タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング
Summary
ほぼ全Sを含むタンパク質マイクロアレイを用いて、 セレビシエプロテオームは、並行して、タンパク質-タンパク質相互作用の何千もの迅速公正な尋問のためにプローブされます。この方法は、タンパク質 – 小分子、翻訳後修飾、およびハイスループットの他のアッセイに利用することができます。
Abstract
〜4,200組換え酵母タンパク質を含む高密度機能タンパク質マイクロアレイは、読み出しのためのV5エピトープタグを含むアフィニティー精製酵母キナーゼ融合タンパク質を用いてキナーゼタンパク質 – タンパク質相互作用のために検査されます。精製されたキナーゼは、GAL、誘導性プロモーター下キナーゼ-V5融合構築物を含むプラスミドを有する高コピータンパク質産生のために最適化された酵母株の培養により得られます。酵母は2％ガラクトースで誘導し、続いて6時間、中性の炭素源と制限された培地中で成長させます。次に、培養物を回収し、キナーゼアッセイにおける使用のための高度に精製されたタンパク質キナーゼを得るために、標準的なアフィニティークロマトグラフィー技術を用いて精製します。精製されたキナーゼアッセイのために適切な範囲のキナーゼ緩衝液で希釈し、タンパク質マイクロアレイは、タンパク質マイクロアレイにハイブリダイゼーションの前にブロックされます。ハイブリダイゼーション後、アレイをモノクローナルV5 antibでプローブしますキナーゼV5タンパク質によって結合したタンパク質を同定するODY。最後に、アレイは、標準的なマイクロアレイスキャナーを用いてスキャンされ、データは、インビボでの下流の検証のためのタンパク質の相互作用の高い信頼度のセットを決定するために、下流インフォマティクス分析1,2のために抽出されます。
Introduction
タンパク質生化学およびインビボでの結合活性のグローバル分析を実行する必要性は、タンパク質-タンパク質相互作用（のPPI）と全プロテオーム1,3-8の翻訳後修飾をプロファイリングするための新たな方法の開発をもたらしました。タンパク質マイクロアレイは、全長機能タンパク質4-6,8,9、または抗体10,11を含む分析タンパク質マイクロアレイを用いた機能性タンパク質マイクロアレイとして製造されています。これらは、12を解析幅広い生化学的に行うために必要な実験条件の多様を容易にするために、表面化学の様々な顕微鏡スライド上に配列されたタンパク質の高濃度を含むように操作されています。リジンを介して化学結合またはそのような他の13の中親和性結合のためのHisタグ付きタンパク質およびグルタチオンを取り付けるためのニッケルキレート化スライドのような親和性結合方法のためのニトロセルロースとアルデヒド表面化学。 </p>
タンパク質-タンパク質相互作用を検出するための機能的なタンパク質マイクロアレイの使用は、高品質な機能性タンパク質のライブラリ14へのアクセスを必要とする。S.セレビシエは、ハイスループットクロマトグラフィー精製技術とタンパク質構築物をタグ付けし、高コピー親和性の対形成により、このようなライブラリーを作製に適しています。酵母ゲノムの大部分が、配列決定されており、ほぼ全プロテオームの精製および生化学12を分析するための高コピープラスミドから発現させることができます。タンパク質が得られ、384ウェル形式に配列されると、それらは迅速なパラレルマルチパラメトリック生化学分析およびバイオインフォマティクス尋問8,14-16を可能に顕微鏡スライド上にプリントされています。タンパク質マイクロアレイは、タンパク質、脂質、小分子、および他の多くの用途の中で核酸と酵素アッセイと相互作用するために使用されています。プロテオームの表面上のタンパク質のアクセシビリティアレイは、免疫親和性などの分析的検出の異なるタイプにそれらを敏感に反応する表面プラズモン共鳴、蛍光、および多くの他の技術を表面。また、それは、生体内で行うのは難しいかもしれない実験条件の微調整を可能にします。
このプロトコルの目的は、タンパク質 – タンパク質相互作用を検出するために、機能性タンパク質マイクロアレイの適切な使用を実証することです。このアプリケーションは、目的の高度に精製された分析物（タンパク質）を用いてタンパク質結合活性のハイスループット並列生化学的解析を可能にします。 C末端（カルボキシ末端）は、関心のV5融合ベイトタンパク質は、タンパク質精製のために最適化された酵母株における高コピープラスミドから生成されるタグ付き。 C末端タグは、全長タンパク質が翻訳されていることを保証します。この研究で使用されるタンパク質は、His6Xタグを介して、ニッケル親和性樹脂を用いて精製するTda1-V5融合タンパク質キナーゼです。 Tda1-V5融合constructは、アッセイで使用するための最も高度に濃縮された画分を溶出するためにイミダゾール勾配を使用して、シリアル溶出により精製されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルは提示本来インビボ 1 で新しいキナーゼ相互作用ネットワークの識別をもたらす酵母プロテインキナーゼの異なるファミリーおよび関連にわたって結合活性を比較するために85のユニークな酵母タンパク質キナーゼ-V5融合タンパク質を用いて行きました。新興プロテオミクスプロファイリング技術として、高スループット（HTP）ペプチドライブラリー、および…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the NIH. The assays shown in Figure 1 was performed by Dr. Joseph Fasolo. We thank Dr. Rui Chen for helpful comments.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 mL) | |||
| Falcon tube (50 mL) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes(2ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1 X PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1 X PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl,500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | galactose should not be autoclaved |
References
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