Sondering High-density funktionelt protein Microarrays at Detect protein-protein interaktioner
Summary
Anvendelse af protein microarrays indeholder næsten hele S. cerevisiae proteom probes til hurtig unbiased forhør af tusindvis af protein-protein interaktioner i parallel. Denne metode kan anvendes til protein-lille molekyle, posttranslationel modifikation og andre assays i high-throughput.
Abstract
High-density funktionelt protein mikroarrays indeholdende ~ 4.200 rekombinante gærproteiner undersøges for kinase protein-protein interaktioner under anvendelse af et affinitetsoprenset gær kinase fusionsprotein indeholdende en V5-epitopmærke til udlæsning. Oprenset kinase opnås ved dyrkning af en gærstamme optimeret for høj kopi proteinproduktion huser et plasmid indeholdende en kinase-V5 fusionskonstruktion under en GAL promotor. Gæren dyrkes i restriktiv medier med en neutral carbonkilde i 6 timer efterfulgt af induktion med 2% galactose. Dernæst høstes kulturen og kinase oprenses ved anvendelse af standard affinitet kromatografiske teknikker til opnåelse af et højt oprensede protein kinase til anvendelse i assayet. Det oprensede kinase fortyndes med kinase buffer til et passende område for assayet og proteinet mikroarrays blokeres før hybridisering med proteinet microarray. Efter hybridisering arrays probet med monoklonalt V5 ANTIBody at identificere proteiner bundet af kinase-V5-protein. Endelig er arrays scannet ved hjælp af en standard microarray scanner, og data hentes for downstream informatik analyse 1,2 for at bestemme en høj tillid sæt protein interaktioner for downstream validering in vivo.
Introduction
Behovet for at udføre globale analyser af protein biokemi og bindende aktivitet in vivo har resulteret i udvikling af nye metoder til profilering af protein-protein interaktioner (PPI) og de post-translationelle modifikationer af hele proteomer 1,3-8. Protein microarrays fremstilles som funktionelle protein microarrays anvender fuld længde funktionelle proteiner 4-6,8,9 eller analytiske protein mikroarrays indeholdende antistoffer 10,11. De er manipuleret til at indeholde en høj densitet af proteiner opstillede på objektglas med en række overfladekemier at lette en række eksperimentelle betingelser, der kræves for udførelse vidtrækkende biokemiske analyser 12. Nitrocellulose og aldehyd overfladekemier til kemisk binding gennem lysin eller affinitet vedhæftede metoder såsom nikkel chelaterede slides til fastgørelse His-mærkede proteiner og glutathion for affinitet fastgørelse blandt andre 13. </p>
Anvendelsen af funktionelt protein microarrays til påvisning af protein-protein-interaktioner kræver adgang til en høj kvalitet funktionelt protein bibliotek 14. S. cerevisiae er modtagelig for at producere et sådant bibliotek gennem parring af høj-kopi affinitetsmærkede proteinkonstruktioner med højt gennemløb kromatografiske oprensningsteknikker. Langt størstedelen af gærgenomet er blevet sekventeret og næsten hele proteom kan udtrykkes fra en høj-kopi plasmid til oprensning og biokemiske analyser 12. Når proteinerne opnås og grupperet i 384-brønds format, bliver de trykt på et mikroskopobjektglas muliggør hurtig parallel multi-parametrisk biokemisk analyse og bioinformatik forhør 8,14-16. Protein microarrays er blevet anvendt til enzymatiske assays og interaktioner med proteiner, lipider, små molekyler og nukleinsyrer blandt mange andre applikationer. Tilgængeligheden af proteiner på overfladen af proteomarrays gør dem modtagelige for forskellige typer af analytisk påvisning, herunder, immun-affinitet, overfladeplasmonresonans, fluorescens og mange andre teknikker. Desuden muliggør fin styring af den eksperimentelle tilstand, hvor det kan være svært at gøre in vivo.
Formålet med denne protokol er at demonstrere hensigtsmæssig brug af funktionelle protein microarrays til at opdage protein-protein interaktioner. Denne applikation giver højt gennemløb parallel biokemisk analyse af proteinbindende aktiviteter, der benytter en højt oprenset analyt (protein) af interesse. En C-terminal (carboxy-terminal) mærket V5-fusionsprotein bait protein af interesse er fremstillet af en høj-kopi plasmid i en gærstamme optimeret til proteinoprensning. C-terminale tagging sikrer at hele længde proteinet er blevet oversat. Proteinet anvendt i denne undersøgelse er Tda1-V5 fusionsprotein kinase, der oprenses ved anvendelse af nikkel affinitet harpiks via en His6X tag. Den Tda1-V5 fusion konstrukt oprenses via seriel eluering under anvendelse af en imidazol-gradient til eluering af de højt beriget fraktion til anvendelse i assayet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen præsenterede blev oprindeligt udført under anvendelse af 85 unikke gær protein kinase-V5 fusionsproteiner at sammenligne bindingsaktivitet tværs særskilte og beslægtede familier af gær proteinkinaser resulterer i identifikationen af nye kinase interaktionsnetværk in vivo 1. Som en spirende proteomisk profilering teknologi, udvikling af High Throughput (HTP) screening af proteomer anvender protein microarrays påberåbte peptid biblioteker og eukaryote og prokaryote modelorganismer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the NIH. The assays shown in Figure 1 was performed by Dr. Joseph Fasolo. We thank Dr. Rui Chen for helpful comments.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 mL) | |||
| Falcon tube (50 mL) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes(2ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1 X PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1 X PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl,500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | galactose should not be autoclaved |
References
- Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
- Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110 (2006).
- Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
- Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
- Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
- Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays–an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
- Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
- Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
- Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
- Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
- Im, H., Snyder, M., Coligan, J. E., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. 27, Unit 27 24 (2013).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
