 Step 3
    Multi-tube vortexers  VWR 444-7063 Step 6
    Lyophilizer 25EL Freezemobile Virtis 25EL
    Centrifuge VWR Clinical 50
    LTQ Orbitrap Discovery Thermo Fisher Scientific

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    References

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    Mejora En-gel β-eliminación para ligada al O y exhaustiva sulfo-glycomics reductoras de Espectrometría de Masas
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    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T., Tiemeyer, M., Aoki, K. Improved In-gel Reductive β-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (93), e51840, doi:10.3791/51840 (2014).More

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T., Tiemeyer, M., Aoki, K. Improved In-gel Reductive β-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (93), e51840, doi:10.3791/51840 (2014).

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