Использование белковых микрочипов, содержащих почти всю С. Cerevisiae протеом зондируют для быстрого объективной допроса тысяч белок-белковых взаимодействий в параллель. Этот метод может быть использован для белка-малая молекула, посттрансляционной модификации, и других анализов в высокой пропускной.
Функциональный белок-микрочипов высокой плотности, содержащие ~ 4200 рекомбинантные белки дрожжей проверяются на киназы белок-белковых взаимодействий с использованием гибридного белка аффинной очистке дрожжи киназы, содержащий тег V5-эпитоп для считывания. Очищенный киназа получена через культуры штамма дрожжей, оптимизированной для производства белка с высоким копирования содержащего плазмиду, содержащую слитый киназы-V5 построить под GAL индуцируемого промотора. Дрожжи выращивали в средах с ограничительной нейтрального источника углерода в течение 6 ч, затем по индукции с 2% галактозы. Далее, культура собирают и киназы очищают с использованием стандартных аффинных хроматографических методов для получения высокоочищенного протеинкиназу для использования в анализе. Очищенный киназы разбавляют киназного буфера с соответствующим диапазоном для анализа и белковых чипов заблокированы до гибридизации с белком микрочипов. После гибридизации, массивы зондируют моноклональное V5 АнтибODY для идентификации белков, связанных с протеинкиназой V5. Наконец, массивы будут отсканированы с использованием стандартных микрочипов сканер, и данные извлекаются для анализа вниз по течению информатики 1,2, чтобы определить высокое доверие набор белковых взаимодействий для последующего утверждения в естественных условиях.
Необходимость проведения глобальных анализов биохимии белков и активность связывания в естественных условиях привело к разработке новых методов профилирования белок-белковых взаимодействий (ИЦП) и пост-трансляционные модификации целых протеомов 1,3-8. Белковые микрочипы изготавливаются в качестве функциональных белковых микрочипов с использованием полноформатных функциональные белки 4-6,8,9 или аналитических белковых микрочипов, содержащих антитела 10,11. Они разработаны, чтобы содержать высокой плотности белков, выстроенных на предметных стеклах с различными поверхностных химических для облегчения различных экспериментальных условиях, необходимых для проведения широкомасштабную биохимических анализов 12. Нитроцеллюлозы и альдегид поверхности химические для химической привязанности через лизина или крепления близость методов, таких как никель хелатных слайдов для крепления His-меченных белков и глутатиона для аффинной привязанности среди других 13. </p>
Использование функциональных белковых микрочипов для выявления белок-белковых взаимодействий требуется доступ к высококачественной библиотеки функционального белка 14. С. Cerevisiae поддается производить такой библиотеки через спаривания высокого сродства копирования меченый белок конструкции с высокой пропускной методов хроматографического очистки. Подавляющее большинство генома дрожжей было последовательности и почти вся протеом может быть выражена с высокой копирования плазмиды для очистки и биохимический анализы 12. После того, как белки получают и облеченные в формате 384-луночного, они напечатаны на предметное стекло микроскопа, позволяющего для быстрого параллельного многопараметрического биохимического анализа и биоинформатики допроса 8,14-16. Белковые микрочипы были использованы для ферментативных анализов и взаимодействий с белками, липидами, малых молекул, и нуклеиновых кислот среди многих других приложений. Доступность белков на поверхности протеомамассивы сделать их поддаются различным видам аналитического обнаружения в том числе, иммунных сродством, поверхностного плазмонного резонанса, флуоресценцию и многие другие методы. Кроме того, она позволяет точного контроля экспериментальных условиях, где он может быть трудно сделать в естественных условиях.
Цель этого протокола заключается в демонстрации соответствующего использования функциональных белковых микрочипов для выявления белок-белковых взаимодействий. Это приложение позволяет с высокой пропускной параллельный биохимический анализ белка связывания деятельности с использованием высокоочищенного анализируемого (белок) интересов. С-концевой (карбокси-терминал) помечены V5-фьюжн приманки интерес белок получают из высокого плазмидой в штамме дрожжей, оптимизированной для очистки белков. С-концевой пометки гарантирует, что белок полной длины была переведена. Белок, используемый в данном исследовании, Tda1-V5 слитый белок киназы, который очищают с помощью аффинной никель смолы с помощью тэга His6X. Tda1-V5 слияние строит очищали путем последовательного элюирования с использованием градиента имидазола для элюирования наиболее обогащенную фракцию для использования в анализе.
Протокол, представленные первоначально был выполнен с использованием 85 уникальных дрожжей белка белки киназы-V5 фьюжн сравнить активность связывания через отдельных и связанных семей дрожжи протеинкиназ в результате идентификации новых сетей киназы взаимодействия в естественных …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the NIH. The assays shown in Figure 1 was performed by Dr. Joseph Fasolo. We thank Dr. Rui Chen for helpful comments.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
Dextrose | Sigma | D9434 | |
Raffinose | Sigma | R0514 | |
Galactose | Sigma | G0750 | |
Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
Centrifuge JA-10 rotor | |||
Centrifuge tubes (500 mL) | |||
Falcon tube (50 mL) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
FastPrep Tubes(2ml screw cap tube) | |||
FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
Triton X100 | Sigma | P4417 | |
DTT | Sigma | D9779 | |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
NaCl | Sigma | S3014 | |
Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
PMSF | Sigma | 93482 | |
Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
ATP | Sigma | A1852 | |
Shaking Incubator (30 °C) | |||
Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
Nutator | VWR/Fisher | ||
SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1 X PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1 X PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl,500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | galactose should not be autoclaved |